„multiplex” PCR do wykrywania Staphylococcus aureus oraz jego

Ćwiczenie 1 Temat: Wykorzystanie techniki „multiplex” PCR do wykrywania Staphylococcus aureus oraz jego oporności na metycylinę Cel: 1. Wykrywanie gronkowca poprzez amplifikację fragmentu genu nuc kodującego nukleazę termostabilną gronkowców oraz fragmentu genu mecA kodującego białko PBP2’ nadającego oporność na metycylinę w układzie multiplex. Wstęp teoretyczny Staphylococcus aureus należy do Gram dodatnich ziarniaków z rodzaju Staphylococcus , należących do rodziny Micrococcaceae. Już w 1883 roku S. aureus został rozpoznany jako jeden z najczęściej izolowanych czynników etiologicznych zakażeń. Bakteria jest odpowiedzialna za ropne zakażenia skóry i tkanek podskórnych oraz zakażeń ran pooperacyjnych. Gronkowiec złocisty może wywoływać także zakażenia układowe i narządowe np. zapalenia płuc, opon mózgowo‐rdzeniowych, ropnie mózgu, zapalenie szpiku kostnego i kości, zakażenia układu moczowego, zapalenie mięśnia sercowego oraz zakażenia lub zatrucia związane z wytwarzaniem przez te bakterie określonych toksyn. U osób z obniżoną odpornością, u pacjentów leczonych z powodu innych chorób, a także po zabiegach chirurgicznych zakażenie gronkowcowe może przejść w postać uogólnionej posocznicy U gronkowców największe znaczenie z punktu widzenia klinicznego ma oporność na metycylinę. Wynika ona najczęściej z obecności genu mecA warunkującego syntezę nowego białka PBP (ang. Penicylin‐ Binding Protein), tzw. PBP2’ lub 2a. Białko to przejmuje funkcje inaktywowanych przez antybiotyki β ‐laktamowe białek PBP2 i PBP3 niezbędnych do prawidłowej syntezy mureiny ściany komórkowej. Nabywanie metycylinooporności przez szczepy gronkowca złocistego ma zatem związek z rozprzestrzenianiem się chromosomalnych kaset SCCmec (ang. Staphylococcal Chromosomal Cassette mec) zaliczanych do tzw. wysp genomowych . Uwzględniając liczbę komórek, w których geny oporności ulegają ekspresji w warunkach standardowych szczepy S. aureus można podzielić na homogenne i heterogenne. Homogenność szczepów opornych na metycylinę, tzw. MRSA ( Methicylin‐ Resistant Staphyloccocus aureus) oznacza, że wszystkie komórki bakterii produkują zmodyfikowane białko PBP 2’, które pozwala przeżyć im w stężeniach metycyliny rzędu 1600 μl/ml (IV klasa metycylinooporności, MIC> 400mg/l). Przez heterogenność szczepu rozumie się występowanie obok opornych kolonii, subpopulacji wrażliwych na antybiotyk. Takie kolnie bakterii wykazują obecność zmutowanego białka PBP 2’, lecz nie zachodzi u nich ekspresja oporności. MIC (ang. Mimimal Inhibitory Concentracion) metycyliny wynosi dla nich mniej niż 8 μl/ml, czyli podobnie jak dla szczepów MSSA (Methicylin‐ Sensitive Staphyloccocus aureus) . Materiały: Mikropipety, końcówki do mikropipet, probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml, probówki do PCR o pojemności 0,2 ml, termocykler, vortex, aparat do elektroforezy agarozowej, zimne bloki. Odczynniki: • woda jałowa podwójnie destylowana • bufor Shark do reakcji PCR ; 10 x stężony (firma:DNA‐Gdańsk) • MgCl2 [20 mM], • dNTP [8 mM] • 10 µM startery; nazwy i sekwencje poszczególnych starterów przedstawiono w Tabeli 1, Nazwa startera Sekwencja startera mec1 5’‐AAA ATCGATGGTAAAGGTTGGC mec2 5’‐AGTTCTGGCACTACCGGATTTGC nuc1 5’‐GCGATTGATGGTGATACGGTT nuc2 5’ ‐ 5‐AGCCAAGCCTTGAC GAACTAAAGC Tabela 1. Sekwencje starterów do wykrywania obecności genu nuc i mec. •
•
•
•
polimeraza Pwo Hypernova (2U/ µl) (firma: DNA Gdańsk) matryca ‐ genomowe DNA szczepów MSSA, MRSA (0,3‐300pg) agaroza bufor TAE Wykonanie: Detekcja oparta jest na amplifikacji fragmentów następujących genów: ‐ genu nuc kodującego nukleazę termostabilną gronkowców (obecny u wszystkich gronkowców Staphylococcus aureus). Wielkość amplikowanego fragmentu wynosi 280 par zasad. ‐ genu mecA kodującego białko PBP2’ nadającego oporność na metycylinę; wielkość amplifikowanego fragmentu wynosi 533 pary zasad. UWAGA!!! W bardzo nielicznych przypadkach gronkowce nie wykazują fenotypowej oporności na metycylinę pomimo występowania sekwencji genu mecA. 1. Przeprowadzić amplifikację fragmentu genu nuc i mecA w układzie „multipleks” PCR na genomowym DNA nieznanego szczepu bakteryjnego Staphylococcus. Porównując wyniki amplifikacji w stosunku do kontroli dodatnich MSSA K1+ i MRSA K2+ określić przynależność badanych szczepów do Staphylococcus i oznaczyć ich ewentualną metycylinooporność. 2. Przygotować 4 probówki o pojemności 0,2ml i opisać je symbolami wg tabeli 2, uwzględniając kontrole dodatnie K1+ S.aureus MSSA, K2+ S.aureus MRSA i kontrolę ujemną K‐ (kontrola na czystość odczynników (bez matrycy) na starterach nuc i mec . 3. W probówce 1,5 ml przygotować mieszaninę Master MIX na 5 objetości, zawierającą wszystkie składniki z wyjątkiem matrycy DNA, wymieszać i rozporcjować po 24µl. 4. Do próbki oznaczonej nr 1 dodać po 1µl genomowego DNA badanego szczepu, do probówki oznaczonej K1+ dodać genomowe DNA szczepu MSSA , do probówki oznaczonej K2+ dodać genomowe DNA szczepu MRSA, do kontroli ujemnej K‐ dodać 1µl wody. 5. Umieścić probówki w termocyklerze. Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z profilem temperaturowo – czasowym, przedstawionym w tabeli 2. 6. Produkty PCR rozdzielać w 1,5% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (0,5 mg/ml), w buforze 1xTAE przy napięciu ok. 7 V/cm długości żelu. Żel analizować w świetle UV. Wyniki i wnioski 1. Wklej i opisz zdjęcie przedstawiające elektroforetyczny rozdział produktów PCR, zaznacz marker wielkości DNA, próbę badaną, kontrole dodatnie oraz kontrolę ujemną. 2. Uzupełnij tabelę 3. Na podstawie uzyskanych wyników określ przynależność badanych szczepów do Staphylococcus oraz oporność na metycylinę. Tabela 2. Skład mieszaniny reakcyjnej i profil temperaturowo – czasowy reakcji PCR. Profil temperaturowo‐ czasowy Skład mieszaniny reakcyjnej Ilość [µl] Skład Temp [°C] Czas [s] Liczba cykli x1 MIX (x 5) Woda 13,2 10 x bufor Shark 2,5 95 300 MgCl2 [20 mM] 2,5 95 30 dNTPs [8 mM] 2,5 55 30 nuc1 [10µM] 1,0 72 30 nuc2 [10µM] 1,0 72 300 mecA1 [10µM] 1,0 4 ∞ mecA2 [10µM] 1,0 Polimeraza Pwo [2U/µl] 0,3 24 DNA 1,0 X 1,0 1,0 1,0 ‐ Woda X ‐ ‐ ‐ 1,0 Objętość całkowita 25 25 25 25 25 1 K1+ K2+ K‐ 24 24 24 30 Tabela 3. Wyniki identyfikacji gatunkowej oraz metycylinooporności za pomocą multiplex PCR Próba Obecność produktu Obecność produktu o długości 533pz o długości 280pz Wnioski 1 K1+ K2+ K‐