Ćwiczenie 2 - diagnostyka molekularna - Rainhardt

Ćwiczenie 2.doc
(47 KB) Pobierz
ĆWICZENIE 5
Diagnostyka molekularna zakażeń gronkowcowych
Badanie patogenezy chorób gronkowcowych stanowi ważną dziedzinę współczesnej
nauki, w której upatruje się szansę na znalezienie alternatywnej metody zwalczania
wielolekoopornych szczepów Staphylococcus aureus. Patogeneza chorób wywoływanych przez
S. aureus jak i stopień wirulencji gronkowca złocistego zależy w dużej mierze od funkcjonowania
jak i typu genu globalnej regulacji czynników wirulencji (gen agr). Stąd poznanie technik detekcji
tego genu i badanie jego polimorfizmu ma istotne znaczenie. Ponadto, dużym problemem
współczesnej medycyny jest badanie pokrewieństwa szczepów klinicznych odpowiedzialnych za
zakażenia szpitalne. Stąd celem niniejszego ćwiczenia jest również poznanie techniki losowej
amplifikacji polimorficznych fragmentów DNA (technika RAPD) stosowanej w ustalaniu
pokrewieństwa badanych szczepów. W tym ćwiczeniu badane szczepy Staphylococcus aureus
zostaną przeanalizowane pod kątem przynależności do jednej z czterech grup genu agr przy użyciu
techniki multiplex PCR (5 różnych primerów, jeden forward i cztery reverse). Przebadany zostanie
również polimorfizm genu agr drogą amplifikacji w reakcji PCR najbardziej polimorficznego
rejonu tego genu, a następnie trawienia produktu PCR odpowiednimi enzymami i analizy
produktów trawienia. Ostatnim etapem będzie oznaczenie struktury klonalej szczepów
Staphylococcus aureus przy użyciu techniki RAPD-PCR.
1) Izolacja DNA z bakterii
Jako metoda izolacji DNA genomowego z komórek S. aureus wykorzystany zostanie komercyjnie
dostępny zestaw GeneJET Genomic DNA purification kit (postępowanie zgodnie z instrukcją
załączoną w zestawie). Do dyspozycji studenci otrzymają hodowle nocne szczepów S. aureus
hodowane w pożywce BHI.
2) Oznaczanie grupy genu agr w szczepach Staphylococcus aureus (AGR program)
Przy zastosowaniu odpowiednich primerów w reakcji PCR (jeden primer forward i cztery
primery reverse charakterystyczne dla danej grupy genu agr) badane szczepy zostaną
przydzielone do jednej z czterech grup genu agr
Przygotować Master Mix – ostateczna objętość 25 ul:



10x Bufor (1x)
10 mM dNTPs (200 µM)
Mieszanina 5 primerów o stęż. 20 pmol/µl (30
pmol/reakcję)

1U/µl Polimeraza (1 U)

H2O
 Dodać 4 μl matrycowego DNA
 PCR – 30 cykli

Denaturacja 94°C 4 min

Denaturacja 94°C 30 sec

Hybrydyzacja 55°C 30 sec

Elongacja 72°C 1 min

Elongacja 72°C 5 min
3) Oznaczanie polimorfizmu genu agr w szczepach Staphylococcus aureus (agr pol
program)
Termocykler – Biometra Uno2
 Przygotować MasterMix – ostateczna objętość 25 μl



10x bufor (1x)
10 mM dNTPs (200 μM)
100 pmol/µl primery (2 primery, 40 pmol/reakcję
każego)

1U/µl polimeraza (EXTEND, 1 U)

H2O
 Dodać 4 μl matrycowego DNA
 PCR- 30 cykli

Denaturacja 94°C 4 min

Denaturacja 94°C 1 min

Hybrydyzacja 55°C 2 min


Elongacja 72°C 2 min
Końcowa Elongacja72°C 4 min
4) Oznaczanie struktury klonalnej szczepów Staphylococcus aureus metodą RAPDPCR
1. Przygotować MasterMix do rekacji PCR zgodnie z poniższym opisem
Ostateczna objętość 25 ul



10x Bufor (1x)
10 mM dNTPs (400 μM)
100 pmol/µl Primer AP-7 (50 pmol/reakcję)

1U/µl polimeraza (2 U)

H2O
 Dodać 4 μl matrycowego DNA
 Przygotowane próbki wstawić do termocyklera (30 cykli):

Denaturacja 94°C 4 min

Denaturatcja 94°C 1 min

Hybrydyzacja 25°C 1 min


Elongacja 74°C 2 min
Końcowa Elongacja72°C 7 min
1
Plik z chomika:
Rainhardt
Inne pliki z tego folderu:


11.pdf (837 KB)
 Cwiczenie 4.doc (31 KB)
 Edyta_Paczos-Grzęda.pdf (293 KB)
GeneJET genomic DNA purification kit (cw2).pdf (152 KB)
 Hubisz Marta_gr2.doc (315 KB)
Inne foldery tego chomika:
biochemia białek lab
diagnostyka w medycynie sądowej
 giełdy 2014 msu
molekularna diagnostyka wykłady
 seminarium



Zgłoś jeśli naruszono regulamin







Strona główna
Aktualności
Kontakt
Dla Mediów
Dział Pomocy
Opinie
Program partnerski




Regulamin serwisu
Polityka prywatności
Ochrona praw autorskich
Platforma wydawców
Copyright © 2012 Chomikuj.pl