molekularna i fenotypowa charakterystyka szczepów
advertisement
Mgr Aneta Frankowska-Maciejewska MOLEKULARNA I FENOTYPOWA CHARAKTERYSTYKA SZCZEPÓW STAPHYLOCOCCUS AUREUS WYIZOLOWANYCH OD KRÓW Z ZAPALENIEM GRUCZOŁU MLEKOWEGO STRESZCZENIE Przedmiotem badań były 123 szczepy S. aureus wyizolowane w latach 2007-2008 z mleka pochodzącego od krów ze stad hodowlanych w Polsce północno-wschodniej, u których stwierdzono podkliniczne zapalenie gruczołu mlekowego. Celem pracy była ocena występowania u tych szczepów wybranych czynników zjadliwości, ważnych w patogenezie mastitis takich, jak wytwarzanie enzymów proteolitycznych, lipolitycznych, hialuronidazy oraz zdolność tworzenia biofilmu. Oceniono także występowanie w genomach badanych szczepów S. aureus genów kodujących adhezyny, proteazy, toksyny oraz genów związanych z tworzeniem biofilmu. Ponadto szczepy S. aureus zostały przeanalizowane pod względem wrażliwości na wybrane antybiotyki i inne substancje o aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz pod względem zróżnicowania genetycznego. Przynależność do gatunku S. aureus potwierdzona została w oparciu o morfologię komórek, zdolność wytwarzania katalazy, sposób wzrostu izolatów na agarze odżywczym z dodatkiem 5% krwi baraniej i na podłożu Chapmana oraz na podstawie pozytywnego testu na obecność czynnika CF. Ostatecznie przynależność izolatów do gatunku S. aureus potwierdzono wykonując reakcję amplifikacji fragmentu genu nuc, kodującego termostabilną nukleazę, w której użyto starterów specyficznych dla zakonserwowanego fragmentu genu nuc, występującego u S. aureus. Zdolność tworzenia biofilmu przez szczepy S. aureus na powierzchni polistyrenowej oceniono stosując płytki titracyjne. Badanie wrażliwości szczepów na antybiotyki przeprowadzano metodą dyfuzyjno-krążkową, natomiast wytwarzanie βlaktamaz oceniano wykorzystując pałeczki z nitrocefiną. Obecność genów kodujących wybrane czynniki wirulencji (geny kodujące proteazy, adhezyny, toksyny, białka uczestniczące w tworzeniu biofilmu) oraz geny kodujące mechanizmy oporności S. aureus na antybiotyki β-laktamowe, wykrywano stosując technikę PCR. Dokonano również oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej lizostafiny, nizyny oraz polimyksyny B ustalając wartości MIC dla szczepów S. aureus, wykazujących oporność na co najmniej jeden badany antybiotyk. Typowanie molekularne szczepów S. aureus zostało przeprowadzone w oparciu o analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych amplifikowanego fragmentu genu coa (PCR/RFLP). Wszystkie oceniane szczepy S. aureus wytwarzały proteazy oraz powodowały hemolizę typu β. Większość szczepów wytwarzała fosfolipazy, natomiast ponad połowa szczepów S. aureus wytwarzała hialuronidazę. W grupie 123 szczepów S. aureus 61,8% tworzyło biofilm na powierzchni polistyrenowej. Stwierdzono, że nie wszystkie szczepy, u których wykryto geny operonu ica, kodujące białka związane z tworzeniem biofilmu, wytwarzały biofilm na powierzchni polistyrenowej. Wśród genów kodujących białka umożliwiające przyleganie S. aureus do macierzy zewnątrzkomórkowej, najczęściej identyfikowano gen eno (91,9%), kodujący białko wiążące lamininę oraz gen fib (82,9%), kodujący białko wiążące fibrynogen. Geny fnbA i fnbB kodujące adhezyny wiążące fibronektynę były obecne u 64,5% szczepów. Analiza klasterowa genów kodujących adhezyny wykazała, że geny fib, eno i fnbB należały do grupy genów często identyfikowanych w ocenianej populacji szczepów S. aureus, w odróżnieniu od genów cna, bbp, fnbA i ebps, które należały do grupy genów rzadko identyfikowanych. Na podstawie obecności w genomach ocenianych szczepów S. aureus genów kodujących białka adhezyjne zidentyfikowano 17 różnych genotypów. Najczęściej identyfikowaną grupą genów kodujących proteazy były geny kodujące proteazy serynowe, natomiast geny kodujące toksyny eksfoliatywne występowały rzadko u ocenianych szczepów S. aureus. Występowanie genów kodujących proteazy serynowe było podstawą do wyróżnienia 12 genotypów, z których 3 były najczęstsze. Geny kodujące enterotoksyny zidentyfikowano u 35,8% szczepów S. aureus. Geny sei (21,1%), sem (19,5%), sen (19,5%), seg (18,7%) i seo (13,8%) występowały częściej niż inne geny kodujące enterotoksyny i tworzyły jeden klaster genów. W oparciu o wyniki identyfikacji wybranych genów utworzono wirulotypy, które wystąpiły w badanej populacji szczepów S. aureus. Około 18% szczepów należało do wirulotypu zawierającego geny kodujące proteazy serynowe, tj. splA, splE i sspA oraz geny fib, eno i fnbB, kodujące adhezyny. W grupie ocenianych szczepów największą oporność zaobserwowano w przypadku antybiotyków β-laktamowych z grupy penicylin. Większość szczepów wykazujących oporność na tę grupę antybiotyków miało gen blaZ. Dwa szczepy S. aureus były wielooporne, z których jeden wykazywał oporność na antybiotyki należące do aminoglikozydów, linkozamidów oraz makrolidów, natomiast drugi był dodatkowo oporny na penicylinę. Szczepy S. aureus były wrażliwe na działanie lizostafiny, gdyż uzyskane wartości MIC w stosunku do badanych szczepów mieściły się w zakresie 0,008-0,5 μg/ml. Ponad połowa szczepów S. aureus była wrażliwa na nizynę, a uzyskane wartości MIC zawierały się w zakresie 12,8-25,6 μg/ml. W oparciu o analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych amplifikowanego fragmentu genu coa (PCR/RFLP) wśród szczepów S. aureus pochodzących od krów z objawami mastitis ze stad hodowlanych w Polsce północno-wschodniej wyodrębniono 11 różnych genotypów. Większość szczepów (ponad 67%) należała do jednego genotypu.
