Terapia genowa - Zakład Farmakologii Klinicznej

Terapia genowa
Autor: dr Artur Cieślewicz
Zakład Farmakologii Klinicznej
[email protected]
Definicja
Terapia genowa: Procedura medyczna, podczas której dzika wersja genu jest wprowadzana do
komórek pacjenta w celu wyleczenia choroby wywołanej przez zmutowany gen, kodującego
niefunkcjonalny produkt
Rodzaje terapii genowej
1. Terapia in vivo
a. Działanie bezpośrednio w organizmie pacjenta
b. Niezbędne metody precyzyjnego transportu terapeutycznych genów do określonych
komórek
2. Terapia ex vivo
a. Pobieramy populację komórek z organizmu pacjenta
b. Transformacja w warunkach laboratoryjnych
c. Zmodyfikowane komórki powracają do organizmu pacjenta
Wektory
•
•
Niewielkie cząsteczki DNA, umożliwiające wprowadzenie obcego DNA do komórki
Plazmidy, genomy wirusowe, sztuczne chromosomy
Wektory adenowirusowe
•
•
•
Oparte na ludzkim adenowirusie
Terapeutyczny gen wstawiany na miejsce genów wirusowych (zwykle E1-E3)
Tak przygotowany DNA – pakowany do kapsydu
Rodzaje wektorów adenowirusowych
•
•
•
1 generacja: delecje genów E1 i E3 (ograniczona replikacja)
2 generacja: delecja genu E4 (zredukowana odpowiedź immunologiczna)
3 generacja: usunięte geny wirusowe; silnie zredukowana odpowiedź immunologiczna
Zalety
•
•
•
•
Wysoka efektywność transdukcji
Pojemność” do 8 kbp
Infekuje komórki dzielące się i zróżnicowane
Wektor wyboru w terapii genowej niektórych nowotworów
Wady
•
•
•
Ekspresja ograniczona w czasie
Wczesne generacje: mogło dojść do ekspresji wirusowych białek
Skuteczność in vivo utrudniona przez odpowiedź immunologiczną
Pierwszy rekombinowany adenowirus dopuszczony do terapeutycznego stosowania: Onyx-15
(Oncorine):
•
•
Niemożność unieczynnienia białka p53 => namnażanie tylko w komórkach nowotworowych
Oncorine + 5FU + cisplatyna => lepsza odpowiedź na leczenie, mniejsze
prawdopodobieństwo progresji w porównaniu do samej chemioterapii
Wektory retrowirusowe
•
•
Bazują na genomie retrowirusa (RNA jako materiał genetyczny)
Terapeutyczny gen wstawiany na miejsce genów gag, pol, env
Zalety
•
•
•
•
Wysoka efektywność transdukcji
„Pojemność” do 8 kbp
Integracja z genomem gospodarza => stała ekspresja genu
Brak ekspresji białek wirusowych
Wady
•
•
•
Infekowanie tylko komórek dzielących się
Losowa integracja z genomem
Skuteczność in vivo utrudniona przez odpowiedź immunologiczną
Wektory niewirusowe
Liposomy
•
Fosfolipidowe pęcherzyki transportujące DNA
Sztuczne ludzkie chromosomy (HAC)
•
•
•
•
•
Tworzone na bazie chromosomów
Zawierają: centromer, miejsca inicjacji replikacji, telomery
Wiążą się z histonami; replikują, segregują poprawnie podczas kariokinezy
Brak ograniczeń co do długości genu jaki można umieścić w chromosomie
Kontrola ekspresji: elementy regulatorowe
Przykłady terapii genowej
Czerniak
•
•
•
terapia ex vivo
do pobranych limfocytów penetrujących guza wprowadzono gen kodujący TNF (Tumor
Necrosis Factor – czynnik martwicy nowotworu)
Zwiększona produkcja TNF zahamowała wzrost komórek raka
Choroba wieńcowa
•
•
Plazmidy z genem VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor – czynnik wzrostu śródbłonka
naczyniowego) wstrzyknięto bezpośrednio do mięśnia sercowego
Ekspresja VEGF – stymulacja tworzenia nowych naczyń krwionośnych
Zespół SCID
•
•
•
Pierwszy sukces terapii genowej (1990r.)
Przyczyna genetyczna: mutacja w genie ADA, prowadząca do niedoboru deaminazy
adenozyny
terapia ex vivo: pobrane limfocyty modyfikowano dzikim genem ADA
Mukowiscydoza
•
•
•
•
Przyczyna: mutacje w genie CFTR (Cystic Fibrosis Conductance Transmembrane Regulator) –
brak funkcjonalnych kanałów jonowych w przypadku homozygot recesywnych
Badania na kulturach tkankowych, wyprowadzonych z komórek płuc i trzustki pacjentów
chorych na mukowiscydozę: znaczące obniżenie zawartości Cl- po wprowadzeniu dzikiego
allela CFTR
Badanie kliniczne: terapia in vivo
o 140 pacjentów przyjmowało inhalację (1/miesiąc) placebo lub wektora
liposomowego z genem CFTR
o Znacząco wyższa nasilona pierwszosekundowa objętość wydechowa (FEV1) u
pacjentów poddanych terapii genowej
Lepszy wektor dla mukowsicydozy: F-HN SIV
o lentiwirus + białka kapsydu F i HN wirusa Sendai
Wrodzona ślepota Lebera
•
•
Stopniowa utrata wzroku (fotoreceptory przestają reagować na światło) powodowana
mutacją w genie RPE65 (enzym pełniący kluczową rolę w cyklu przemian retinolu)
Terapia genowa: psy, które odziedziczyły zmutowane allele RPE65
o Wstrzyknięcie wektora z dzikim genem RPE65 bezpośrednio do siatkówki psów
ślepych od urodzenia
o Po terapii psy zaczęły be trudności poruszać się po otoczeniu (omijanie przeszkód)
o odzyskanie wzroku potwierdzone rezonansem magnetycznym mózgu
Cukrzyca typu 1
•
•
•
Autoimmunologiczna: niszczenie komórek trzustki przez układ odpornościowy (przeciwciała)
=> brak insuliny
Badanie na myszach z cukrzycą streptozotocynową: wektory adenowirusowe z genami
o Ngn3 (neurogenina 3): czynnik transkrypcyjny niezbędny w rozwoju komórek
wydzielniczych trzustki
o Btc (betacellulina): czynnik wzrostu wysepek Langerhansa
Efekt terapii:
o Przywrócenie wydzielania insuliny stymulowanego glukozą oraz odwrócenie
hiperglikemii
o Normalizacja wydzielania glukozy przez wątrobę
o Odwrócenie ketonemii
o Przywrócenie normalnego poziomu glikogenu w wątrobie
o Przywrócenie normalnego poziomu transkryptów genów związanych z lipogenezą
Choroba Parkinsona
•
•
•
•
Choroba neurodegeneracyjna; przyczyna – spadek ilości dopaminy
Leczenie: uzupełnianie dopaminy (L-DOPA); z czasem traci skuteczność
Nadaktywne jądro niskowzgórzowe => obniżanie poziomu dopaminy
Pacjentom wstrzyknięto wektor z genem GAD (dekarboksylaza kwasu glutaminowego)
bezpośrednio do jądra niskowzgózowego
o Ekspresja GAD => produkcja neuroprzekaźnika GABA
o Inhibicja nadaktywnych nerwów w jądrze niskowzgórzowym
o Złagodzenie objawów choroby
Anemia sierpowata
•
•
I choroba genetyczna o scharakteryzowanym podłożu molekularnym (mutacja w genie βglobiny)
Terapia genowa korygująca chorobę u myszy
o wektor lentiwirusowy przeniósł dziki gen β-globiny do komórek krwiotwórczych
o Długotrwała ekspresja została osiągnięta u wszystkich zwierząt
o Niezmutowane białko stanowiło >50% całkowitej hemoglobiny i było obecne w 99%
krwinek
Terapia genowa w stomatologii
•
•
•
•
Odbudowa kości wokół implantów
badanie na szczurach: Do dużych ubytków kostnych w szczęce dostarczono wektory
adenowirusowe z BMP7 przy użyciu macierzy kolagenowej
BMP7 bierze udział w regulacji wzrostu i różnicowania komórek kości, rozwojy zębów,
procesach naprawczych przyzębia
Zwierzęta, które poddano terapii genowej produkowały 50% więcej kości wokół implantów
od zwierząt poddanych standardowemu leczeniu
Terapia genowa i alkoholizm
•
•
•
•
Dehydrogenaza aldehydowa: kluczowy enzym w metabolizowaniu etanolu
Mutacje obniżające aktywność enzymu: mniejsze o 2/3 ryzyko zapadnięcia na alkoholizm
Disulfiram: inhibitor dehydrogenazy aldehydowej; stosowany w leczeniu alkoholizmu
Terapia genowa: Antysensowny ssDNA komplementarny do mRNA ADH
o blokada translacji
o test na uzależnionych od alkoholu szczurach => 50% mniejsze spożycie alkoholu przez
> miesiąc po terapii
Wyciszanie genów
Interferencja RNA: naturalny proces polegający na degradacji lub zahamowaniu ekspresji
docelowego transkryptu przez specyficzne krótkie cząsteczki RNA (siRNA lub miRNA)
•
projektowanie siRNA w celu wyciszenia ekspresji szkodliwych genów
Projektowanie siRNA
•
•
długość zwykle 19-30 nt
transport do komórek
o „nagie cząsteczki” – niestabilne
o kompleksowanie z nośnikami
o wektory wirusowe
RNAi w leczeniu raka
Wyciszenie ekspresji VEGF
•
•
•
Zablokowanie angiogenezy w tkance nowotworowej
Odcięcie dopływu krwi
Zagłodzenie” nowotworu
Wyciszenie ekspresji PKN3 (kinaza białkowa N3)
•
Atu027
•
•
•
Inhibicja PKN3 zmniejsza przerzuty do węzłów chłonnych w raku prostaty
Zwierzęce modele raka płuc: zmniejszenie przerzutów w grupie zwierząt, której podano lek
Zwierzęce modele raka piersi: zapobiega przerzutom do płuc
Wyciszenie ekspresji tenascyny C (TN-C)
•
•
•
nadekspresja przyczynia się do adhezji, migracji, inwazyjności i proliferacji glejaka
„nagie” cząsteczki dsRNA, 160 pz wstrzyknięto bezpośrednio do naciekającej tkanki
nowotworowej podczas zabiegu chirurgicznego
Znaczące wydłużenie mediany czasu przeżycia pacjentów poddanych terapii w poróonaniu
do grupy kontrolnej (48,2 tygodnie vs 106,6 tygodni)
Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem
•
•
•
Uszkodzenie siatkówki (zwłaszcza plamki żółtej), prowadzące do pogorszenia wzroku
o przyczyna: neowaskularyzacja za siatkówką
RNAi w celu wyciszenia ekspresji VEGF
o Lek wstrzyknięty bezpośrednio do oka
o I faza badań klinicznych: 25% pacjentów – poprawa wzroku; stabilizacja u
pozostałych
Poprawa nie związana z wyciszeniem VEGF!!!
o Synteza interferonu γ i interleukiny 12 => Negatywna regulacja VEGF =>
Zahamowanie angiogenezy
Infekcje wirusowe
Wirus Ebola
•
•
siRNA przeciwku L-polimerazie, oraz wirusowym białkom VP24 i VP35
Zastosowanie leku uchroniło zwierzęta przed śmiercią
Wirus HIV
•
•
niezwykle wysokie tempo mutacji; zwiększenie skuteczności terapii => łączenie wielu metod
wyciszania wirusowych genów
o Lentiwirusy niosące shRNA przeciwko transkryptom genów tat (trans-aktywator
transkrypcji) i rev (regulator ekspresji białek wirusowych
o Dodatkowo inhibitory bazujące na RNA: wabik TAR RNA, rybozym typu hammerhead
przeciwko receptorowi CCR5
Badanie kliniczne I faza
o Zmodyfikowane komórki przyjęły się u wszystkich pacjentów w ciągu 11 dni
o Nie zaobserwowano związanych z leczeniem toksyczności
o Ekspresja shRNA i rybozymu – udokumentowana przez 24 miesiące obserwacji
Mukowiscydoza
•
•
VCP/p397: nadekspresja skutkuje niszczeniem kanałów CFTR
Badania na liniach komórkowych: wyciszenie VCP/p397 przywraca komórkom zdolność
transportowania jonów chlorkowych
Choroby metaboliczne
•
Obniżenie poziomu LDL: siRNA przeciwko APOB, PCSK9
o Badanie eksperymentalne na gryzoniach => znaczące obniżenie LDL
o Pierwsze badania na ludziach: siRNA przeciwko APOB jest dobrze tolerowany
Enzymatyczna terapia zastępcza
•
Jeżeli przyczyną choroby genetycznej jest brak określonego enzymu: podawanie pacjentom
oczyszczonego enzymu
o Nie leczy bezpośredniej przyczyny (mutacja w genie) => enzym musi być
przyjmowany przez całe życie
ETZ dla SCID
•
•
•
PEG-ADA (pegylowana deaminaza adenozyny): ADA powiązana z glikolem polietylenowym
Mniejsza śmiertelność i zachorowalność w porównaniu do pacjentów poddanych
przeszczepowi szpiku
Roczny koszt ~400 000$
ETZ dla choroby Gauchera
•
•
•
mutacja w genie GBA (beta-glukocerebrozydaza) => Glukocerebrozydy nie są degradowane w
lizosomach => gromadzenie w komórkach
12 pacjentów otrzymywało oczyszczony enzym pozyskany z tkanek łożyska => znacząca
poprawa w objawach choroby
Produkcja dużych ilości enzymu: klonowanie ludzkiego genu do komórek bakteryjnych