Mutacje w genie GJB2 kodującym koneksynę 26 u pacjentów z

Audio fonolo gia
Tom XX
2001
Jarosław
Walig óra 1,2,J, Małgorzata Mueller-Malesińska 1 ,
Magd alena Nowaki, Agnieszka PolIaki, Rafał Płoski4,
Lech KorniszewskiS, Agata Skórk a 5, Henry k Skarżyński l
I Instytut Fizjologii i Patologii Słuchu, Warszawa
2 II Katedra Pediatrii Klinika Patologii Noworod ka Akademia Medyczn
a, Warszawa
3 Studium Medycyny Molekularnej Stypendium Fundacji Kronenbe
rga
4 Międzyzakładowa Pracownia Genetyki Molekularnej Człowieka Akademi
a Medyczna, Warszawa
5 II Katedra Pediatrii Klinika Diabetologii i Wad Wrodzonych Akademi
a Medyczna, Warszawa
Muta cje w genie GJB2 kodującym koneksynę 26
u pacjentów z niedosłuchem
Mutations in GJB2 in patients with nonsyndromie hearing los s
Słowa
kluczowe: niedos łuch, genetyka, koneksyna 26.
Key words: hearing loss, genetics, connexin 26.
Streszczenie
Niedosłuch genetycznie uwarunkowany stanowi
60% wszystkich przypadków niedosłuchu.
W ostatnich latach odkryto wiele genów, których mutacje powoduj
ą niedosłuch. Najważniejszym
z niech jest gen GJB2 kodujący koneksynę 26, którego produkt wchodzi
w skład połączeń ścisłych
typu gap junction odpowiadających za redystrybucję potasu w narządzi
e Cortiego. W naszej pracy
wykazaliśmy wysoką częstosć mutacji 35delG
w genie GJB2 u pacjentów z niedosłuchem
izolowanym. W formie homozygotycznej występuje ona u 28% pacjentó
w. Badanie mutacji w genie
OJS2 jest niezwykle pomocne w procesie poradnictwa genetycznego
u osób z niedosłuchem.
Summa ry
Oenetically caused hearing loss accounts for 60% of a11 cases of hearing
loss. Recently many
genes which mutations induce hearing 105S have been discovered. Among
them the most important is
the 0182 gene cod ing connexin 26. Connexin 26 fonns part of gap junction
s, which are responsible
J. Waligóra, M. Mueller-Malesińska, M. Nowak, A. Pollak, R. Płoski i in.
178
for the potassium distribution in the organ of Corti. In our wark we have demonstrated a high fre-
quency of 35de!G mutation in GJB2 in patients with nonsyndromie hearing 10ss. Homozygotes for this
mutation were 28% of alI patients. The examination af mutations in GJB2 is extrernely helpful in
genetic counselling of persons with hearing loss.
Niedosłuch
jest naj częstszym defektem dotyczącym ludzkich zmysłów.
wszystkich przypadków niedosłuchu naj częstszy (sięgający 60%) jest
niedosłuch uwarunkowany genetycznie. Niedosłuch ten dzielony jest na niedosłuch
izolowany (stanowiący ok. 70%) oraz związany z zespołami genetycznymi (ok.
30%).W przypadkach niedosłuchu izolowanego najczęściej obserwuje się autosomalny recesywny typ dziedziczenia (ok. 85% przypadków). Niedosłuch autosomalny dominujący to ok. 15% przypadków, a sprzężony z chromosomem X obejmuje
1-3%. Dotychczas poznano już kilkanaście genów odpowiedzialnych za niedosłuch. Najlepiej poznanym jest gen GJB2, kodujący białko koneksynę 26. Mutacje
w tym genie odpowiedzialne są za najczęstszą postać niedosłuchu dziedziczonego
jako cecha autosomaIna recesywna, oznaczanego skrótem DFNBI [Kelsell (i in.)
1997]. Najczęstszą mutacją w genie GJB2 jest delecja guaniny w pozycji 35
[Denoyelle (i in.) 1997; Zelante (i in.) 1997]. Mutacja ta wprowadza przesunięcie
ramki odczytu, co powoduje utratę funkcji białka poprzez przedwczesną terminację
biosyntezy białka. Oprócz niedosłuchu dziedziczonego jako cecha autosomaIna
recesywna mutacje w genie GJB2 mogą być przyczyną niedosłuchu autosomalnego
dominującego DFNA3 oraz zespołu Vohwinkela (niedosłuch i zmiany skórne).
Koneksyna 26 jest składnikiem połączeń międzykomórkowych typu gap junclians. Poprzez połączenia te dochodzi do wymiany drobnocząsteczkowych substancji pomiędzy komórkami, bez ich kontaktu z substancjąpozakomórkową. Sześć
połączonych ze sobą koneksyn tworzy w błonie komórkowej konekson, natomiast
dwa koneksony zlokalizowane na sąsiadujących komórkach tworzą połączenie typu
gap junclian. Ekspresja genu GJB2 w ślimaku została zlokalizowana w komórkach
podporowych leżących u podstawy komórek włosowatych. W uchu koneksyna 26
odpowiedzialna jest za redystrybucję potasu z komórek włosowatych do komórek
stria vascularis.
Celem niniejszej pracy było ustalenie częstości mutacji w genie GJB2 u pacjentów z niedosłuchem izolowanym. Znajomość tego umożliwi lepsze sprecyzowanie
wskazań do badań molekularnych oraz ułatwi ich wybór u pacjentów z niedosłu­
chem genetycznie uwarunkowanym.
Spośród
I.
MATERIAŁ
I METODY
Badaniom poddano grupę 368 pacjentów z niedosłuchem izolowanym
pod opieką Poradni Genetycznej Instytutu Fizjologii i Patologii Słuchu.
będących
Mutacje w genie GJB2 kodującym koneksynę 26 u pacjentów z niedosłuchem
179
Pacjentów w pie~szym etapie badano pod kątem obecności mutacji 35de1G,
a następnIe probkl pobran? od pacjentów będących heterozygotami dla tej mutacji
poddano sekwencJonowanm fragmentu kodującego genu GJB2.
Test na delecję35delG w genie GJB2 przeprowadzony został zmodyfikowaną
meto?ą[Storm (I m.)1999]. Metoda ta polega na ukierunkowanej mutagenezie,
w k,t?reJ uczestnIczy reakcja PCR (PSMO). W objętości 20 el amplifikowana jest
częsc pIerwszego egzonu genu koneksyny 26 (odpowiadająca nukleotydom od 48
do 254 w cDNA). Jeden z primerów użytych do reakcji ma zmienionąjednązasadę
w stos~nku do komplementarnego odpowiednika w genie GJB2 (pozycja 236,
C zamIast A), dZIękI temu tworzone jest miejsce restrykcyjne dla enzymu BsiYI
(Boehrm~e~), p~d warunkiem jednak, że obecna jest delecja G w 35 pozycji.
W obJętoscl 10 el tra';lOne były 3 el produktu reakcji PCR, przy użyciu 2 jednostek e.nzymu restrykCyjnego BSIYI. Do mieszaniny, jako pozytywna kontrola traWlenra, dodawane były również 3 el produktu reakcji peR, odpowiadającego nukI~otydom ?d 330 do 482 cDNA genu GJB2, gdzie znajdują się dwa zachodzące na
SIebIe mIejsca cIęcIa dla enzymu BsiYI. Następnie 2 el, produktów trawienia poddawan~ były elektrofo;ezle w 6% denaturującym żelu poliakrylamidowym. W celu
WIzualizaCjI fragmentow DNA żel wybarwiany był srebrem przy użyciu zestawu
fin;ry Prome~a, zgodnIe z zaleceniami producenta. Przykłady otrzymanych rezultatow obraZUje ryc. I.
2
3
4
5
6
7
8
~yc. l. Przy~łady. wy~ików uzyska.~ych w badaniach mutacji 35delG w genie G182: rzędy 2-6:
probkl osób nIeposIadających m.~tacJI 35delG w genie GI82, rzędy l i 7: próbki osób heterozygotycznych pod względem mutaCJI, rząd 8: próbka homozygotyczna pod względem mutacji 35delG
, Sekwencj~nowanju poddano egzon kodujący genu GJB2. Używano 4 prim erow, 2 zlokalizowanych na ~ońcach egzonu oraz 2 wewnętrznych. Procedury
prowadzono według standardow zalecanych przez PE Biosystems. Przykładowe
WynIkI obraZUją ryc. 2 i 3.
.
Badania zatwierdzone zostały przez Komisję Etyczną.
J. Waligóra, M. Mueller-Malesińska, M. Nowak, A. Pollak, R. Płoski i in.
180
Mutacje w genie GJB2 kodującym koneksynę 26 u pacjentów z niedosłuchem
181
II. WYNIKI
I,
CAC
GC
T
G
CĄ
G
ClG
Zbadano 368 pacjentów z niedosłuchem izolowanym, wśród których 102 było
homozygotami pod względem mutacji 35de1G, 43 było heterozygotami, a u 218 nie
wykazano mutacji 35de1G. Następnie próbki od pacjentów heterozygotycznych
poddano sekwencjonowaniu egzonu kodującego genu GJB2. U 14 spośród 43 pacjentów wykazano inną mutację w drugim allelu genu GJB. Wszystkie znalezione
mutacje były dziedziczone jako cecha autosomaina recesywna. Mutację na drugim
allelu genu GJB2 wykryto u 14 osób. W 8 przypadkach była delecja 14 nukleotydów w pozycji 314, w 2 przypadkach delecjaAA w pozycji 333-334 i wreszcie po
jednym przypadku mutacji V371, 167delT i L90P.
GGGGG
I
III. OMÓWIENIE
I
Ryc. 2 Przykład prawidłowego wyniku sekwencjonowania genu GJB2
G
c
T
c
I 16 t . 1 INT2.lIbl
C
•
A
G
T
G
G
W badaniach przeprowadzonych u pacjentów z , niedosłuchem izolowanym
wykazano częstość homozygot pod względem mutacji 35delG w 28%, heterozygot
w 13%, natomiast pacjentów bez mutacji 35delG w 59%. W większości przypadków u pacjentów homozygotycznych niedosłuch głębokiego stopnia był wrodzony.
Zgodnie z badaniami częstości nosicielstwa mutacji 35delG w populacji polskiej
i wyliczoną częstością homozygot mutacja 35delG powinna odpowiadać za ok.
30% wrodzonego głębokiego niedosłuchu, co odpowiada uzyskanym przez nas wynikom [Mueller-Malesińska (i in.) 2001]. Wyniki nasze wskazują również, iż drugą
co do częstości mutacją w genie GJB2 jest mutacja 314de114, co jest zgodne z badaniami opublikowanymi przez innych badaczy [Wiszniewski (i in.) 2001].
Częstość mutacji w genie GJB2 jest inna w różnych populacjach. Mutacja
35delG jest naj częstsza w populacjach europejskich, szczególnie w krajach śród­
ziemnomorskich [Zelante (i in.) 1997]. Wśród Żydów aszkenazyjskich naj częstsza
jest mutacja 167de1T, a w populacjach azjatyckich 235delC [Storm (i in.) 1999].
W krajach sąsiadujących z Polską najczęstsza jest mutacja 35de1G. W Niemczech
wykazano, że jest ona przyczyną niedosłuchu izolowanego w ok. 22% przypadków
[Gabriel (i in.) 2001].
Na podstawie przedstawionych wyników można stwierdzić, iż mutacje w genie
GJB2 są bardzo ważną przyczyna powstawania niedosłuchu, a ich wykrywanie jest
niezmiernie istotne w procesie poradnictwa genetycznego w rodzinach z niedosłuchem.
Ryc .3. P rzykład wyniku sekwencJ'onowania genu GJB2. Podstawienie T-C w pozycji 269
w..
182
l. Waligóra, M.
Mueller-Malesińska,
Płoski
M. Nowak, A. POllak, R.
=1
i in.
Bibliografia
Denoyelle F., Weil D., Maw M. A., Wicox S. A., Lench N. l., Allen-Powell D. R., Osborn A. H., Dahl
H-H. M., Middleton A., Houseman M. J., Dode C., Marlin S., Boulila-EIGaieded A' Grali M.,
Ayadi H., BenArab S., Situon P., Lina-Granade G., Godet J., Mustapha M., Liselet J., EI-Zir E.
Aubois A, Joannard A. Levillers 1., Garabedian E-N., Mueller R., McKinlay Gardner R. J.,
Petit Ch. [1997J. Prelingual deafness: high prevalence of a 30delG mutation in the connexin 26
gene. "Hum. Mol. Genet." 6,12,2173-2177.
Gabriel H., Kupsch P., Sudendey l., Winterhager E., lahnke K., Lautermann l. [200IJ. Mutations in
the connexin 26/0J82 gene are the most com mon event in non-syndromie hearing lass among the
German population. "Hum. Mutat." 17(6),521-522.
Kelsell D., Dunlop l., Steven, H. P., Lench N. l., Liang l. N., Parry G., Mueller R. F., Leigh I. M.
[1997]. Connexin 26 mutations in hereditary nonsyndromie sensorineural deafness, "Nature" 387,
80-83.
Mueller-Malesińska M. , Nowak M., Skarżyński H., Płoski R' Waligóra J. Komiszewski L. [2001].
Epidemiology of 35delG mutation in GJB2 gene in a Polish population. "J. Audiolog. Med."
10(2), 136-141.
Miller S. A., Dykes D. D., Pole,ky H. F. [1988]. A simple salting out pracerdure for extracting DNA
from human nucleated cells. "Nucleie Aeids Res." 16, 1215.
Storm K. Willoex S., Flothmann K. Van Camp G. [1999]. Detennination ofthe earrier frequeney of
the eommon GJB2 (eonnexin 26) 35delG mutation in the Belgian population using an easy and
reliable screening method. "Hum. Mutat." 14 (3), 263-266.
Wiszniewski W., Sobieszczańska-Radoszewska L., Nowakowska-Szyrwińska E. Obersztyn E., Bal J.
[200ł]. High frequeney ofGJB2 gene mutations in Polish patients with prelingualnonsyndromic
deafness. "Genet. Test" 5(2), 147-148.
Zelante L., Gasparini P., Estivill X., Melchionda S., D'Agruma L., Govea N., Mila M., Delia Monica
M., Lutfi J., Shohat M., Mansfield E., Delgrasso K., Rappaport E., Surrey S., Fortina P. [l997J.
Connexin 26 mutations assoeiated with the most eommon or non-syndromie neurosensory autosomal recessive deafness (DFNBI) in Mediterraneans. "Hum. Mol. Genet." 6,1605-1609.
t
t
J
t
t
t
t
t
I
I
l
I
~