DRUK 10 - Sieklucka str. 103-113

Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 1, str. 103–113
PRACA ORYGINALNA – Original Article
MAŁGORZATA SIEKLUCKA1,2, AGNIESZKA BOJARSKA-JUNAK2,
AGATA SURDACKA2, IWONA HUS1, EWA WĄSIK-SZCZEPANEK1,
KAMILA MAZUREK3, JACEK ROLIŃSKI2, ANNA DMOSZYŃSKA1
Ekspresja białka Par-4 w limfocytach B chorych na przewlekłą
białaczkę limfocytową B-komórkową – doniesienie wstępne
Prostate apoptosis response - 4 (Par-4) protein expression
in B cells of chronic lymphocytic leukaemia patients – a pilot study
1
Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku UM w Lublinie
Katedra i Zakład Immunologii Klinicznej UM w Lublinie
3
Studenckie Koło Naukowe przy Klinice Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku UM w Lublinie
2
STRESZCZENIE
Gen PAR-4 zidentyfikowano podczas badania genów wykazujących zwiększoną ekspresję przy
indukcji apoptozy w komórkach raka prostaty. Następnie stwierdzono, Ŝe białko Par-4 wykazuje
ekspresję zarówno w limfocytach prawidłowych, jak i białaczkowych. Celem pracy była ocena
ekspresji białka Par-4 w limfocytach B u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową Bkomórkową oraz poszukiwanie zaleŜności pomiędzy ekspresją tego białka a ekspresją innych
białek regulujących proces apoptozy. Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białka
Par-4 a ekspresją białek BCL-2 oraz BAX. Badano takŜe zaleŜność pomiędzy ekspresją białka
Par-4 a wybranymi parametrami klinicznymi PBL-B: wykazano dodatnią korelację ze stęŜeniem
LDH i β2-mikroglobuliny oraz ujemną korelację ze stęŜeniem hemoglobiny. Stwierdzono równieŜ dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a odsetkiem komórek CD38+. U chorych o fenotypie CD38+ ekspresja białka Par-4 była istotnie większa w porównaniu z chorymi o
fenotypie CD38-. Wyniki te ponownie potwierdzają istnienie zaburzeń apoptozy w komórkach
PBL-B; ponadto wydają się potwierdzać znaczenie rokownicze ekspresji białka Par-4 u chorych
na PBL-B, jednak z uwagi na złoŜoność mechanizmów regulujących indukcję tej ścieŜki apoptozy konieczne są dalsze badania dotyczące tego zagadnienia.
SŁOWA KLUCZOWE: Par-4 – BCL-2 – BAX – CD38 – Apoptoza – Przewlekła białaczka limfocytowa
SUMMARY
Par-4 (prostate apoptosis response-4) protein was originally found upregulated in prostate tumour
cells undergoing apoptosis. It was further identified as a proapoptotic protein upregulated both in
normal and leukaemic lymphocytes. The aim of our study was the assessment of Par-4 protein
expression in B cells of B-CLL patients and the examination of its relationship with the expression of other proteins involved in apoptosis regulation. We found positive relationships between
Par-4 and both BCL-2 and BAX protein expression. The results of our research were also analysed in association with the principal B-CLL prognostic factors. There was a positive correlation
between the expression of Par-4 protein and the lactate dehydrogenase (LDH) and β2microglobulin serum concentrations (p<0.01 and p<0.05, respectively), and a negative correla-
104 M. SIEKLUCKA i wsp.
tion was found between Par-4 protein expression and haemoglobin level (p<0.01). The expression of Par-4 protein in B cells correlated positively with the percentage of CD38+ cells
(p<0.05), and it was higher in patients with CD38+ phenotype (p<0.05). Our results confirm
the significance of apoptosis deregulation in B-CLL and suggest a possible relationship between
Par-4 expression and the clinical course of the disease, which however needs further investigation.
KEY WORDS: Par-4 – BCL-2 – BAX – CD38 – Apoptosis – Chronic lymphocytic leukaemia
WSTĘP
Gen PAR-4 (prostate apoptosis response gene-4) jest genem proapoptotycznym zidentyfikowanym podczas badania genów wykazujących zwiększoną ekspresję przy
indukcji apoptozy w komórkach raka prostaty. Doświadczenia na liniach komórkowych raka prostaty, nerek czy czerniaka złośliwego wykazały, Ŝe nadekspresja Par-4
zwiększa wraŜliwość komórek na bodźce apoptotyczne, takie jak leki cytostatyczne,
czy promieniowanie UV. Białko Par-4 wykazuje ekspresję zarówno w limfocytach
prawidłowych (B i T), jak i białaczkowych [1]. Wykazano, Ŝe w komórkach limfoidalnych nadekspresja Par-4 prowadzi do obniŜenia ekspresji BCL-2 i rozszczepienia syntazy poli-ADP-rybozy (PARP) [2]. Ponadto Par-4 wpływa na translokację białek Fas i
FasL do błony komórkowej, indukując w ten sposób apoptozę drogą receptorową [3].
Według części badaczy, sama nadekspresja Par-4 jest czynnikiem niewystarczającym
do indukcji apoptozy, natomiast znacznie nasila apoptozę indukowaną lekami cytostatycznymi, powodując: zmniejszenie potencjału mitochondrialnego, aktywację kaspazy3 oraz zmniejszenie ekspresji genów z rodziny IAP (inhibitors of apoptosis), cIAP i
XIAP, których mechanizm działania polega na inaktywacji prokaspaz i kaspaz [2].
Jednak Gurumurthy i wsp. stwierdzili, Ŝe istnieje mechanizm prowadzący do niezaleŜnej od chemioterapii, aktywacji w komórkach nowotworowych (selektywnie) proapoptotycznej funkcji Par-4 za pośrednictwem kinazy białkowej A (PKA), której stęŜenie
jest zwiększone w większości komórek nowotworowych [3]. Innymi białkami, które
wchodzą w interakcję z Par-4, są białka proapoptotyczne: kinaza ZIP (ZIPK) oraz
Daxx (death-associated protein 6), które tworzą kompleks z Par-4, indukując w ten
sposób proces apoptozy [4].
Mechanizmy regulujące tą ścieŜkę apoptozy obejmują białka BCL-2 i p53. Działanie białek z rodziny BCL-2 jest regulowane przez gen supresorowy TP53, którego
mutacje stwierdza się u 10–15% pacjentów z PBL-B, zwłaszcza u chorych w zaawansowanym stadium choroby. Gen TP53, zwany „straŜnikiem genomu”, odgrywa istotną
rolę zarówno w regulacji cyklu komórkowego, jak i procesu apoptozy. Białko będące
jego produktem, po stwierdzeniu uszkodzenia DNA, bierze udział w blokowaniu cyklu
komórkowego w fazie G1 w celu dokonania reperacji DNA. Jednak jeŜeli naprawa
uszkodzeń jest niemoŜliwa, dochodzi do indukcji apoptozy. Mutacja genu TP53 jest
niepomyślnym prognostycznie czynnikiem u chorych na PBL-B [5]. UwaŜa się, Ŝe
białka z rodziny BCL-2 modulują wewnątrzpochodną drogę apoptozy przede wszystkim poprzez kontrolę uwalniania cytochromu c z mitochondriów, jednak istnieją takŜe
Ekspresja białka Par-4 w limfocytach B
105
doniesienia na temat bezpośredniego wpływu tych białek na kaspazy, np. przez mechanizm sekwestracji [6].
Badania nad Par-4 w PBL-B prowadzone są od niedawna i wciąŜ wiele kwestii pozostaje niejasnych. Wydaje się, Ŝe poznanie mechanizmów związanych z indukcją
apoptozy za pośrednictwem Par-4 i interakcji między nimi w komórkach PBL-B moŜe
mieć znaczenie rokownicze.
Celem pracy była ocena ekspresji białka Par-4 w komórkach CD19+ we krwi chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową B-komórkową oraz poszukiwanie ewentualnej zaleŜności pomiędzy ekspresją tego białka a ekspresją białek BCL-2 i BAX oraz
wybranymi parametrami klinicznymi PBL-B, a zwłaszcza takimi czynnikami prognostycznymi, jak stęŜenie LDH czy β2-mikroglobuliny oraz ekspresja antygenu CD38.
MATERIAŁ I METODY
Pacjenci. Badaniami objęto 35 chorych na PBL-B hospitalizowanych w Klinice
Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. Wiek
badanych chorych wahał się w granicach od 50 do 85 lat (średnia 64,4±8,7; mediana
63). W grupie badanej było 16 kobiet i 19 męŜczyzn. Rozpoznanie PBL-B ustalono w
oparciu o standardowe morfologiczne i immunofenotypowe kryteria opracowane przez
NCI-WG (National Cancer Institute-Working Group) [7]. Stadium zaawansowania
choroby określono na podstawie klasyfikacji Rai’a [8]: w grupie niskiego ryzyka (st. 0
wg Rai’a) znalazło się 10 chorych, w grupie pośredniego ryzyka (st. 1-2 wg Rai’a) –
20 chorych, zaś w grupie wysokiego ryzyka (st. 3–4 wg Rai’a) – 5 chorych.
Materiał do badań stanowiła krew obwodowa pobrana z Ŝyły odłokciowej. Krew
pobierano w ilości 10 ml do strzykawek zawierających heparynę (Polfa, Warszawa) w
stęŜeniu 20j/ml krwi – w celu izolacji komórek jednojądrzastych (w czasie nie dłuŜszym niŜ 1 godzina).
Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Krew heparynizowaną
rozcieńczano (w stosunku 1:1) 0,9% zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej –
PBS (Wytwórnia Surowic i Szczepionek, Lublin). Komórki jednojądrzaste izolowano
następnie poprzez wirowanie w gradiencie gęstości przy uŜyciu preparatu Gradisol L o
cięŜarze właściwym 1,077 g/ml (Aqua Medica, Łódź) przez 20 minut przy przyspieszeniu 700 × g. Uzyskane w ten sposób komórki płukano dwukrotnie w roztworze
PBS. Następnie oceniano liczbę komórek (w komorze Neubauera) oraz ich Ŝywotność
(barwienie błękitem trypanu – 0,4% Trypan Blue Solution, Sigma, Niemcy). śywotność poniŜej 90% stanowiła kryterium dyskwalifikujące prowadzenie dalszych badań.
Cytometria przepływowa. Podstawową techniką zastosowaną w przeprowadzonych badaniach była cytometria przepływowa. Wykorzystano cytometr przepływowy
FACSCalibur (Becton Dickinson, USA) wyposaŜony w laser argonowy o długości 488
nm. Do analizy wyników i ich graficznej prezentacji posłuŜył program komputerowy
CellQuest (Becton Dickinson). Na podstawie parametrów wielkości (forward scatter,
FSC) i ziarnistości komórki (side scatter, SSC) ustalano bramkę limfocytarną (region
R1 obejmujący limfocyty i niewielki odsetek erytrocytów), wyłączając z analizy m.in.
106 M. SIEKLUCKA i wsp.
komórki martwe. „Czystość” bramki limfocytarnej oceniano poprzez sprawdzenie
rozkładu komórek w układzie współrzędnych CD45/CD14.
Ocena markerów powierzchniowych badanych komórek. W celu oceny markerów powierzchniowych otrzymaną po izolacji zawiesinę komórek rozdzielano do poszczególnych probówek w ilości 1×106/próbkę i inkubowano z przeciwciałami monoklonalnymi sprzęŜonymi z fluorochromami (FITC, PE) zgodnie z zaleceniami producentów (zazwyczaj 5µl przeciwciała na próbkę, 20-minutowa inkubacja w temperaturze pokojowej). Do badań wykorzystano następujące przeciwciała monoklonalne: mouse IgG1 FITC / IgG2a, anty-CD45 FITC / CD14 PE, anty-CD3 FITC / CD19 PE, antyCD5 FITC / CD19 PE, anty-CD19 PE, anty-CD23 FITC, anty-CD38. Następnie komórki dwukrotnie płukano PBS (700xg, 5 minut) i niezwłocznie poddawano analizie
w cytometrze przepływowym.
Ocena ekspresji białek wewnątrzkomórkowych w limfocytach CD19+. W celu
oceny ekspresji: BCL-2, BAX i Par-4 w komórkach CD19+, po wyznakowaniu antygenów powierzchniowych (j.w.) komórki były utrwalane i permeabilizowane za pomocą zestawu IntraPrep Permeabilization Reagent (Immunotech, Francja), zgodnie z instrukcją producenta. Tak przygotowane komórki inkubowano z odpowiednim przeciwciałem monoklonalnym według zaleceń producenta, odpowiednio: anty-BCL-2 FITC
(Dako, Dania), anty-BAX FITC (Santa Cruz Biotechnology), anty-Par-4 (Santa Cruz
Biotechnology). NaleŜy dodać, Ŝe niesprzęŜone z fluorochromem przeciwciało antyPar-4 zostało poddane procedurze łączenia z Zenon Mouse IgG Labeling Kit. Następnie, po przepłukaniu, próbki oceniano w cytometrze przepływowym.
Statystyczne opracowanie wyników. Analizę statystyczną uzyskanych wyników
badań przeprowadzono przy pomocy programu Statistica 5.0. Z uwagi na fakt, Ŝe badane zmienne nie miały rozkładu normalnego, w analizie stosowano testy nieparametryczne: test U Manna-Whitney’a, test kolejności par Wilcoxona, test ANOVA rang
Kruskala-Wallisa, współczynnik korelacji Spearmana. Za znamienny statystycznie
uznano poziom istotności p≤0.05. Wyniki nieistotne statystycznie oznaczono skrótem
„NS”.
WYNIKI
ZaleŜność pomiędzy ekspresją Par-4 a wybranymi parametrami klinicznymi
PBL-B
Podczas analizy uzyskanych wyników stwierdzono ujemną korelację pomiędzy
ekspresją białka Par-4 a stęŜeniem hemoglobiny (R= –0,4; p<0,01). Stwierdzono takŜe
dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a stęŜeniem LDH (R= 0,4; p<0,01)
i β2-mikroglobuliny (R= 0,4; p<0,01). [Ryc. 1.]
Ekspresja białka Par-4 w limfocytach B
107
18,00
16,00
HGB
14,00
12,00
10,00
8,00
6,00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
50
60
70
80
50
60
70
80
Par-4 MFI
8,00
7,00
5,00
m2 B
B2M
6,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0
10
20
30
40
PAR4_MFI
Par-4 MFI
1000
900
800
600
LDH
LDH
700
500
400
300
200
0
10
20
30
40
PAR-4 MFI
Par-4 MFI
Ryc. 1. ZaleŜność pomiędzy ekspresją Par-4 a wybranymi parametrami klinicznymi PBL-B:
stęŜeniem hemoglobiny (R= -0,4; p<0,01), stęŜeniem β2-mikroglobuliny (R= 0,4; p<0,01) i LDH
(R= 0,4; p<0,01).
Fig. 1. The relationship between Par-4 expression and B-CLL clinical parameters:
haemoglobin level (R= -0,4; p<0,01), β2-microglobulin level (R= 0,4; p<0,01) and LDH level
(R= 0,4; p<0,01).
108 M. SIEKLUCKA i wsp.
ZaleŜność pomiędzy ekspresją białek Par-4 i BCL-2 w komórkach PBL-B
Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a ekspresją białka
BCL-2 (R= 0,5; p<0,001).
ZaleŜność pomiędzy ekspresją białek Par-4 i BAX w komórkach PBL-B
Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a ekspresją białka
BAX (R= 0,6; p<0,00001).
Ocena antygenu CD38 na limfocytach białaczkowych
Wobec potwierdzonej wartości rokowniczej antygenu CD38 u chorych na PBL-B
[9–11], badaną grupę podzielono na chorych CD38+ i CD38– [Tabela 1]. Ekspresję
CD38 określano jako dodatnią, w przypadkach, gdy występowała w ponad 20% komórek białaczkowych. Dodatnią ekspresję CD38 stwierdzono u 11 spośród 35 chorych
(31%), ujemną u 24 chorych (69%).
Tabela 1. Porównanie parametrów laboratoryjnych w grupach chorych na PBL-B z dodatnią i ujemną
ekspresją CD38
Table 1. The comparison of laboratory parameters in CD38+ and CD38- B-CLL patients
CD38+
CD38Wartość p
Parametr
(n=11)
(n=24)
(test U Manna-Whitney’a)
WBC (G/l)
średnia ± SD
mediana
51,86±32,89
43,90
33,26±26,62
22,30
0,02
LIMF(G/l)
średnia ± SD
mediana
42,19±27,95
33,70
26,83±22,55
18,00
0,04
HGB (g/dl)
średnia ± SD
mediana
12,44±1,66
12,60
13,69±1,48
13,50
0,03
PLT (G/l)
średnia ± SD
mediana
128,23±31,47
117,00
176,32±52,69
166,50
0,002
B2M (mg/l)
średnia ± SD
mediana
3,86±1,32
3,79
2,88±1,31
2,47
0,02
LDH (U/l)
średnia ± SD
mediana
437,42±182,76
362,50
360,73±70,65
348,00
0,3
BCL-2/ CD19
(MFI)
średnia ± SD
mediana
98,26±53,98
88,99
102,33±56,74
82,69
0,86
BAX/ CD19
(MFI)
średnia ± SD
mediana
28,36±15,86
21,57
23,74±18,39
18,48
0,166
BCL-2/ BAX
(CD19)
średnia ± SD
mediana
3,77±1,86
3,37
4,68±1,84
4,58
0,046
Par-4/ CD19
(MFI)
średnia ± SD
mediana
31,16±16,65
26,78
21,96±10,08
19,85
0,028
Ekspresja białka Par-4 w limfocytach B
109
ZaleŜność pomiędzy ekspresją białka Par-4 a odsetkiem komórek CD38+
Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a odsetkiem komórek CD38+ (R= 0,4; p<0,05) u chorych na PBL-B.
Ocena ekspresji białka Par-4 w limfocytach B chorych o fenotypie CD38+ i CD38U chorych o fenotypie CD38+ wykazano istotnie większą (p<0,05) ekspresję białka Par-4 (mediana MFI=26,8) w porównaniu z chorymi CD38- (mediana MFI=19,9).
[Ryc. 2.]
80
70
Par-4 MFI
60
50
40
30
20
10
0
CD38 -
CD38 +
Min-Maks.
25%-75%
Mediana
Ryc. 2. Ocena ekspresji białka Par-4 w limfocytach B chorych o fenotypie CD38- i CD38+ (p<0,05)
Fig. 2. Assessment of Par-4 protein expression in B cells of CD38- and CD38+ B-CLL patients (p<0,05)
Ocena ekspresji białka Par-4 w limfocytach B chorych w róŜnych stadiach zaawansowania choroby
U chorych w zaawansowanych stadiach (3–4 wg Rai’a) wykazano większą ekspresję białka Par-4 (mediana MFI=27) w porównaniu z chorymi we wcześniejszych stadiach (0–2 wg Rai’a) (mediana MFI=21,5). Jednak nie była to róŜnica istotna statystycznie.
DYSKUSJA
Biorąc pod uwagę istotną rolę przypisywaną ostatnio białku Par-4 w indukcji apoptozy wybiórczo w komórkach nowotworowych oraz znaczenie tego białka w apoptozie
indukowanej lekami, celowa wydaje się ocena jądrowej drogi apoptozy związanej
z Par-4 u chorych na PBL-B. We wstępnych badaniach własnych stwierdzono ujemną
110 M. SIEKLUCKA i wsp.
korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a stęŜeniem hemoglobiny oraz dodatnią
korelację pomiędzy ekspresją tego białka a stęŜeniem LDH i β2-mikroglobuliny. Ponadto u chorych o fenotypie CD38+ wykazano istotnie większą ekspresję białka Par-4
w porównaniu z chorymi o fenotypie CD38-. Odnotowano równieŜ, Ŝe u chorych
w stadiach 3–4 wg Rai’a ekspresja białka Par-4 była większa w porównaniu z chorymi
we wcześniejszych stadiach. Wyniki te wydają się potwierdzać znaczenie rokownicze
białka Par-4 u chorych na PBL-B, jednak z uwagi na złoŜoność mechanizmów regulujących indukcję tej ścieŜki apoptozy konieczne są dalsze badania dotyczące tego zagadnienia.
Znajdujący się na 12 chromosomie gen PAR-4 zidentyfikowano podczas badania
genów wykazujących zwiększoną ekspresję przy indukcji apoptozy w komórkach raka
prostaty. Kolejne badania wykazały, Ŝe zwiększenie ekspresji białka Par-4 zwiększa
wraŜliwość komórek raka prostaty na bodźce apoptotyczne przez obniŜenie ekspresji
białka BCL-2. RównieŜ w przypadku fibroblastów zmniejszenie ekspresji białka BCL2 spowodowane nadekspresją białka Par-4 prowadzi do zwiększenia podatności tych
komórek na bodźce apoptotyczne. Stwierdzono, Ŝe białko Par-4 wykazuje ekspresję
zarówno w limfocytach prawidłowych, jak i białaczkowych. W badaniu Boehrera i
wsp. przeprowadzonym m.in. u chorych na PBL-B we wszystkich przypadkach stwierdzono wysoką ekspresję białka Par-4, zaś w większości ekspresję mRNA dla Par-4 [1].
Jak wspomniano, mechanizmy regulujące indukcję apoptozy przy udziale Par-4
obejmują m.in. antyapoptotyczne białko BCL-2. Wiele badań próbowało zdefiniować
rolę białka BCL-2 w PBL-B, ale nie udało się określić jego roli jako czynnika prognostycznego. Jednak sugeruje się, Ŝe białko BCL-2 jest przynajmniej częściowo odpowiedzialne za oporność komórek PBL-B na bodźce proapoptotyczne [1]. UwaŜa się, Ŝe
białka z rodziny BCL-2 modulują wewnątrzpochodną drogę apoptozy przede wszystkim poprzez kontrolę uwalniania cytochromu c z mitochondriów, jednak istnieją takŜe
doniesienia na temat bezpośredniego wpływu tych białek na kaspazy, np. przez mechanizm sekwestracji [6]. Mimo licznych badań i powstających w ich wyniku róŜnych
teorii dotyczących mechanizmu działania białek z rodziny BCL-2, rola tych białek jest
niejasna. śadna z powstałych dotąd teorii nie wyjaśniła wszystkich szczegółów związanych z mechanizmem działania tych białek, co moŜe przemawiać za jego złoŜonością [12]. Pomimo przypisywaniu przez wielu autorów białkom z rodziny BCL-2 funkcji kontroli nad przepuszczalnością zewnętrznej błony mitochondrialnej (MOMP)
i procesem uwalniania cytochromu c z mitochondriów, istnieją doniesienia na temat
niezaleŜnego od tych białek uwalniania cytochromu c do cytoplazmy [13, 14].
U większości chorych na PBL-B stwierdza się wysoką ekspresję białka BCL-2, co
odkryto ponad 10 lat temu, jednak mechanizmy odpowiedzialne za taki stan rzeczy nie
zostały dotąd wyjaśnione. Opisywano np. hipometylację genu BCL-2, a takŜe translokacje chromosomowe [5, 15]. Koncepcja dotycząca roli białek z rodziny BCL-2 w
procesie apoptozy powstała po stwierdzeniu obniŜonej ekspresji białka BCL-2 w komórkach wchodzących w apoptozę in vitro. W PBL-B istotny jest przede wszystkim
stosunek BCL-2/BAX, który, jeśli jest podwyŜszony, często koreluje z agresywnym
przebiegiem choroby czy opornością na leczenie [5, 6]. Stosunek BCL-2/BAX jest
Ekspresja białka Par-4 w limfocytach B
111
większy u chorych na PBL-B w porównaniu z osobami zdrowymi, co moŜe przyczyniać się do „długowieczności” komórek PBL-B. Natomiast w badaniach własnych
stosunek BCL-2/BAX był znamiennie większy u chorych o fenotypie CD38– – analogicznie do mniejszej ekspresji białka Par-4 u tych chorych – w porównaniu z chorymi
o fenotypie CD38+. Wyniki te pozostają w zgodzie z wynikami naszych wcześniejszych badań, w których stwierdzono większy odsetek komórek apoptotycznych ex vivo
u chorych w późnych stadiach zaawansowania klinicznego wg Rai’a w porównaniu do
odsetka tych komórek u chorych w stadiach wcześniejszych [16]. Jednak w świetle
nowych doniesień sugerujących, Ŝe oprócz „długowiecznych” komórek z zaburzeniami
apoptozy obecnych we krwi obwodowej, pulę krąŜących limfocytów PBL-B mogą
uzupełniać komórki proliferujące pochodzące z takich narządów jak np. szpik kostny,
węzły chłonne czy śledziona [17], konieczne jest kontynuowanie badań nad tym zagadnieniem.
Nie wszystkie doniesienia potwierdzają związek białek BCL-2 czy BAX z przebiegiem PBL-B, wskazując na wielopłaszczyznowość zaburzeń apoptozy w tej chorobie
[18]. Przykład stanowią badania przeprowadzone przez Molicę i wsp., którzy nie
stwierdzili korelacji pomiędzy ekspresją BCL-2 a obrazem klinicznym PBL-B w chwili rozpoznania, czy odpowiedzią na leczenie [19]. Chandra i wsp. badali podatność
komórek linii CCRF-CEM na 2-CdA, oceniając m.in. ekspresję białek z rodziny BCL2. Nie stwierdzili oni róŜnicy w ekspresji antyapoptotycznych białek BCL-2 i BCL-xL
pomiędzy liniami podatnymi i opornymi na 2-CdA, natomiast komórki linii opornych
wykazywały zwiększoną ekspresję proapoptotycznego białka BAX [20]. Bosanquet i
wsp. oceniali związek pomiędzy ekspresją białek BAX i BCL-2 a podatnością komórek PBL-B (ex vivo) na apoptozę pod wpływem leków wchodzących w skład najczęstszych schematów chemioterapeutycznych. Okazało się, Ŝe obniŜona ekspresja białka
BAX korelowała z opornością na leki, takie jak antracykliny, środki alkilujące i winkrystyna, nie stwierdzono natomiast takiej zaleŜności w przypadku analogów puryn
czy kortykosteroidów. Ekspresja białka BCL-2 nie korelowała z podatnością na Ŝaden
z badanych leków. Ponadto nie wykryto zaleŜności pomiędzy ekspresją białek BAX i
BCL-2 a czasem przeŜycia [21].
U poszczególnych chorych ekspresja białek z rodziny BCL-2 jest róŜna, nie odnotowano jednak związku ze stadium zaawansowania klinicznego PBL-B [6, 22]. W badaniach własnych takŜe nie zaobserwowano związku pomiędzy ekspresją tych białek a
stadium zaawansowania klinicznego PBL-B wg Rai’a.
Ostatnio sugerowano, Ŝe nadekspresja BCL-2 w komórkach nowotworowych moŜe
być odpowiedzią na sygnały śmierci nieustannie wzbudzane w tych komórkach w
związku z ich charakterystycznymi cechami fenotypowymi, takimi jak niestabilność
genomu czy aktywacja onkogenów. Powoduje to ciągłe zapotrzebowanie na antyapoptotyczną funkcję białka BCL-2 i istnienie znikomej „rezerwy” tej funkcji. Paradoksalnie, skutkiem tego moŜe być indukcja apoptozy w komórkach z nadekspesją białka
BCL-2 [23].
Wykazano, Ŝe w komórkach limfoidalnych nadekspresja białka Par-4 prowadzi do
obniŜenia ekspresji białka BCL-2, ale nie powoduje zmniejszenia ekspresji białka
112 M. SIEKLUCKA i wsp.
BAX. Natomiast u chorych na PBL-B nie stwierdzono zaleŜności pomiędzy ekspresją
białek Par-4 i BCL-2 [1]. W badaniach własnych stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy ekspresją białka Par-4 a ekspresją białek BCL-2 oraz BAX, co – wobec przytoczonej wyŜej literatury – potwierdza istnienie nieprawidłowości dotyczących mechanizmów regulacji procesu apoptozy u chorych na PBL-B. Dalsze badania obejmujące
mechanizmy związane z indukcją apoptozy za pośrednictwem Par-4 pozwolą na poszerzenie wiedzy na temat biologii PBL-B oraz związku procesu apoptozy z przebiegiem
choroby.
Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach 2008–2010 jako
projekt badawczy nr N N402 084234.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Boehrer S, Chow KU, Puccetti E, Ruthardt M, Godzisard S, Krapohl A, Schneider B, Hoelzer D,
Mitrou PS, Rangnekar VM, Weidmann E. Deregulated expression of prostate apoptosis response
gene-4 in less differentiated lymphocytes and inverse expressional patterns of par-4 and bcl-2 in acute
lymphocytic leukemia. Hematol J, 2001; 2: 103-107.
Boehrer S, Chow KU, Beske F, Kukoc-Zivojnov N, Puccetti E, Ruthardt M, Baum C, Rangnekar
VM, Hoelzer D, Mitrou PS, Weidmann E. In lymphatic cells par-4 sensitizes to apoptosis by downregulating bcl-2 and promoting disruption of mitochondrial membrane potential and caspase activation. Cancer Res, 2002; 62: 1768-1775.
Gurumurthy S, Goswami A, Vasudevan KM, Rangnekar VM. Phosphorylation of Par-4 by protein
kinase A is critical for apoptosis. Mol Cell Biol, 2005; 25: 1146-1161.
Kawai T, Akira S, Reed JC. ZIP kinase triggers apoptosis from nuclear PML oncogenic domains.
Mol Cell Biol 2003; 23: 6174-6186.
Kolb J-P, Kern C, Quiney C, Roman V, Billard C. Re-establishment of a normal apoptotic process as
therapeutic approach in B-CLL. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol. Disord, 2003; 3: 261-286.
Packham G, Stevenson FK. Bodyguards and assassins: Bcl-2 family proteins and apoptosis control in
chronic lymphocytic leukaemia. Immunology, 2005; 114: 441-449.
Cheson BD, Bennett JM, Grever M, Kay N, Keating MJ, O'Brien S, Rai KR. National Cancer Institute-sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for
diagnosis and treatment. Blood. 1996; 87: 4990-4997
Rai KR, Sawitzky A, Cronkite EP, Chanana AD, Levy RN, Pasternack BS. Clinical staging of
chronic lymphocytic leukemia. Blood 1975; 46: 219-34
Gentile M, Mauro FR, Calabrese E, De Propris MS, Giammartini E, Mancini F, Milani ML, Guarini
A, Foà R. The prognostic value of CD38 expression in chronic lymphocytic leukaemia patients studied prospectively at diagnosis: a single institute experience. Br J Haematol. 2005; 130: 549-557.
Hus I, Podhorecka M, Bojarska-Junak A, Rolinski J, Schmitt M, Sieklucka M, Wasik-Szczepanek E,
Dmoszynska A. The clinical significance of ZAP-70 and CD38 expression in B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Ann Oncol. 2006; 17: 683-690
Ibrahim S, Keating M, Do KA, O’Brien S, Huh YO, Jilani I, Lerner S, Kantarjian HM, Albitar M.
CD38 expression as an important prognostic factor in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood
2001; 98: 181-186
Armstrong JS. Mitochondria: a target for cancer therapy. Br J Pharmacol, 2006; 147: 239-248.
Bouchier-Hayes L, Lartigue L, Newmeyer DD. Mitochondria: pharmacological manipulation of cell
death. J Clin Invest, 2005; 115: 2640-2647.
Ekspresja białka Par-4 w limfocytach B
113
14. Green DR, Kroemer G. Pharmacological manipulation of cell death: clinical applications in sight?
J Clin Invest, 2005; 115: 2610-2617.
15. Thomas A, Pepper C, Hoy T, Bentley P. Bcl-2 and Bax expression and chlorambucil-induced apoptosis in the T-cells and leukaemic B-cells of untreated B-cell chronic lymphocytic leukaemia patients.
Leuk Res, 2000; 24: 813-821.
16. Sieklucka M, Pozarowski P, Bojarska-Junak A, Hus I, Dmoszynska A, Rolinski J. Apoptosis in BCLL: the relationship between higher ex vivo spontaneous apoptosis before treatment in III-IV Rai
stage patients and poor outcome. Oncol Rep. 2008; 19: 1611-1620.
17. Messmer BT, Messmer D, Allen SL, Kolitz JE, Kudalkar P, Cesar D, Murphy EJ, Koduru P, Ferrarini
M, Zupo S, Cutrona G, Damle RN, Wasil T, Rai KR, Hellerstein MK, Chiorazzi N. In vivo measurements document the dynamic cellular kinetics of chronic lymphocytic leukemia B cells. J Clin Invest.
2005; 115: 755-764.
18. Reed JC, Kitada S. Apoptosis disregulation in chronic lymphocytic leukemia. W: Chronic lymphoid
leukemias. Red.: Cheson BD. Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork 2001, 111-126.
19. Molica S, Mannella A, Dattilo A, Levato D, Iuliano F, Peta A, Consarino C, Magro S. Differential
expression of BCL-2 oncoprotein and Fas antigen on normal peripheral blood and leukemic bone
marrow cells. A flow cytometric analysis. Haematologica; 1996; 81: 302-309.
20. Chandra J, Mansson E, Gogvadze V, Kaufmann SH, Albertioni F, Orrenius S. Resistance of leukemic
cells to 2-chlorodeoxyadenosine is due to a lack of calcium-dependent cytochrome c release. Blood,
2002; 99: 655-663.
21. Bosanquet AG, Sturm I, Wieder T, Essmann F, Bosanquet MI, Head DJ, Dörken B, Daniel PT. Bax
expression correlates with cellular drug sensitivity to doxorubicin, cyclophosphamide and chlorambucil but not fludarabine, cladribine or corticosteroids in B cell chronic lymphocytic leukemia. Leukemia, 2002; 16: 1035-1044.
22. Kitada S, Andersen J, Akar S, Zapata JM, Takayama S, Krajewski S, Wang H-G, Zhang X, Bullrich
F, Croce CM, Rai K, Hines J, Reed JC. Expression of apoptosis-regulating proteins in chronic lymphocytic leukemia: correlations with in vitro and in vivo chemoresponses. Blood, 1998; 91: 33793389.
23. Del Gaizo Moore V, Brown JR, Certo M, Love TM, Novina CD, Letai A. Chronic lymphocytic
leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT737. J Clin Invest. 2007; 117: 112-121.
Praca wpłynęła do Redakcji 05.08.2008 r. i została zakwalifikowana do druku 16.11.2008 r.
Adres do korespondencji:
Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku UM w Lublinie
ul. Staszica 11
20-081 Lublin