Polipeptyd, sekwencje DNA, wektor, szczep, sposób wytwarzania

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)190709
(13) B1
(21 ) Numer zgłoszenia:
329218
(22) Data zgłoszenia:
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
01 .04.1997
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
01.04.1997, PCT/IL97/00117
(87) Data i numer publikacji zgłoszenia
międzynarodowego:
09.10.1997, W097/37016,
PCT Gazette nr 43/97
(51) IntCl7:
C12N 15/12
C12N 15/54
C07K 16/18
C12N 5/10
C12N 9/12
A61K 48/00
)Polipeptyd, sekwencje DNA, wektor, szczep, sposób wytwarzania białka, przeciwciała
4
(5
albo ich aktywne fragmenty albo pochodne, zastosowania polipeptydu, cząsteczki DNA
i wektora, sposób izolowania i identyfikacji polipeptydu, kompozycje farmaceutyczne,
sposoby poszukiwania ligandu i sekwencji DNA, sposoby identyfikacji i wytwarzania
ligandu i cząsteczki
(73)
(30)
Pierwszeństwo:
02.04.1996,IL,117800
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
15.03.1999 BUP 06/99
(45)
PL 190709
B1
(57)
O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.12.2005 WUP 12/05
Uprawniony z patentu:
YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT
CO. LTD., Rehovot, IL
(72) Twórcy wynalazku:
David Wallach, Rehovot, IL
Nikolai Malinin, Rehovot, IL
Mark Boldin, Rehovot, IL
Andrei Kovalenko, Rehovot, IL
Igor Mett, Rehovot, IL
(74)
Pełnomocnik:
Kossowska Janina, PATPOL Sp. z o.o.
(57)1. Polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, obejmujący:
a) sekwencję aminokwasową z ID.SEKW.NR: 7 (NIK);
b) sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji
aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten
wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo
d) pochodne a), b) lub c) wiążące się z TRAF2 i modulujące aktywność NF-KB.
13. Sposób wytwarzania białka wiążącego się z TRAF, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej, znamienny tym, że obejmuje hodowanie szczepu komórek gospodarza w warunkach odpowiednich
do ekspresji białka, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej; przeprowadzanie modyfikacji potranslacyjnych, jeżeli to konieczne, w celu otrzymania białka, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej; izolowanie wyrażanego białka, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej, przy czym
szczep komórek gospodarza jest szczepem transformowanych eukariotycznych lub...
14. Przeciwciało albo jego aktywny fragment albo pochodna, swoiste wobec polipeptydu, który wiąże się
z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, przy czym polipeptyd ten obejmuje:
a) sekwencję aminokwasową z ID. SEKW. NR: 7 (NIK);
b) sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB...
16. Zastosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 1 albo sekwencji DNA określonej w zastrz. 5 albo wektora zdolnego do ekspresji w komórkach określonego w zastrz. 9, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do modulowania aktywności NF-KB albo pośredniczenia w działaniu NF-KB w komórkach albo
jakichkolwiek innych wewnątrzkomórkowych aktywności sygnalizacyjnych modulowanych albo zachodzących za pośrednictwem TRAF2, przy czym kompozycja ta jest przeznaczona do wprowadzania do komórek.
2
190 709
Polipeptyd, sekwencje DNA, wektor, szczep, sposób wytwarzania białka,
przeciwciała albo ich aktywne fragmenty albo pochodne, zastosowania
polipeptydu, cząsteczki DNA i wektora, sposób izolowania i identyfikacji
polipeptydu, kompozycje farmaceutyczne, sposoby poszukiwania ligandu
i sekwencji DNA, sposoby identyfikacji i wytwarzania ligandu i cząsteczki
Zastrzeżenia
patentowe
1. Polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, obejmujący:
a) sekwencję am inokw asow ąz ID.SEKW.NR: 7 (NIK);
b) sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2
i moduluje aktywność NF-KB;
c) sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian
w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo
d) pochodne a), b) lub c) wiążące się z TRAF2 i modulujące aktywność NF-KB.
2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest sekwencją kodowaną przez sekwencję nukleotydową ED. SEKW.NR: 3 (klon 10).
3. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest NIK (ED. SEKW. NR: 7).
4. Polipeptyd według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera co najmniej część sekwencji aminokwasowej z ED. SEKW.NR: 7.
5. Sekwencja DNA kodująca polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, wybrana z grupy składającej się z:
a) sekwencji cDNA obejmującej sekwencję nukleotydową ED.SEKW.NR: 3;
b) fragmentu sekwencji z a), kodującego polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) sekwencji DNA zdolnej do hybrydyzacji z sekwencjami a)-b) w umiarkowanie
ostrych warunkach, kodującej polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność
NF-KB.
6 . Sekwencja DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową z ID. SEKW.NR: 3.
7. Sekwencja DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą białko NIK o sekwencji aminokwasowej z ED. SEKW.NR: 7.
8 . Sekwencja DNA zdolna do hybrydyzacji w umiarkowanie ostrych warunkach z sekwencją kodującą polipeptyd wybrany z grupy obejmującej:
a) polipeptyd zawierający sekwencję am inokwasowąz ID. SEKW.NR: 7 (NIK);
b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą
nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana
jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje
aktywność NF-KB; albo
d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB.
9. Wektor obejmujący sekwencję DNA kodującą polipeptyd, który wiąże się z TRAF2
i moduluje aktywność NF-KB, przy czym sekwencja DNA jest wybrana z grupy składającej się z:
a) sekwencji cDNA obejmującej sekwencję nukleotydową ID.SEKW.NR: 3;
b) fragmentu sekwencji z a), kodującego polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) sekwencji DNA zdolnej do hybrydyzacji z sekwencjami a)-b) w umiarkowanie
ostrych warunkach, kodującej polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność
NF-KB.
190 709
3
10. Wektor według zastrz. 9, znamienny tym, że może ulegać ekspresji w eukariotycznej komórce gospodarza.
11. Wektor według zastrz. 9, znamienny tym, że może ulegać ekspresji w prokariotycznej komórce gospodarza.
12. Szczep transformowanych eukarietycznych lub prokariotycznych komórek gospodarza zawierający wektor obejmujący sekwencję DNA kodującą polipeptyd, który wiąże się
zTR A F2 i moduluje aktywność NF-KB, przy czym sekwencja DNA jest wybrana z grupy
składającej się z:
a) sekwencji cDNA obejmującej sekwencję nukleotydowąlD.SEKW .NR: 3;
b) fragmentu sekwencji z a) kodującego polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) sekwencji DNA zdolnej do hybrydyzacji z sekwencjami a)-b) w umiarkowanie
ostrych warunkach, kodującej polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność
NF-KB.
13. Sposób wytwarzania białka wiążącego się z TRAF, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej, znamienny tym, że obejmuje hodowanie szczepu komórek gospodarza
w warunkach odpowiednich do ekspresji białka, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej; przeprowadzanie modyfikacji potranslacyjnych, jeżeli to konieczne, w celu otrzymania białka, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej; izolowanie wyrażanego białka,
jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej, przy czym szczep komórek gospodarza
jest szczepem transformowanych eukariotycznych lub prokariotycznych komórek gospodarza
zawierających wektor obejmujący sekwencję DNA kodującą polipeptyd, który wiąże się
z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, przy czym sekwencja DNA jest wybrana z grupy
składającej się z:
a) sekwencji cDNA obejmującej sekwencję nukleotydowąlD.SEKW .NR: 3;
b) fragmentu sekwencji z a), kodującego polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) sekwencji DNA zdolnej do hybrydyzacji z sekwencjami a)-b) w umiarkowanie
ostrych warunkach, kodującej polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność
NF-KB.
14. Przeciwciało albo jego aktywny fragment albo pochodna, swoiste wobec polipeptydu,
który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, przy czym polipeptyd ten obejmuje:
a) sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);
b) sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2
i moduluje aktywność NF-KB;
c) sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć
zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją
lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo
d) pochodne a), b) lub c) wiążące się z TRAF2 i modulujące aktywność NF-KB.
15. Przeciwciało lub jego aktywny fragment lub pochodna swoiste wobec polipeptydu
będącego polipeptydem NIK (ID.SEKW.NR: 7).
16. Zastosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 1 albo sekwencji DNA określonej
w zastrz. 5 albo wektora zdolnego do ekspresji w komórkach określonego w zastrz. 9, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do modulowania aktywności NF-KB albo pośredniczenia w działaniu NF-KB w komórkach albo jakichkolwiek innych wewnątrzkomórkowych
aktywności sygnalizacyjnych modulowanych albo zachodzących za pośrednictwem TRAF2,
przy czym kompozycja ta jest przeznaczona do wprowadzania do komórek.
17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że wektor jest rekombinowanym
zwierzęcym wektorem wirusowym, obejmującym dodatkowo sekwencję kodującą powierzchniowe białko wirusowe (ligand), które ma zdolność wiązania się ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórek, do których ma być wprowadzana kompozycja farmaceutyczna.
18. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że polipeptydem jest NIK albo
przynajmniej jedna z izoform, analogów, fragmentów albo pochodnych NIK.
19. Zastosowanie wektora kodującego sekwencję rybozymu zdolnego do oddziaływania
z sekwencją komórkowego mRNA kodującego polipeptyd określony w zastrz. 1 do wytwa-
4
190 709
rzania kompozycji farmaceutycznej do modulowania działania modulowanego przez/za pośrednictwem TRAF2 na komórki, przy czym kompozycja farmaceutyczna umożliwia wprowadzenie wektora do komórek w postaci powodującej ekspresję takiej sekwencji rybozymu
w tych komórkach, następnie jej oddziaływanie z sekwencją mRNA w komórce, co prowadzi
do zahamowania ekspresji białka wiążącego się z TRAF2 w tych komórkach.
20. Sposób izolowania i identyfikacji polipeptydu wybranego z grupy obejmującej:
a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);
b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą
nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana
jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje
aktywność NF-KB; albo
d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB; przy czym polipeptyd jest zdolny do bezpośredniego wiązania
się z TRAF2, znamienny tym, że obejmuje zastosowanie procedury dwuhybrydowej w drożdżach, w której sekwencja kodująca TRAF2 jest przenoszona przez jeden wektor hybrydowy,
a sekwencja z biblioteki cDNA lub genomowej jest przenoszona przez drugi wektor hybrydowy, następnie wektory stosuje się do transformowania drożdżowych komórek gospodarza
i izoluje się pozytywnie transformowane komórki, a następnie ekstrahuje się drugi wektor
hybrydowy w celu otrzymania sekwencji kodującej białko, które wiąże się z TRAF2.
21. Kompozycja farmaceutyczna do modulowania działania modulowanego przez/za
pośrednictwem TRAF2 na komórki, znamienna tym, że obejmuje, jako składnik czynny,
przynajmniej jeden polipeptyd, wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, który
obejmuje:
a) sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);
b) sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2
i moduluje aktywność NF-KB;
c) sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b ) , posiadającą nie więcej niż dziesięć zmian
w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo
d) pochodne a), b) lub c) wiążące się z TRAF2 i modulujące aktywność NF-KB.
22. Kompozycja farmaceutyczna do modulowania działania modulowanego przez/za
pośrednictwem TRAF2 na komórki, znamienna tym, że obejmuje, jako składnik czynny, rekombinowany zwierzęcy wektor wirusowy kodujący białko zdolne do wiązania się z receptorem powierzchniowym komórki i kodujący przynajmniej jeden polipeptyd zawierający sekwencję kodowaną przez sekwencję nukleotydową SEKW.NR ID: 3.
23. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego
związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez
TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd wybrany z grupy obejmującej:
a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);
b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą
nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana
jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje
aktywność NF-KB; albo
d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że obejmuje skuteczną ilość białka kodowanego przez klon 10 (ID. SEKW.NR: 3).
24. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego
związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez
TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd wybrany z grupy obejmującej:
a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);
190 709
5
b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą
nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana
jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje
aktywność NF-KB; albo
d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że obejmuje skuteczną ilość cząsteczki DNA
kodującej białko kodowane przez klon 10 (ID. SEKW.NR: 3).
25. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego
związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez
TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd wybrany z grupy obejmującej:
a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);
b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą
nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana
jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje
aktywność NF-KB; albo
d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i m odulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że obejmuje skuteczną ilość białka NIK, jego
izoformę, fragment, analog lub pochodną.
26. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego
związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez
TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd wybrany z grupy obejmującej:
a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ED. SEKW.NR: 7 (NIK);
b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą
nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana
jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje
aktywność NF-KB; albo
d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i m odulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że kompozycja obejmuje skuteczną ilość cząsteczki DNA kodującej białko NIK, jego izoformę, fragment, analog lub pochodną.
27. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego
związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez
TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się białko NIK (ED. SEKW.NR: 7), jego izoforma, fragment, analog lub pochodna, znamienna tym, że obejmuje skuteczną ilość białka
NIK, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej.
28. Kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego
związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez
TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się białko NIK (ID. SEKW.NR: 7), jego izoforma, fragment, analog lub pochodna, znamienna tym, że obejmuje skuteczną ilość cząsteczki DNA kodującej białko NIK, jego izoformę, fragment, analog albo pochodną.
29. Zastosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 1 do zapobiegania albo leczenia
stanu patologicznego związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności
zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd określony
w zastrz. 1 .
30. Zastosowanie cząsteczki DNA kodującej polipeptyd określony w zastrz. 1 do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-KB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się
polipeptyd określony w zastrz. 1 .
31. Zastosowanie według zastrz. 29 albo 30, znamienne tym, że polipeptyd kodowany
jest przez klon 1 0 .
6
190 709
32. Zastosowanie według zastrz. 29 albo 30, znamienne tym, że polipeptydem jest NIK.
33. Sposób poszukiwania ligandu wykazującego zdolność wiązania się z polipeptydem
wybranym z grupy obejmującej:
a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);
b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą
nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana
jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje
aktywność NF-KB; albo
d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że obejmuje doprowadzenie do kontaktu podłoża do chromatografii powinowactwa, do którego dołączony jest ten polipeptyd, z ekstraktem
komórkowym tak, że ligand wiąże się z tym podłożem, a następnie wymywanie, izolowanie
i analizowanie takiego ligandu.
34. Sposób poszukiwania sekwencji DNA kodującej ligand zdolny do wiązania polipeptydu wybranego z grupy obejmującej:
a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);
b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą
nie więcej .niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo
d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że obejmuje zastosowanie procedury dwuhybrydowej w drożdżach, w której sekwencja kodująca ten polipeptyd jest przenoszona przez
jeden wektor hybrydowy, a sekwencje z biblioteki cDNA lub genomowej są przenoszone
przez drugi wektor hybrydowy, zastosowanie wektorów do transformowania drożdżowych
komórek gospodarza i izolację pozytywnie transformowanych komórek, a następnie ekstrakcję drugiego wektora hybrydowego w celu otrzymania sekwencji kodującej ligand.
35. Sposób identyfikacji i wytwarzania ligandu zdolnego do modulowania aktywności
komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy TRAF2, znamienny tym, że obejmuje: a)
poszukiwanie ligandu wykazującego zdolność wiązania się z polipeptydem zawierającym co
najmniej część sekwencji TRAF2 o resztach aminokwasowych 222-501 TRAF2; b) identyfikowanie i charakteryzowanie ligandu innego niż TRAF2 albo części receptora z rodziny receptora TNF/NGF, znalezionego w takim etapie poszukiwania jako zdolnego do takiego wiązania; oraz c) wytwarzanie takiego ligandu w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.
36. Sposób identyfikacji i wytwarzania ligandu zdolnego do modulowania aktywności
komórkowej modulowanej albo w której pośredniczy polipeptyd wybrany z grupy obejmującej:
a) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);
b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą
nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana
jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje
aktywność NF-KB; albo
d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i modulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że obejmuje: a) poszukiwanie ligandu
wykazującego zdolność wiązania się z polipeptydem zawierającym co najmniej część
sekwencji NIK ID. SEKW. NR: 7; b) identyfikowanie i charakteryzowanie ligandu innego niż
TRAF2 albo części receptora z rodziny receptora TNF/NGF, znalezionego w takim etapie
poszukiwania jako zdolnego do takiego wiązania; oraz c) wytwarzanie takiego ligandu w postaci
zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.
190 709
7
37. Sposób identyfikacji i wytwarzania ligandu zdolnego do modulowania aktywności
komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy NIK, znamienny tym, że obejmuje: a)
poszukiwanie ligandu wykazującego zdolność wiązania się z polipeptydem zawierającym co
najmniej część sekwencji NIK z ID. SEKW. NR:7; b) identyfikowanie i charakteryzowanie
ligandu innego niż TRAF2 albo części receptora z rodziny receptora TNF/NGF, znalezionego
w takim etapie poszukiwania jako zdolnego do takiego wiązania; oraz c) wytwarzanie takiego
ligandu w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.
38. Sposób identyfikacji i wytwarzania cząsteczki zdolnej do pośredniego albo bezpośredniego modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy NIK,
znamienny tym, że obejmuje: a) poszukiwanie cząsteczki wykazującej zdolność modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy NIK; b) identyfikowanie
i charakteryzowanie tej cząsteczki; oraz c) wytwarzanie takiej cząsteczki w postaci zasadniczo
wyizolowanej i oczyszczonej.
39. Sposób identyfikacji i wytwarzania cząsteczki zdolnej do pośredniego albo bezpośredniego modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy polipeptyd wybrany z grupy obejmującej:
a) polipeptyd zawierający sekwencję am inokwasowąz ID. SEKW. NR: 7 (NIK);
b) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową fragmentu z a), przy czym fragment ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
c) polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą
nie więcej niż dziesięć zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana
jest substytucją, delecją lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje
aktywność NF-KB; albo
d) polipeptyd zawierający sekwencję pochodnej a), b) lub c) wiążący się z TRAF2 i m odulujący aktywność NF-KB, znamienny tym, że obejmuje: a) poszukiwanie cząsteczki wykazującej zdolność modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy
wyżej określony polipeptyd; b) identyfikowanie i charakteryzowanie tej cząsteczki; oraz c)
wytwarzanie takiej cząsteczki w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.
* *
*
Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd, sekwencje DNA, wektor, szczep, sposób wytwarzania białka, przeciwciała albo ich aktywne fragmenty albo pochodne, zastosowania polipeptydu, cząsteczki DNA i wektora, sposób izolowania i identyfikacji polipeptydu, kompozycje farmaceutyczne, sposoby poszukiwania ligandu i sekwencji DNA, sposoby identyfikacji
i wytwarzania ligandu i cząsteczki.
Rozwiązania według wynalazku dotyczą w ogólności sekwencji DNA kodujących białka
0 zdolności wiązania się z TRAF2, białek przez nie kodowanych i zastosowanie tych białek
1 sekwencji DNA do leczenia lub zapobiegania stanowi patologicznemu związanemu z indukcją NF-KB lub z dowolną inną aktywnością, w której pośredniczy TRAF2 lub inne cząsteczki,
z którymi wiążą się te białka.
Dziedzina wynalazku.
Nadrodzina receptora czynnika martwicy nowotworu/czynnika wzrostu nerwów
(TNF/NGF) jest zdefiniowana w oparciu o homologię strukturalną pomiędzy zewnątrzkomórkowymi domenami jej przedstawicieli (Bazan, 1993; Beutler i van Huffel, 1994; Smith i wsp.,
1994). Poza dwoma receptorami, receptorem TNF p55 i Fas/A PO l, różni przedstawiciele tej
rodziny receptorów nie wykazują wyraźnego podobieństwa strukturalnego domen wewnątrzkomórkowych. Pomimo tego, pomiędzy receptorami istnieje duże podobieństwo funkcjonalne
wskazujące na wspólne szlaki przekazywania sygnałów. Jednym z przykładów takiego podobieństwa jest zdolność kilku receptorów z rodziny TFN/NGF do aktywowania transkrypcji
czynnika NF-KB. Ta wspólna zdolność była przypisywana zdolności białka cytoplazmatycznego, które aktywuje transkrypcję NF-KB, czynnika 2 związanego z receptorem TNF
(TRAF2, ang. TNF Receptor Associated Factor 2), do wiązania się do strukturalnie niepodobnych wewnątrzkomórkowych domen kilku receptorów z rodziny TFN/NGF. Poprzez jakie
8
190 709
mechanizmy działa TRAF2 i w jaki sposób jego odpowiedź wobec różnych receptorów, do
których się wiąże, jest koordynowana, nie wiadomo.
TRAF2 jest przedstawicielem opisanej ostatnio rodziny białek zwanej TRAF, która
obejmuje kilka białek zidentyfikowanych jako, przykładowo, TR A FI, TRAF2 (Rothe, M.,
Wong, S.C., Henzel, W. J. i Goeddel, D. (1994) Celi 78: 681-692; opublikowane zgłoszenie
PCT WO 95/33051), TRAF3 (Cheng, G i wsp., (1995)) i TRAF 6 (patrz Cao i wsp., 1996a).
Wszystkie białka należące do rodziny TRAF wykazują wysoki stopień identyczności aminokwasowej w domenach C-końcowych, podczas gdy ich domeny N-końcowe mogą być niespokrewnione. Jak pokazano na schematycznej ilustracji przedstawiającej TRAF2 (fig. 1),
cząsteczka zawiera motyw palca serdecznego i dwa motywy palca cynkowego podobnego do
TFIIIA w regionie C-końcowym. C-końcowa połówka cząsteczki zawiera region znany jako
„domena TRAF” zawierający potencjalny region suwaka leucynowego, rozciągający się pomiędzy aminokwasami 264-358 (zwany N-TRAF) i inną część w stronę końca karboksylowego domeny pomiędzy aminokwasami 359-501 (zwaną C-TRAF), która jest odpowiedzialna za
wiązanie się TRAF z receptorami i z innymi cząsteczkami TRAF z utworzeniem homo- lub
heterodimerów.
Aktywacja czynnika transkrypcyjnego NF-KB jest jednym z przejawów kaskady sygnałów zapoczątkowanej przez niektóre receptory TNF/NGF, w której pośredniczy TRAF2. NF-KB
obejmuje przedstawicieli rodziny białek tworzących dimery, homologicznych do onkogenu
Rei, które w postaci dimeru działają jako czynniki transkrypcyjne. Czynniki te są obecne
wszędzie i uczestniczą w regulacji ekspresji wielu genów. Jakkolwiek początkowo zidentyfikowane jako czynnik, który jest konstytutywnie obecny w limfocytach B w stadium ekspresji
lekkiego łańcucha Igk, NF-KB znany jest przede wszystkim ze swojego działania jako indukowalny aktywator transkrypcyjny. W większości znanych przypadków NF-KB zachowuje się
jako czynnik pierwotny, czyli, że indukcja jego aktywności odbywa się poprzez aktywację
cząsteczek już wcześniej obecnych w komórce w postaci nieaktywnej, a nie syntezy de novo,
która z kolei zależy od indukowalnych czynników transkrypcyjnych, które włączają gen NF-KB.
Efekty NF-KB są niezmiernie plejotropowe. Wspólną cechą większości z tych wielorakich
efektów jest szybka indukcja w odpowiedzi na zewnątrzkomórkowy bodziec. Większość
czynników aktywujących NF-KB stanowią induktory obrony immunologicznej, a wśród nich
składniki wirusów i bakterii, cytokiny, które regulują odpowiedź immunologiczną, światło UV
i inne. A zatem wiele genów regulowanych przez NF-KB ma swój wkład w obronie immunologicznej (patrz prace przeglądowe Blank i wsp., 1992; Grilli i wsp., 1993; Baeuerle i Henkel, 1994).
Jedną z głównych właściwości regulacji NF-KB jest to, że czynnik ten istnieje w cytoplazmatycznej postaci nie wiążącej się z DNA, która może być indukowana do przemieszczenia się do jądra, związania się z DNA i aktywacji transkrypcji. Ta dwoista postać białek NFKB jest regulowana przez I-kB - rodzinę białek, które zawierają powtórzenia domeny, którą
początkowo zauważono w białku erytrocytów - ankirynie (Gilmore i Morin, 1993). W postaci
nie pobudzonej, dimer NF-KB występuje w połączeniu z cząsteczką I-kB, która decyduje o jego
cytoplazmatycznej lokalizacji i zapobiega jego oddziaływaniu z sekwencją DNA wiążącą się
z NF-KB i aktywacji transkrypcji. Oddysocjowanie I-kB od dimeru NF-KB stanowi krytyczny
etap jego aktywacji przez wiele indukujących go czynników (DiDonato i wsp., 1995). Wiedza
na temat mechanizmów, które są zaangażowane w tą regulację jest nadal ograniczona. Niewiele wiadomo również na temat drogi nabywania przez komórki specyficzności w odniesieniu do różnych czynników indukujących NF-KB.
Jednym z najsilniejszych czynników indukujących NF-KB jest cytokina - czynnik martwicy nowotworu (TNF). Istnieją dwa różne receptory TNF, receptor p55 i p75. Poziom ich
ekspresji różni się niezależnie w różnych komórkach (Yandenabeele i wsp., 1995). Receptor
p75 odpowiada przede wszystkim na postać TNF związaną z kom órką (TNF jest wyrażany
zarówno jako białko beta-transbłonowe, jak i białko rozpuszczalne), podczas gdy receptor p55
odpowiada tak samo efektywnie na rozpuszczalne cząsteczki TNF (Greli i wsp., 1995). Domeny wewnątrzkomórkowe dwóch receptorów są strukturalnie niespokrewnione i wiążą się
z różnymi białkami cytoplazmatycznymi. Pomimo tego, co najmniej część efektów TNF, włączając w to efekt komórkobójczy i indukcję NF-KB, może być indukowany przez obydwa
receptory. Cecha ta jest specyficzna komórkowo. Receptor p55 m a zdolność do indukowania
190 709
9
efektu komórkobójczego lub aktywacji NF-KB we wszystkich komórkach, które wykazują
taki efekt w odpowiedzi na TNF. p75-R może dawać taki efekt jedynie w niektórych kom órkach. Inne, jakkolwiek wyrażają p75-R na wysokim poziomie, wykazują indukcję efektu je dynie w odpowiedzi na pobudzenie p55-R (Vandenabeele i wsp., 1995). Poza receptorami
TNF, różne inne receptory z rodziny TNF/NGF: CD30 (McDonald i wsp., 1995), CD40 (Berberich i wsp., 1994; Lamanach-Girard i wsp., 1993), receptor limfotoksyny beta i w kilku typach komórek, Fas/APOl (Rensing-Ehl i wsp., 1995), m ają również zdolność indukcji aktywacji NF-KB. Receptor IL-1 typu I, również efektywnie włączając aktywację NF-KB, ma
właściwości wspólne z receptorami TNF pomimo braku strukturalnego podobieństwa.
Aktywacja NF-KB po włączeniu tych różnych receptorów jest wynikiem indukowanej
fosforylacji związanych z nią cząsteczek I-kB. Ta fosforylacja naznacza I-kB do degradacji,
która najprawdopodobniej ma miejsce w proteosomie. Natura kinazy, która fosforyluje I-kB
i mechanizm aktywacji po włączeniu receptora jest nadal nieznany. Jednakże w ciągu ostatnich dwóch lat zyskano pewną wiedzę na temat tożsamości trzech białek związanych z receptorami, które wydają się brać udział w zapoczątkowaniu fosforylacji (patrz schematyczna ilustracja na fig 2a i 6 ). Białko zwane TRAF2, wyjściowo sklonowane przez D. Goeddela i jego
współpracowników (Rothe i wsp., 1994), wydaje się odgrywać centralną rolę w aktywacji NF-KB
przez różnorodne receptory z rodziny TNF/NGF. Białko, które wówczas, gdy ulega ekspresji
na wysokim poziomie, samo może włączyć aktywację NF-KB, wiąże się do zaktywowanego
TNF-R p75 (Rothe i wsp., 1994), receptora limfotoksyny beta (Mosialos i wsp., 1995), CD40
(Rothe i wsp., 1995a) i CD30 (dane niepublikowane) i pośredniczy w indukcji przez nie NF-KB.
TRAF2 nie wiąże się z receptorem TNF p55 ani z Fas/A PO l, jednakże może wiązać się
z białkiem związanym z receptorem p55, zwanym TRADD, a TRADD ma zdolność wiązania
się z białkiem związanym z Fas/A PO l, zwanym MORT1 (lub FADD - patrz Boldin i wsp.,
1995b i 1996). Inne białko oddziałujące z receptorem, zwane RIP (patrz Stanger i wsp., 1995)
jest również zdolne do oddziaływania z TRAF2, jak również z FAS/APOl, TRADD, receptorem TNF p55 i MORT-1. A zatem, jakkolwiek RIP jest związany z indukcją cytotoksyczności
komórki (śmiercią komórki), jego zdolność do oddziaływania z TRAF2 sugeruje jego udział
w aktywacji NF-KB i może on również służyć do wzmocnienia interakcji pomiędzy
F A Sl/A PO l, MORT1, receptorem p55 i TRADD a TRAF2 na drodze prowadzącej do aktywacji NF-KB. Te powiązania umożliwiają receptorowi TNF p55 i Fas/APOl zapoczątkowanie
aktywacji NF-KB (Hsu i wsp., 1995; Boldin i wsp., 1995; Chinnalyan i wsp., 1995; Varfolomeev i wsp., 1996; Hsu i wsp., 1996). Zapoczątkowanie aktywacji NF-KB przez receptor IL-1
odbywa się niezależnie od TRAF2 i może brać w nim udział ostatnio sklonowana kinaza białkowa związana z receptorem IL-1, zwana IRAK (Croston i wsp., 1995).
Mechanizm działania TRAF2 nie jest jasny. Zidentyfikowano kilka cząsteczek cytoplazmatycznych, które wiążą się z TRAF2 (Rothe i wsp., 1994; Rothe i wsp., 1995b). Jednakże informacje o tych cząsteczkach nie dostarczają wyjaśnienia sposobu za pośrednictwem którego
TRAF2, któiy sam nie ma żadnej aktywności enzymatycznej, zapoczątkowuje fosforylację I-kB.
Nie ma również jeszcze danych odnośnie mechanizmu, który decyduje o komórkowo-specyficznym wzorze aktywacji TRAF2 przez różne receptory, takim jak obserwowany dla indukcji
NF-KB przez dwa receptory TNF.
Poza tym, o czym wspomniano powyżej odnośnie różnych białek TRAF, należy również
wspomnieć, że TRAF2 wiąże się z receptorami TNF p55 (CD120a) i p75 (CD120b), jak rów nież kilkoma innymi receptorami z rodziny TNF/NGD, bezpośrednio lub pośrednio poprzez
inne białka adaptorowe, jak wspomniano powyżej na przykład w odniesieniu do receptora
FAS/APOl i białek adapterowych MORT1, TRADD i RIP. A zatem, TRAF2 odgrywa decydującą rolę w aktywacji NF-KB (patrz również Wallach, 1996). Za to TRAF3 hamuje aktywację
NF-KB przez pewne receptory z rodziny TNF/NGF (patrz Rothe i wsp., 1995a), podczas gdy
TRAF 6 jest wymagany do indukcji NF-KB przez IL-1 (patrz Cao i wsp., 1996a).
Zgodnie z powyższym, jeśli chodzi o aktywację NF-KB i jej znaczenie w utrzymaniu
żywotności komórki, różne wewnątrzkomórkowe szlaki biorące udział w tej aktywacji nie
zostały dotychczas całkowicie wyjaśnione, przykładowo, jaki jest udział różnych białek
TRAF, pośredni czy bezpośredni.
10
190 709
Ponadto, jak obecnie wiadomo odnośnie różnych przedstawicieli rodziny receptorów
TNF/NGF i związanych z nimi wewnątrzkomórkowych szlaków przenoszenia sygnałów, włączając w to, przykładowo, różne białka adaptorowe, pośredniczące - modulujące (patrz krótkie
omówienia i piśmiennictwo w np. izraelskie Zgłoszenie Patentowe nr 114615, 114986,
115319, 116588), TNF i ligand FAS/APOl, na przykład, mogą mieć zarówno korzystny, jak
i szkodliwy wpływ na komórkę. TNF, przykładowo, bierze udział w obronie organizmu przed
rakiem i czynnikami infekcyjnymi oraz bierze udział w likwidacji uszkodzenia poprzez indukowanie zabijania komórek nowotworowych i komórek zainfekowanych wirusem, zwiększając aktywność antybakteryjną granulocytów, a zatem w tych przypadkach zabijanie komórek
indukowanych TNF jest pożądane. Jednakże nadmiar TNF może być szkodliwy i wiadomo, że
TNF odgrywa główną rolę patogenną w licznych chorobach, takich jak wstrząs septyczny,
anoreksja, choroby reumatyczne, stany zapalne i reakcja przeszczep przeciw gospodarzowi.
W takich przypadkach niszczenie komórek indukowanych przez TNF nie jest pożądane. Ligand FAS/APOl na przykład daje również pożądane i szkodliwe skutki. Ligand FAS/APOl
indukuje poprzez swój receptor zabijanie autoreaktywnych limfocytów T w czasie dojrzewania limfocytów T, to jest niszczenie limfocytów T, które rozpoznają własne antygeny w czasie
swojego rozwoju, zapobiegając w ten sposób chorobom autoimmunologicznym. Ponadto różne komórki nowotworowe i komórki zainfekowane HIV niosą na swojej powierzchni receptor
FAS/APOl i mogą być zatem zniszczone poprzez aktywację tego receptora przez jego ligandy
lub specyficzne wobec niego przeciwciała, a co za tym idzie aktywację wewnątrzkomórkowych szlaków śmierci komórki (apoptozy), w której pośredniczy ten receptor. Jednakże receptor FAS/APOl może pośredniczyć w szkodliwym działaniu, na przykład niekontrolowanym
zabijaniu tkanki, które jest obserwowane w niektórych chorobach, takich jak ostre zapalenie
wątroby, któremu towarzyszy rozpad komórek wątroby.
W świetle powyższego, biorąc pod uwagę to, że receptory z rodziny TNF/NGF mogą
z jednej strony indukować szlaki śmierci komórki, a z drugiej strony mogą indukować szlaki
przeżycia komórki (poprzez indukcję NF-KB), istnieje subtelna równowaga wewnątrz komórki pomiędzy tymi dwoma przeciwstawnymi szlakami. Przykładowo, kiedy pożądane jest osiągnięcie maksymalnego zniszczenia komórek nowotworowych lub innych zainfekowanych lub
chorych komórek, pożądane będzie posiadanie TNF i/lub ligandu FAS/APOl, indukujących
jedynie szlak śmierci komórki bez indukcji NF-KB. Przeciwnie, jeżeli jest pożądana ochrona
komórek, tak jak przykładowo, w stanach zapalnych, reakcjach przeszczep przeciw gospodarzowi, ostrym zapaleniu wątroby, pożądane będzie blokowanie indukcji zabijania komórki
przez TNF i/lub ligand FAS/APOl i zwiększenie w zam ian za to indukcji przez niego NF-KB.
Podobnie, w pewnych stanach patologicznych pożądane będzie blokowanie wewnątrzkomórkowych szlaków przekazywania sygnałów za pośrednictwem receptora TNF p75 i receptora IL-1,
podczas gdy w innych pożądane będzie wzmocnienie tych wewnątrzkomórkowych szlaków.
Streszczenie wynalazku
W ogólności rozwiązania według wynalazku m ają na celu dostarczenie nowych białek,
włączając w to wszystkie ich izoformy, analogi, fragmenty lub pochodne, które są zdolne do
wiązania się z białkami związanymi z receptorem czynnika martwicy nowotworu (TRAF1).
Ponieważ białka TRAF biorą udział w modulacji lub pośredniczą w aktywacji transkrypcji
czynnika NF-KB, co jest inicjowane przez niektóre receptory TNF/NGF, jak również inne, jak
wspomniano powyżej, nowe białka według niniejszego wynalazku są zdolne, poprzez wiązanie się z TRAF, do wywierania wpływu (modulując lub pośrednicząc) na wewnątrzkomórkowe procesy przekazywania sygnałów, zapoczątkowywane przez wiązanie się rozmaitych ligandów (np. TNF, ligand FAS i inne) ze swoimi receptorami, takiego jak, przykładowo modulacja/pośredniczenie w aktywacji NF-KB, poprzez pośrednie lub bezpośrednie oddziaływanie
z białkami TRAF.
Nowe białka są zatem bezpośrednimi modulatorami/pośrednikami wewnątrzkomórkowej aktywności biologicznej białek TRAF (np. indukcja aktywacji NF-KB poprzez TRAF2
i TRAF 6 i hamowanie aktywacji NF-KB przez TRAF3).
Nowe białka są, podobnie, pośrednimi modulatorami/pośrednikami wewnątrzkomórkowej aktywności biologicznej różnych innych białek, które m ają zdolność oddziaływania, bezpośrednio lub pośrednio, z białkami TRAF (np. receptora FA S/A PO l, receptora TNF p55,
190 709
11
receptora TNF p75, receptora IL-1 i związanych z nim białek, takich jak, przykładowo,
MORT1, TRADD, RIP).
W szczególności przedmiotem wynalazku jest polipeptyd, który wiąże się z TRAF2
i moduluje aktywność NF-KB, obejmujący:
a) sekwencję aminokwasową z ID. SEKW.NR: 7 (NIK);
b) sekwencję aminokwasową fragmentu z a) , przy czym fragmentten wiąże się z TRAF2
i moduluje aktywność NF-KB;
c) sekwencję aminokwasową analogu z a) lub b), posiadającą nie więcej niż dziesięć
zmian w sekwencji aminokwasowej a) lub b), przy czym każda zmiana jest substytucją, delecją
lub insercją aminokwasu, a analog ten wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB; albo
d) pochodne a), b) lub c) wiążące się z TRAF2 i modulujące aktywność NF-KB.
Korzystnie polipeptyd według wynalazku jest sekwencją kodowaną przez sekwencję
nukleotydową ID. SEKW.NR: 3 (klon 10). Ponadto korzystnie polipeptyd według wynalazku
jest NEK (ID. SEKW.NR: 7), korzystniej zawiera co najmniej część sekwencji aminokwasowej z ID. SEKW.NR: 7.
Rozwiązania według wynalazku dostarczają również antagonistów (tj. przeciwciał, peptydów, związków organicznych lub nawet niektórych izoform) dla powyższych nowych białek
wiążących się z TRAF, włączając w to ich izoformy, analogi, fragmenty lub pochodne, które
mogą być użyte do hamowania procesu przekazywania sygnału, lub bardziej konkretnie, hamowania aktywacji NF-KB i związanego z nią udziału w procesach przeżycia komórek, kiedy
jest to pożądane. Podobnie, kiedy polipeptyd wiążący się z TRAF według wynalazku lub białko TRAF, do którego ulega on związaniu (np. TRAF3), są same inhibitorami aktywacji NF-KB,
rozwiązania według wynalazku dostarczają antagonistów dla tych białek wiążących się
z TRAF, w celu aktywacji procesów przekazywania sygnału lub, bardziej konkretnie, blokowania hamowania aktywacji NF-KB, a zatem uzyskania zwiększenia aktywacji NF-KB kiedy
jest to pożądane.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają zastosowanie powyższych nowych białek
wiążących się z TRAF, ich izoform, analogów, fragmentów lub pochodnych do izolowania
i charakteryzowania dodatkowych białek lub czynników, które m ogą być zaangażowane w regulację aktywności białka TRAF i/lub opisanej powyżej aktywności receptora, np. innych białek,
które mogą wiązać się z białkami TRAF i wpływać na ich aktywność, oraz/albo izolowania
i identyfikowania innych receptorów lub innych białek komórkowych umiejscowionych wcześniej lub później w procesie (procesach) przekazywania sygnałów, do których wiążą się te nowe
białka, ich analogi, fragmenty lub pochodne, a zatem w których funkcję są zaangażowane.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają dostarczenie inhibitorów, które można
wprowadzić do komórek aby związały się lub oddziaływały z nowymi białkami wiążącymi się
z TRAF i ich ewentualnymi izoformami, które to inhibitory m ogą działać hamująco na aktywność związaną z białkiem TRAF, na przykład przy aktywacji NF-KB, a zatem, jeżeli to pożądane, hamują aktywację NF-KB lub mogą działać tak, że ham ują aktywność hamującą związaną z TRAF (np. TRAF3) w aktywacji NF-KB, a zatem, jeżeli to pożądane, zwiększają aktywację NF-KB.
Możliwe jest również zastosowanie wspomnianych powyżej nowych białek wiążących
się z TRAF, ich izoform, analogów, fragmentów lub pochodnych jako antygenów do wytwarzania wobec nich poliklonalnych i/lub monoklonalnych przeciwciał. Przeciwciała z kolei
mogą być zastosowane na przykład do oczyszczania nowych białek z różnych źródeł, takich
jak ekstrakty komórkowe lub transformowane linie komórkowe.
Ponadto przeciwciała te m ogą być użyte do celów diagnostycznych, np. do identyfikowania chorób związanych z nieprawidłowym działaniem funkcji komórkowych, w których
pośredniczą bezpośrednio białka TRAF lub w których pośredniczy receptor TNF p55, receptor
FAS/APOl i inne pokrewne receptory i związane z nimi białka komórkowe (np. MORT1,
TRADD, RIP), które działają bezpośrednio lub pośrednio, modulując/pośrednicząc w procesach wewnątrzkomórkowych poprzez oddziaływanie z białkami TRAF.
Rozwiązania według wynalazku dostarczają również kompozycji farmaceutycznych zawierających wyżej opisane nowe białka TRAF, ich izoformy, analogi, fragmenty lub pochod-
12
190 709
ne. Możliwe jest również otrzymanie kompozycji farmaceutycznych zawierających wspomniane powyżej przeciwciała lub inne czynniki o właściwościach antagonistów.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, wyizolowano szereg nowych białek wiążących się
z TRAF, a w szczególności białek wiążących się z TRAF2. Te białka wiążące się z TRAF2
mają wysoką specyficzność wiązania się z TRAF2 (patrz przykłady poniżej), są więc modulatorami lub pośrednikami w aktywności wewnątrzkomórkowej TRAF2. TRAF2 jest zaangażowany w modulację lub pośredniczenie w co najmniej jednym wewnątrzkomórkowym szlaku przekazywania sygnałów, będącym szlakiem związanym z przeżywalnością lub żywotnością komórki, w którym TRAF2 jest bezpośrednio zaangażowany w aktywację NF-KB, odgrywającą centralną rolę w przeżyciu komórki. Rzeczywiście, jedno z tych nowych białek,
zwane NIK (od „kinazy indukującej NF-KB”, ang. „NF-KB Inducing Kinase”) wiąże się
z TRAF2 i stymuluje aktywność NF-KB. NIK jest kinazą wykazującą podobieństwo sekwencji do kilku kinaz MAPKK (patrz poniżej). Ponadto, TRAF2 poprzez zdolność oddziaływania
bezpośrednio lub pośrednio z wyżej wspomnianym receptorem IN F p55, receptorem TNF p75,
receptorami FAS/APOl i związanymi z nimi białkami MORT1, TRADD i RIP, jest również
pośrednikiem lub modulatorem aktywności indukującej lub aktywującej NF-KB przypisanej
tym receptorom. TRAF2 jest zatem modulatorem/pośrednikiem w szlakach przeżywalności
komórek (w przeciwieństwie do szlaków śmierci komórek), w których pośredniczą te receptory i związane z nimi białka i w konsekwencji siła oddziaływania pomiędzy tymi receptorami
i/lub białkami z TRAF2 jest ważnym czynnikiem dla wypadkowej aktywności tych receptorów (po zaktywowaniu przez swoje ligandy), a mianowicie decyzji, czy komórka przeżyje czy
umrze. A zatem, polipeptyd według wynalazku, przykładowo NIK, odgrywają kluczową rolę
w tym oddziaływaniu pomiędzy TRAF2 i innymi białkami/receptorami, z którymi oddziałuje
TRAF2, ponieważ białka takie jak NIK, poprzez specyficzne wiązanie się TRAF2, będą modulowały jego aktywność i/lub ich aktywność będzie modulowana poprzez oddziaływanie z TRAF2.
Białka wiążące się z TRAF, takie jak, przykładowo, białka wiążące się z TRAF2, włączając w to NIK, zostały wyizolowane i sklonowane przy zastosowaniu systemu dwuhybrydowego, częściowo lub całkowicie zsekwencjonowane i scharakteryzowane i jak opisano
szczegółowo poniżej, wydają się być wysoce specyficznymi białkami wiążącymi się z TRAF2,
a zatem specyficznymi modulatorami/pośrednikami TRAF2.
Zastosowany dalej termin aktywność białka TRAF, przykładowo, aktywność TRAF2,
ma oznaczać jego aktywność w modulowaniu/pośredniczeniu w szlakach przeżycia komórki,
w szczególności w odniesieniu do indukcji/aktywacji NF-KB. Podobnie, zastosowany dalej
termin aktywność białka wiążącego się z TRAF, w szczególności białka wiążącego się
z TRAF2, ma oznaczać modulowanie/pośredniczenie w aktywności TRAF, a w szczególności
TRAF2, poprzez jego specyficzne wiązanie się z TRAF, a w szczególności białkami TRAF2,
gdzie to modulowanie/pośredniczenie obejmuje modulowanie/pośredniczenie w szlakach
przeżycia komórki, w szczególności tych związanych z indukcją/aktywacją NF-KB, w których
białka TRAF, a szczególnie TRAF2, są zaangażowane bezpośrednio lub pośrednio, a zatem
TRAF lub białko wiążące się z TRAF2 mogą być uważane jako pośrednie modulatory/pośrednicy dla wszystkich wspomnianych powyżej białek i możliwie, że licznych innych, które są
zaangażowane w przeżycie komórek, a w szczególności indukcję/aktywację NF-KB i do których TRAF2 (lub inne białka TRAF) wiążą się lub z którymi TRAF2 (lub inne białka TRAF)
oddziałują w sposób bezpośredni lub pośredni.
A zatem, rozwiązania według wynalazku dostarczają sekwencję DNA kodującą białko
zdolne do wiązania się z cząsteczką związaną z receptorem czynnika martwicy nowotworu
(TRAF). W szczególności, przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA kodująca polipeptyd,
który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB, wybrana z grupy składającej się z: 1)
sekwencji cDNA obejmującej sekwencję nukleotydową ID. SEKW.NR: 3; 2) fragmentu sekwencji z 1), kodującego polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB;
3) sekwencji DNA zdolnej do hybrydyzacji z sekwencjami l)-2) w umiarkowanie ostrych warunkach, kodującej polipeptyd, który wiąże się z TRAF2 i moduluje aktywność NF-KB. Korzystnie sekwencja DNA według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydową z ID. SEKW.NR: 3.
Korzystniej sekwencja DNA według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą
białko NIK o sekwencji aminokwasowej z ID. SEKW.NR: 7. Ponadto przedmiotem wynalaz-
190 709
13
ku jest sekwencja DNA zdolna do hybrydyzacji w umiarkowanie ostrych warunkach
z sekwencją kodującą polipeptyd według wynalazku.
Jedną z sekwencji DNA według wynalazku jest sekwencja kodująca białko mające
zdolność wiązania się z TRAF2. Inną sekwencją DNA według wynalazku jest sekwencja kodująca białko zdolne do wiązania się co najmniej do aminokwasów 222-501 z sekwencji aminokwasowej TRAF2.
Niniejszym opisane zostały następujące sekwencje DNA:
a) sekwencja cDNA klonu oznaczonego tu jako klon 9, o sekwencji nukleotydowej
przedstawionej na fig 3 a;
b) sekwencja cDNA klonu oznaczonego tu jako klon 10, o sekwencji nukleotydowej
przedstawionej na fig 4;
c) sekwencja cDNA klonu oznaczonego tu jako klon 15, o sekwencji nukleotydowej
przedstawionej na fig 5 a;
d) fragment sekwencji a)-c), który koduje aktywne biologicznie białko zdolne do wiązania się co najmniej do aminokwasów 222-501 z sekwencji aminokwasowej TRAF2; oraz
e) sekwencja D N A zdolna do hybrydyzowania do sekwencji a)-d) w umiarkowanie
ostrych warunkach i która koduje aktywne biologicznie białko zdolne do wiązania się co najmniej do aminokwasów 222-501 z sekwencji aminokwasowej TRAF2.
f) sekwencja DNA, która jest zdegenerowana ze względu na degenerację kodu genetycznego w stosunku do sekwencji DNA zdefiniowanych w a)-e) i która koduje aktywne biologicznie białko zdolne do wiązania się co najmniej do aminokwasów 222-501 z sekwencji
aminokwasowej TRAF2.
W szczególności opisane zostały:
- sekwencja DNA wybrana z sekwencji zawartych w klonach cDNA, oznaczonych tu ja ko klony 9 i 15;
- sekwencja DNA, która koduje białko, które moduluje również aktywność NF-KB; oraz
- sekwencja DNA wybrana z sekwencji zawartych w klonie cDNA, oznaczonych tu jako 10.
Korzystną odm ianą powyższych sekwencji DNA jest sekwencja DNA zawierająca sekwencję DNA kodującą białko NIK (od kinazy indukującej NF-KB, ang. „NF-KB inducing
kinase”).
Odmiany powyższej sekwencji DNA kodującej białko NIK obejmują:
(i) sekwencję DN A kodującą białko NIK, jego izoformy, fragmenty lub analogi, gdzie
białko NIK, jego izoformy, fragmenty lub analogi mają zdolność wiązania się do TRAF2
i które ma zdolność modulowania aktywności NF-KB;
(ii) sekwencję D N A jak w (i) powyżej, wybraną z grupy składającej się z:
a) sekwencji cDNA pochodzącej z regionu kodującego natywnego białka NIK;
b) sekwencji D NA zdolnych do hybrydyzowania do sekwencji a) w umiarkowanie
ostrych warunkach i które kodują aktywne biologicznie białko NIK, oraz
c) sekwencji DNA, które są zdegenerowane w wyniku degeneracji kodu genetycznego
w odniesieniu do sekwencji DNA zdefiniowanych w a) i b) i które kodują aktywnie biologiczne białko NIK;
(iii) sekwencję DNA jak w (i) lub (ii) powyżej, zawierającą co najmniej część sekwencji
przedstawionej na fig. 6 i kodującą co najmniej jedno aktywne białko NIK, jego izoformę,
analog lub fragment;
(iv) sekwencję DNA jak w (iii) powyżej, kodującą białko N K , jego izoformę, analog
lub fragment zawierające co najmniej część sekwencji aminokwasowej przedstawionej na fig 6 .
Zatem rozwiązania według wynalazku dostarczają białek lub polipeptydów kodowanych
przez wspomniane powyżej sekwencje kodujące DNA według wynalazku, izoformy, analogi,
fragmenty i pochodne takich białek i polipeptydów, zakładając, że m ają one zdolność do wiązania się do TRAF2, korzystnie co najmniej do aminokwasów 222-501 w sekwencji TRAF2.
Opisane tu odmiany tych białek/polipeptydów, oraz ich izoformy, analogi, fragmenty i pochodne obejmują:
a) białko będące białkiem zakodowanym w klonie oznaczonym tu jako klon 1 0 ;
14
190 709
b) białko, jego izoformy, fragmenty, analogi i pochodne, będące białkiem NIK, jego izoformami, analogami, fragmentami i pochodnymi kodowanymi przez wspomniane wyżej sekwencje DNA kodujące to białko NIK, jego izoformy, analogi, fragmenty i pochodne; oraz
c) białko NIK, jego izoformy, analogi, fragmenty i pochodne będące białkiem NIK, jego
izoformami, analogami, fragmentami i pochodnymi kodowanymi przez wspomniane wyżej
sekwencje DNA kodujące to białko NIK, jego izoformy, analogi, fragmenty i pochodne, gdzie
to białko NIK, jego izoformy, fragmenty i pochodne m ają co najmniej część sekwencji aminokwasowej przedstawionej na fig. 6 .
Przedmiotem wynalazku jest również wektor zawierający sekwencję DNA według wynalazku. Korzystnie wektor według wynalazku jest zdolny do ulegania ekspresji w prokariotycznej albo eukariotycznej komórce gospodarza.
Przedmiotem wynalazku jest również szczep transformowanych eukariotycznych lub
prokarietycznych komórek gospodarza zawierający wektor według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania białka wiążącego się z TRAF, jego izoformy, fragmentu, analogu lub pochodnej, który obejmuje hodowanie wspomnianych
powyżej stransformowanych komórek gospodarza według wynalazku w warunkach odpowiednich do ekspresji takiego białka, jego izoform, analogów, fragmentów lub pochodnych,
przeprowadzenie postranslacyjnych modyfikacji, jeżeli to konieczne, w celu otrzymania takiego białka, jego izoformy, fragmentu, analogów lub pochodnych i izolowanie takiego wyrażonego białka, jego izoformy, analogu, fragmentu lub pochodnej.
W dalszym aspekcie wynalazek dostarcza przeciwciał lub ich aktywnych fragmentów
albo pochodnych, swoistych wobec powyższych białek wiążących się z TRAF, ich analogów,
izoform, fragmentów lub pochodnych albo swoistych wobec białka NIK, jego izoformy, analogu, fragmentu lub pochodnej, wspomnianych powyżej. W szczególności przedmiotem wynalazku jest przeciwciało albo jego aktywny fragment albo pochodna, swoiste wobec polipeptydu według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku są również następujące sposoby poszukiwania:
(i) Sposób poszukiwania ligandu mającego zdolność wiązania się z polipeptydem według wynalazku, jak opisano powyżej, włączając w to jego izoformy, analogi, fragmenty lub
pochodne, obejmujący doprowadzenie do kontaktu podłoża do chromatografii powinowactwa,
do którego dołączone jest to białko, jego izoforma, analog, fragment lub pochodna, z ekstraktem komórkowym tak, że ligand wiąże się z tym podłożem i wymywanie, izolowanie i analizowanie takiego ligandu.
(ii) Sposób poszukiwania sekwencji DNA kodującej ligand wykazujący zdolność wiązania się z polipeptydem, jego izoforma, analogiem, fragmentem lub pochodną według wynalazku, jak opisano powyżej, obejmujący zastosowanie procedury dwuhybrydowej w drożdżach, w której sekwencja kodująca ten polipeptyd jest przenoszona przez jeden wektor hybrydowy, a sekwencje z biblioteki cDNA lub genomowej są przenoszone przez drugi wektor
hybrydowy, transformowanie drożdżowych komórek gospodarza takimi wektorami, izolowanie stransformowanych, pozytywnych komórek i ekstrahowanie takiego drugiego wektora
hybrydowego w celu otrzymania sekwencji kodującej taki ligand.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób izolowania i identyfikowania polipeptydu
według wynalazku, mającego zdolność wiązania się bezpośrednio z TRAF2, obejmujący zastosowanie procedury dwuhybrydowej w drożdżach, w której sekwencja kodująca TRAF2 jest
przenoszona przez jeden wektor hybrydowy, a sekwencja z biblioteki cDNA lub genomowej
jest przenoszona przez drugi wektor hybrydowy, wektory następnie używa się do transformowania drożdżowych komórek gospodarza i izoluje się pozytywne stransformowane komórki,
a następnie ekstrahuje się taki drugi wektor hybrydowy w celu otrzymania sekwencji kodującej białko, które wiąże się z TRAF2.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie polipeptydu, sekwencji DNA albo
wektora zdolnego do ekspresji w komórkach według wynalazku, do wytwarzania kompozycji
farmaceutycznej do modulowania aktywności NF-kB albo pośredniczenia w działaniu NF-kB
w komórkach albo jakichkolwiek innych wewnątrzkomórkowych aktywności sygnalizacyjnych modulowanych albo zachodzących za pośrednictwem TRAF2, przy czym kompozycja ta
jest przeznaczona do wprowadzania do komórek. Korzystnie wektor wykorzystywany w za-
190 709
15
stosowaniu według wynalazku jest rekombinowanym zwierzęcym wektorem wirusowym,
obejmującym dodatkowo sekwencję kodującą powierzchniowe białko wirusowe (ligand), które ma zdolność wiązania się ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórek, do których ma być wprowadzana kompozycja farmaceutyczna. Również korzystnie polipeptydem
w zastosowaniu według wynalazku jest NIK albo przynajmniej jedna z izoform, analogów,
fragmentów albo pochodnych NIK.
Tak więc zastosowanie według wynalazku umożliwia modulowanie lub pośredniczenie
w aktywności NF-KB w komórce lub dowolnej innej wewnątrzkomórkowej aktywności przenoszenia sygnałów, którą moduluje lub w której pośredniczy TRAF2 lub inne cząsteczki, do
których wiąże się polipeptyd według wynalazku jak opisano powyżej, przy czym działanie
takie obejmuje traktowanie takich komórek poprzez wprowadzenie do takich komórek jednego lub większej liczby polipeptydów według wynalazku w postaci odpowiedniego wektora
przenoszącego taką sekwencję, a wektor ma zdolność wprowadzania takiej sekwencji do tych
komórek w taki sposób, że ta sekwencja podlega ekspresji w takich komórkach.
Wykonania powyższej metody modulowania/pośredniczenia w komórkach w aktywności NF-KB lub dowolnej innej wewnątrzkomórkowej aktywności przenoszenia sygnałów, którą moduluję lub w której pośredniczy TRAF2 lub inne cząsteczki, obejmują:
(i) Sposób, w którym takie traktowanie komórki obejmuje wprowadzenie do takich komórek sekwencji DNA kodującej takie białko, jego izoformę, analog, fragment lub pochodną
w postaci odpowiedniego wektora przenoszącego taką sekwencję, przy czym wektor ma zdolność wprowadzania takiej sekwencji do komórek w taki sposób, że ta sekwencja podlega ekspresji w takich komórkach.
(ii) Sposób, w którym takie traktowanie komórek polega na transfekcji takich komórek
rekombinowanym wirusem zwierzęcym, obejmujący etapy:
a) konstruowania rekombinowanego zwierzęcego wektora wirusowego przenoszącego
sekwencję kodującą powierzchniowe białko wirusowe (ligand), które ma zdolność wiązania
się ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórek, które m ają być traktowane i drugą
sekwencję, kodującą białko wybrane spośród takiego białka, jego izoform, analogów, fragmentów lub pochodnych według wynalazku, która, kiedy podlega ekspresji w takich komórkach, ma zdolność modulowania/pośredniczenia w aktywności NF-KB lub dowolnej innej
wewnątrzkomórkowej aktywności przenoszenia sygnałów, którą moduluje lub w której
pośredniczy TRAF2 lub inne cząsteczki; oraz
b) infekowania takich limfocytów takim wektorem z (a).
Podobnie, niniejszym opisano sposób modulowania działania modulującego/pośredniczącego TRAF2 na komórki, obejmujący traktowanie takich komórek przeciwciałami lub ich
aktywnymi fragmentami albo pochodnymi według wynalazku, jak opisano powyżej, przy
czym traktowanie to odbywa się poprzez zastosowanie wobec komórek odpowiednich kompozycji zawierających takie przeciwciała, ich aktywne fragmenty albo pochodne, a wówczas,
gdy białka wiążące się z TRAF2 lub jego części w komórce są eksponowane na zewnętrznej
powierzchni, taka kompozycja jest przeznaczona do zastosowania zewnątrzkomórkowego,
a kiedy białka wiążące się z TRAF2 są wewnątrzkomórkowe, taka kompozycja jest przeznaczona do zastosowania wewnątrzkomórkowego.
Opisane zostały również sposoby do modulowania modulującego/pośredniczącego działania TRAF2 na komórki obejmujące:
(i) Sposób obejmujący traktowanie takich komórek sekwencją oligonukleotydowąkodującą sekwencję antysensowną w stosunku do co najmniej części sekwencji DNA, kodującej
białko wiążące się z TRAF2, przy czym ta sekwencja jest dowolną z powyżej wspomnianych
sekwencji, a sekwencja nukleotydowa ma zdolność blokowania ekspresji białek wiążących się
z TRAF2.
(ii) Sposób jak w (i) powyżej, w którym tą sekwencję oligonukleotydową wprowadza
się takich komórek za pośrednictwem rekombinowanego wirusa, jak opisano powyżej, przy
czym druga sekwencja takiego wirusa koduje taką sekwencję oligonukleotydową.
(iii) Sposób obejmujący zastosowanie procedury z użyciem rybozymu, w którym wektor
kodujący sekwencję rybozymu zdolnego do oddziaływania z sekwencją komórkowego mRNA
kodującego białko wiążące się z TRAF2, jego izoformę, analog, fragment lub pochodną we-
16
190 709
dług wynalazku, jak opisano powyżej, wprowadza się takich komórek w postaci, która umożliwia ekspresję takiej sekwencji rybozymu w takich komórkach i gdy taka sekwencja rybozymu podlega ekspresji w takich komórkach, oddziałuje ona z sekwencją mRNA w komórce,
prowadząc do zahamowania ekspresji białka wiążącego się z TRAF2 w takich komórkach.
Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie wektora kodującego sekwencję rybozymu zdolnego do oddziaływania z sekwencją komórkowego mRNA kodującego polipeptyd
według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do modulowania działania
modulowanego przez/za pośrednictwem TRAF2 na komórki, przy czym kompozycja farmaceutyczna umożliwia wprowadzenie wektora do komórek w postaci powodującej ekspresję
takiej sekwencji lybozymu w tych komórkach, następnie jej oddziaływanie z sekwencją mRNA
w komórce, co prowadzi do zahamowania ekspresji białka wiążącego się z TRAF2 w tych
komórkach.
Należy zauważyć, że we wszystkich powyższych sposobach polipeptydem według wynalazku, jak zaznaczono, może być konkretnie NIK albo co najmniej jedna z izoform, analogów, fragmentów NIK lub jej pochodnych.
Powyższe sposoby i ich wykonania obejmują również sposób zapobiegania lub leczenia
stanów patologicznych związanych z indukcją NF-KB lub innymi aktywnościami, w których
pośredniczy TRAF2 albo inne cząsteczki do których wiąże się białko, jego izoforma, analog,
fragment lub pochodna według wynalazku, przy czym sposób obejmuje podawanie potrzebującym pacjentom skutecznej ilości białka, jego izoformy, analogu, fragmentu lub pochodnej
według wynalazku lub kodującej je cząsteczki DNA albo cząsteczki mającej zdolność zaburzania oddziaływania takiego białka, izoformy, analogu, fragmentu lub pochodnej według
wynalazku z TRAF2 lub z dowolną inną cząsteczką, do której wiąże się to białko, jego izoforma, analog, fragment lub pochodna. W tym sposobie, takim białkiem według wynalazku
podawanym potrzebującym pacjentom może być konkretnie białko kodowane przez klon 1 0 ,
NIK, izoforma, analog, fragment lub pochodna NIK lub kodująca je cząsteczka DNA. Białko
kodowane przez klon 10 działa tak, że hamuje indukcję NF-KB, analogicznie jak inne fragmenty NIK, podczas gdy NIK indukuje aktywację NF-KB.
Tak więc przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu według wynalazku do
zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-kB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się
polipeptyd według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie cząsteczki
DNA kodującej polipeptyd według wynalazku do zapobiegania albo leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-kB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej
przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd według wynalazku. Korzystnie polipeptyd kodowany jest przez klon 10. Również korzystnie polipeptyd jest polipeptydem jest NIK.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna do modulowania
działania modulowanego przez/za pośrednictwem TRAF2 na komórki, obejmująca, jako
składnik czynny, przynajmniej jeden polipeptyd według wynalazku.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do modulowania
działania modulowanego przez/za pośrednictwem TRAF2 na komórki, obejmująca jako
składnik czynny, rekombinowany zwierzęcy wektor wirusowy kodujący białko zdolne do wiązania się z receptorem powierzchniowym komórki i kodujący przynajmniej jeden polipeptyd
według wynalazku..
Niniejszym opisana została również kompozycja farmaceutyczna do modulowania działania modulującego/pośredniczącego TRAF2 na komórki, zawierającą jako aktywny składnik
sekwencję oligonukleotydową kodującą sekwencję antysensowną w stosunku sekwencji mRNA dla polipeptydu wiążącego się z TRAF2 według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo
leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-kB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd według
wynalazku, obejmująca skuteczną ilość białka kodowanego przez klon 10 (ID. SEKW.NR: 3).
Przedmiotem wynalazku jest również analogiczna kompozycja obejmująca skuteczną ilość
cząsteczki DNA kodującej białko kodowane przez klon 10 (ID. SEKW.NR: 3).
190 709
17
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo
leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-kB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się polipeptyd według
wynalazku, obejmująca skuteczną ilość białka NIK, jego izoformę, fragment, analog lub pochodną. Przedmiotem wynalazku jest również analogiczna kompozycja zawierająca skuteczną
ilość cząsteczki DNA kodującej białko NIK, jego izoformę, fragment, analog lub pochodną.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do zapobiegania albo
leczenia stanu patologicznego związanego z indukcją NK-kB albo jakiejkolwiek innej aktywności zachodzącej przez TRAF2 albo inne cząsteczki, z którymi wiąże się białko NIK, jego
izoforma, fragment, analog lub pochodna, obejmująca skuteczną ilość białka NIK, jego izoformy, fragmentu, analogu albo pochodnej. Przedmiotem wynalazku jest również analogiczna
kompozycja farmaceutyczna obejmująca skuteczną ilość cząsteczki DNA kodującej białko
NIK, jego izoformę, fragment, analog albo pochodną. Opisane zostały również kompozycje
farmaceutyczne do zapobiegania lub leczenia stanów patologicznych związanych z indukcją
NF-KB lub innymi aktywnościami, w których pośredniczy TRAF2 albo inne cząsteczki, do
których wiąże się białko NIK, zawierające cząsteczkę zdolną do przeszkadzania w aktywności
kinazy białkowej NIK. W tej kompozycji przeszkadzającą cząsteczką może być skuteczna
ilość NIK o zmutowanych resztach w miejscu aktywnym, przy czym ta zmutowana NIK służy
do przeszkadzania natywnej NIK, a w szczególności aktywności kinazy NIK.
Jednym ze znanych stanów związanych z indukcją NF-KB (nieprawidłową) jest AIDS,
innymi są np. choroby autoimmunologiczne, jak również nowotwory.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób identyfikacji i wytwarzania ligandu zdolnego do modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy TRAF2,
obejmujący: a) poszukiwanie ligandu wykazującego zdolność wiązania się z polipeptydem
zawierającym co najmniej część sekwencji TRAF2 o resztach aminokwasowych 222-501
TRAF2; b) identyfikowanie i charakteryzowanie ligandu innego niż TRAF2 albo części receptora z rodziny receptora TNF/NGF, znalezionego w takim etapie poszukiwania jako zdolnego
do takiego wiązania; oraz c) wytwarzanie takiego ligandu w postaci zasadniczo wyizolowanej
i oczyszczonej.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób identyfikacji i wytwarzania ligandu zdolnego do modulowania aktywności komórkowej modulowanej albo w której pośredniczy polipeptyd według wynalazku, przy czym sposób ten obejmuje: a) poszukiwanie ligandu wykazującego zdolność wiązania się z polipeptydem zawierającym co najmniej część sekwencji NIK
ID. SEKW. NR: 7; b) identyfikowanie i charakteryzowanie ligandu innego niż TRAF2 albo
części receptora z rodziny receptora TNF/NGF, znalezionego w takim etapie poszukiwania
jako zdolnego do takiego wiązania; oraz c) wytwarzanie takiego ligandu w postaci zasadniczo
wyizolowanej i oczyszczonej.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób identyfikacji i wytwarzania ligandu zdolnego do modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy NIK,
który obejmuje: a) poszukiwanie ligandu wykazującego zdolność wiązania się z polipeptydem
zawierającym co najmniej część sekwencji NIK z ID. SEKW.NR: 7; b) identyfikowanie i charakteryzowanie ligandu innego niż TRAF2 albo części receptora z rodziny receptora
TNF/NGF, znalezionego w takim etapie poszukiwania jako zdolnego do takiego wiązania;
oraz c) wytwarzanie takiego ligandu w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji i wytwarzania cząsteczki zdolnej do
pośredniego albo bezpośredniego modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której
pośredniczy NIK, przy czym sposób ten obejmuje: a) poszukiwanie cząsteczki wykazującej zdolność modulowania aktywności komórkowej, którą moduluje/w której pośredniczy NIK; b)
identyfikowanie i charakteryzowanie tej cząsteczki; oraz c) wytwarzanie takiej cząsteczki
w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.
Przedmiotem wynalazku jest też sposób identyfikacji i wytwarzania cząsteczki zdolnej
do pośredniego albo bezpośredniego modulowania aktywności komórkowej, którą m oduluje/w której pośredniczy polipeptyd według wynalazku, przy czym sposób ten obejmuje: a)
poszukiwanie cząsteczki wykazującej zdolność modulowania aktywności komórkowej, którą
moduluje/w której pośredniczy polipeptyd określony w zastrz. 1 ; b) identyfikowanie i charak-
18
190 709
teryzowanie tej cząsteczki; oraz (c) wytwarzanie takiej cząsteczki w postaci zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej.
Obecny opis zawiera również inne aspekty i wykonania rozwiązań według niniejszego
wynalazku, wynikające z następującego szczegółowego opisu wynalazku.
Należy zaznaczyć, że zastosowane tu następujące terminy: modulacja/pośredniczenie
w działaniu TRAF (lub TRAF2 ) na komórki i dowolna inna taka modulacja/pośredniczenie wspomniane w opisie mają być rozumiane jako obejmujące zarówno działanie in vitro, jak i in vivo,
a ponadto obejmują hamowanie lub wzmocnienie/zwiększenie.
Krótki opis rysunków:
- figura 1 pokazuje diagram ilustrujący strukturę cząsteczki TRAF2
- figura 2 a-b pokazuje schematy ilustrujące pewne białka zaangażowane w aktywację
NF-KB, włączając w to nowe białka wiążące się z TRAF według niniejszego wynalazku
(np. NIK), w którym:
a)
jest schematem częściowym, a b) jest schematem bardziej kompletnym;
- figura 3 a-b pokazuje sekwencję nukleotydową na końcu 5' klonu 9 a) i wydedukowan ą zakodowaną w niej sekwencję aminokwasową b);
- figura 4 pokazuje sekwencję nukleotydową klonu 10;
- figura 5 a-b pokazuje sekwencję nukleotydową klonu 15 a) i wydedukowaną zakodowaną
w niej sekwencję aminokwasową b);
- figura 6 pokazuje sekwencję nukleotydową i wydedukowaną sekwencję aminokwasow ą NIK; oraz
- figura 7 pokazuje dopasowanie sekwencji białka NIK do sekwencji mysiej kinazy białkowej mMEKK (mysia MAPK lub Kinaza kinazy ERK) i licznych innych kinaz. Zaznaczone są
regiony odpowiadające zakonserwowanym motywom od I do XI w kinazach białkowych.
Szczegółowy opis wynalazku:
Niniejszy wynalazek dotyczy sekwencji DNA kodujących białka zdolne do wiązania się
z cząsteczką czynnika związanego z receptorem czynnika martwicy nowotworu (TRAF)
i kodowanych przez nie białek.
W_korzystnym wykonaniu niniejszy wynalazek dotyczy sekwencji cDNA, oznaczonych
tu jako klon 9, klon 10 i klon 15 (przedstawione, odpowiednio, na fig. 3a, 4 i 5a), które kodują
białka zdolne do wiązania się z TRAF2 i białek kodowanych przez te sekwencje DNA.
W dalszym korzystnym wykonaniu wynalazek dotyczy sekwencji DNA kodujących
białko NIK oraz samego białka NIK.
DNA i wydedukowane sekwencje aminokwasów opisane powyżej reprezentują nowe
sekwencje; nie ma ich w „GENEBANK” lub „PROTREIN BANK”, bazach danych sekwencji
DNA lub aminokwasowych.
W zakresie niniejszego wynalazku pozostają również fragmenty wspomnianych powyżej sekwencji DNA i sekwencji DNA zdolnych do hybrydyzacji z tymi sekwencjami DNA lub
ich częściami w umiarkowanie ostrych warunkach hybrydyzacji, zakładając, że kodują one
aktywne biologicznie białko lub polipeptyd zdolny do wiązania się co najmniej do aminokwasów 222-501 z sekwencji aminokwasowej TRAF2.
Niniejszy wynalazek dotyczy również sekwencji DNA, która je st zdegenerowana w wyniku degeneracji kodu genetycznego w stosunku do sekwencji DNA, która koduje aktywnie
biologiczne białko lub polipeptyd zdolny do wiązania się co najmniej do aminokwasów 222-501
z sekwencji aminokwasowej TRAF2.
Jeśli chodzi o TRAF2, należy zauważyć, że kilku przedstawicieli rodziny receptora
TNF/NGF aktywuje transkrypcję czynnika NF-KB poprzez bezpośrednie lub pośrednie połączenie z TRAF2, który jest zatem białkiem adapterowym dla tych receptorów, a więc może
być uważany za modulatora/pośrednika w indukcji aktywacji aktywności NF-KB tych receptorów TNF/NGF (patrz schemat na fig. 2b). Inny receptor, receptor IL-1, aktywuje NF-KB
niezależnie od TRAF2. Jednym z korzystnych przykładów białka wiążącego się z TRAF według niniejszego wynalazku jest białko NIK, które wiąże się z NIK w bardzo specyficzny sposób i stymuluje aktywność NF-KB. NIK jest kinazą serynowo/treoninową, wykazującą podobieństwo sekwencji z kilkoma kinazami MAPKK (patrz przykłady poniżej). Analogi lub muteiny NIK wytworzone według niniejszego wynalazku (patrz przykłady), którym brak aktyw-
190 709
19
ności kinazy, nie stymulują aktywacji NF-KB, jeżeli takie analogi/muteiny są wyrażane
w komórkach. Ponadto, takie analogi/muteiny, jeżeli są wyrażone w komórkach, blokują rów nież indukcję NF-KB przez TNF, jak również wiele innych czynników indukujących, takich
jak bakteryjna endotoksyna LPS, octan mirystynianu forbolu (aktywator kinazy białkowej C)
oraz białko TAK HTLV-1. Indukcja aktywności NF-KB przez TNF odbywa się poprzez jeden
z dwóch receptorów TNF (receptor TNF p55 lub p75), a zatem wydaje się, że muteiny/analogi
blokują indukcję aktywacji NF-KB poprzez te receptory. Podobnie, ligandy receptorów TNF
i FAS/APOl mogą również indukować aktywność NF-KB za pośrednictwem spokrewnionego
receptora, receptora FAS/APOl, którego indukcja jest również blokowana przez muteiny/analogi NIK. Co więcej, powyższe receptory m ają białka adaptorowe TRADD, RIP
i MORT1, które mogą również indukować aktywność NF-KB, ale których indukcja jest rów nież blokowana przez muteiny/analogi NIK. Ponadto, takie muteiny/analogi NIK blokują
również indukcję NF-KB przez. IL-1 (działającej za pośrednictwem receptora IL-1). A zatem
wygląda na to, że NIK uczestniczy w kaskadzie indukcji NF-KB, która jest wspólna dla receptorów z rodziny TNF/NDG i dla receptora EL-1. NIK wydaje się również działać w sposób
bezpośredni przy indukcji aktywacji NF-KB, być może poprzez bezpośrednie zwiększenie
fosforylacji I-kB. Z niniejszych obserwacji wynika, że powyższe analogi/muteiny NIK, którym brak aktywności kinazy (zwane również mutantami dominującymi negatywnymi), kiedy
są wyrażane w komórkach, nie wpływają w żaden sposób na indukowaną TNF aktywację kinazy Jun, wskazując, że NIK działa specyficznie zwiększając fosforylację I-kB bez wywierania wpływu na kinazę MAP zaangażowaną w fosforylację Jun.
A zatem niniejszy wynalazek dotyczy sekwencji DNA kodujących aktywne biologicznie
białka wiążące się z TRAF, np. białka wiążące się z TRAF2, takie jak na przykład NIK, jak
również ich analogi, fragmenty lub pochodne oraz kodowane przez nie analogi, fragmenty lub
pochodne białek. Wytworzenie takich analogów, fragmentów lub pochodnych odbywa się poprzez standardowe procedury ( patrz, przykładowo, Sambrook i wsp., 1989) dzięki którym
z sekwencji kodujących w DNA można usunąć, dodać lub zamienić na inny jeden lub więcej
kodonów, z wytworzeniem zakodowanych analogów mających zmienioną co najmniej jedną
resztę aminokwasową w stosunku do natywnego białka. Akceptowalnymi analogami są takie,
które zachowały co najmniej zdolność do wiązania się z białkami TRAF2, z lub bez wpływu
na inne aktywności wiązania lub enzymatyczne, np. analogi, które wiążą się z TRAF2, ale nie
przekazują sygnału, tj. nie wiążą się z kolejnym białkiem w kaskadzie lub innym czynnikiem
albo nie katalizują reakcji zależnej od sygnału. W ten sposób można wytworzyć analogi, które
mają tak zwany efekt dominujący negatywny, a mianowicie, analog, który m a defekt dotyczący bądź wiązania się z TRAF2, bądź następującego po nim przekazania sygnału po zajściu
takiego wiązania, jak opisano powyżej. Takie analogi mogą być zastosowane, przykładowo,
do hamowania efektów CD40, receptorów TNF p55 i p75, FAS/APOl i innych pokrewnych
receptorów, jak również efektów, w których pośredniczą różne białka związane z receptorem
(adaptory), jak opisano powyżej, poprzez współzawodniczenie z naturalnymi białkami wiążącymi się z TRAF2. Podobnie, można wytworzyć tak zwane dominujące pozytywne analogi,
które służyłyby do wzmacniania efektu TRAF2. Miałyby one takie same lub lepsze właściwości wiązania TRAF2 i takie same albo lepsze własności przekazywania sygnałów od naturalnych białek wiążących się z TRAF2. W analogiczny sposób jak wspomniano powyżej w odniesieniu do otrzymywania analogów, można wytworzyć biologicznie aktywne fragmenty klonów według wynalazku. Odpowiednimi fragmentami sekwencji DNA według wynalazku są
takie, które kodują białko lub polipeptyd zachowujący własności wiązania się z TRAF2 lub
który może pośredniczyć w dowolnym innym wiązaniu lub aktywności enzymatycznej, jak
opisano powyżej. A zatem, można wytworzyć fragmenty zakodowanych białek według wynalazku, które m ają efekt dominujący negatywny lub dominujący pozytywny, jak opisano powyżej w odniesieniu do otrzymywania analogów. Podobnie, można wytworzyć pochodne poprzez standardowe modyfikacje grup bocznych jednego lub większej liczby reszt aminokwasowych w białkach, ich analogach lub fragmentach, albo poprzez połączenie białek, ich analogów lub fragmentów z inną cząsteczką np. przeciwciałem, enzymem, receptorem itd., co
jest dobrze znane w tej dziedzinie.
20
190 709
Poza powyższymi sekwencjami DNA według wynalazku, które kodują białko wiążące
się z TRAF (np. białko wiążące się z TRAF2, takie jak na przykład NIK), izoformę, analog,
fragment lub pochodną, jako wykonanie wynalazku włączone są również sekwencje DNA
zdolne do hybrydyzowania z sekwencją cDNA, pochodzącą z regionu kodującego natywnego
białka wiążącego się z TRAF, przy czym taką hybrydyzację przeprowadza się w umiarkowanie ostrych warunkach, a zdolne do hybrydyzacji sekwencje DNA kodują aktywne biologicznie białko wiążące się z TRAF. Te zdolne do hybrydyzacji sekwencje DNA obejmują zatem
sekwencje DNA, które m ają stosunkowo wysoką homologię do sekwencji cDNA natywnych
białek wiążących się z TRAF (np. sekwencji cDNA białka wiążącego się z TRAF2, takiego
jak na przykład sekwencja cDNA NIK) i jako takie reprezentują sekwencje białek wiążących
się z TRAF, którymi mogą być przykładowo, naturalnie występujące sekwencje kodujące różne izoformy białka wiążącego się z TRAF lub naturalnie występujące sekwencje kodujące
białka należące do grupy sekwencji kodujących białka podobnego do białek wiążących się
z TRAF2, kodujące białko o aktywności białek wiążących się z TRAF (np. białek wiążących
się z TRAF2, takich jak, przykładowo, NIK). Ponadto, sekwencje te m ogą również, przykładowo, obejmować nie występujące naturalnie, wytworzone syntetycznie sekwencje, które są
podobne do sekwencji cDNA natywnych białek wiążących się z TRAF, ale zawierają szereg
pożądanych modyfikacji. Takie syntetyczne sekwencje obejmują zatem wszystkie możliwe
sekwencje, włączając w to analogi, fragmenty i pochodne białek wiążących się z TRAF (np. białek
wiążących się z TRA.F2, takich jak, przykładowo, NIK), przy czym wszystkie mają aktywność
białek wiążących się z TRAF.
W celu otrzymania różnych wspomnianych powyżej, naturalnie występujących sekwencji białka podobnego do białka wiążącego się z TRAF, można zastosować standardowe procedury poszukiwania i izolowania naturalnie występujących DNA lub RNA z próbek różnych
tkanek przy zastosowaniu jako sondy naturalnego cDNA białka wiążącego się z TRAF lub
jego części (patrz przykładowo, standardowe procedury przedstawione w Sambrook i wsp. 1989).
Podobnie, w celu otrzymania powyżej wspomnianych różnych syntetycznych sekwencji
białka podobnego do białka wiążącego się z TRAF (np. do białek wiążących się z TRAF2,
takich jak, przykładowo, NIK), można zastosować standardowe procedury, jak przedstawiono
szczegółowo poniżej w odniesieniu do wytwarzania takich analogów, fragmentów i pochodnych.
Polipeptyd lub białko „zasadniczo podobne” do białka wiążącego się z TRAF obejmuje
nie tylko białko wiążące się z TRAF, ale również polipeptydy lub białka, które są analogami
białka wiążącego się z TRAF.
Analogami, które zasadniczo odpowiadają białku wiążącemu się z TRAF są takie polipeptydy, w których jeden lub wiecej aminokwas w sekwencji aminokwasowej białka wiążącego się z TRAF został wymieniony na inny aminokwas, usunięty i/lub wstawiony, przy założeniu, że otrzymane w rezultacie białko wykazuje zasadniczo taką sam ą lub wyższą aktywność
niż białko wiążące się z TRAF, któremu ono odpowiada.
Aby zasadniczo odpowiadać białku wiążącemu się z TRAF, zmiany w sekwencji białek
wiążących się z TRAF, takich jak izoformy, są generalnie stosunkowo małe. Jakkolwiek liczba zmian może być większa niż dziesięć, korzystnie jest nie więcej niż dziesięć zmian, korzystniej nie więcej niż pięć, a najkorzystniej nie więcej niż trzy takie zmiany. Jakkolwiek
można zastosować dowolną technikę do znalezienia potencjalnych biologicznie aktywnych
białek, które zasadniczo odpowiadają białkom wiążącym się z TRAF, jedną z takich technik
jest zastosowanie wobec DNA kodującego białko konwencjonalnych technik mutagenezy,
uzyskując w rezultacie kilka modyfikacji. Białko wyrażane przez takie klony może być następnie testowane pod kątem zdolności do wiązania się z białkami TRAF (np. TRAF2) i modulowania aktywności białka TRAF (np. TRAF2) dotyczącej modulowania/pośredniczenia
w szlakach wewnątrzkomórkowych wspomnianych powyżej.
Zmiany „konserwatywne” są takimi zmianami, które nie powinny zmieniać aktywności
białka i są one zwykle testowane w pierwszej kolejności, ponieważ nie powinny zasadniczo
zmieniać wielkości, ładunku lub konfiguracji białka, zatem można oczekiwać, że nie będą
zmieniać jego właściwości biologicznych.
Konserwatywne podstawienia białek wiążących się z TRAF obejmują analogi, w których co najmniej jedna reszta aminokwasowa w polipeptydzie została konserwatywnie zamie-
190 709
21
niona na inny aminokwas. Korzystne jest, jeżeli takie podstawienia są dokonane zgodnie
z następującą listą przedstawioną w tabeli IA, które to podstawienia można testować w standardowych doświadczeniach pod kątem uzyskania zmodyfikowanych strukturalnych i funkcjonalnych właściwości syntetyzowanej cząsteczki polipeptydu przy zachowaniu aktywności
biologicznej, charakterystycznej dla białka wiążącego się z TRAF.
T a b e l a IA
Wyjściowa
Przykładowe
reszta
podstawienie
Ala
Gly; Ser
Arg
Lys
Asn
Gin; His
Asp
Glu
Cys
Ser
Gin
Asn
Glu
Asp
Gly
Ala; Pro
His
Asn; Gin
Ile
Leu; Val
Leu
Ile; Val
Lys
Arg; Gin; Glu
Met
Leu; Tyr; Ile
Phe
Met; Leu; Tyr
Ser
Thr
Thr
Ser
Trp
Tyr
Tyr
Trp; Phe
Val
Ile; Leu
Alternatywnie, inną grupą podstawień w białku wiążącym się z TRAF są takie, w których co najmniej jedna reszta aminokwasowa w polipeptydzie została usunięta i inna reszta
wstawiona w jej miejsce zgodnie z tabelą LB. Typy podstawień, których można dokonać
w polipeptydzie, m ogą opierać się o analizę częstości zmian aminokwasowych między hom ologicznymi białkami z różnych gatunków, tak jak przedstawiono w tabeli 1-2 w Schulz i wsp.,
GE., Principies of Protein Structure Springer Verlag, New York, NY, 1798 i figurach 3-9
z Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San
Francisco, CA 1983. W oparciu o taką analizę zdefiniowano tu alternatywne konserwatywne
podstawienia jako wymiany w obrębie jednej z następujących pięciu grup:
T a b e l a IB
1. Małe alifatyczne, niepolame lub słabo polarne reszty: A-la, Ser, Thr (Pro, Gly);
2. Polarne ujemnie naładowane reszty i ich amidy: Asp, Asn,Glu, Gin;
3. Polarne dodatnio naładowane reszty: His, Arg, Lys;
4. Duże alifatyczne niepolame reszty: Met, Leu, Ile, Val (Cys); oraz
5. Duże aromatyczne reszty: Phe, Tyr, Trp.
Te trzy reszty aminokwasowe w nawiasach powyżej odgrywają specjalną rolę w architekturze białka. Gly jest jedyną resztą, w której brak łańcucha bocznego, z zatem nadaje łańcuchowi
elastyczność. Promuje to jednakże tworzenie struktur drugorzędowych innych niż a-helikalne. Pro,
z powodu niezwykłej geometrii, mocno więzi łańcuch i generalnie promuje struktury typu
zagięcie b, jakkolwiek w niektórych przypadkach Cys ma zdolność uczestniczenia w tworzeniu
wiązań dwusiarczkowych, co jest ważne przy fałdowaniu białek. Należy zauważyć, że Schultz
i wsp., jak wyżej, łączy pokazane powyżej Grupy 1 i 2. Należy również zauważyć, że Tyr, z powodu potencjału wiążącego jej wodoru, wykazuje znaczące pokrewieństwo z Ser i Thr, itd.
Konserwatywne podstawienia aminokwasowe według wynalazku, np. jak przedstawiono powyżej, są znane w tej dziedzinie i należałoby oczekiwać, że będą zachowywały aktywność biologiczną i właściwości strukturalne polipeptydu po podstawieniu aminokwasowym.
22
190 709
Większość delecji i podstawień według wynalazku to takie, które nie prowadzą do radykalnych zmian we właściwościach cząsteczki białka lub polipeptydu. Termin „właściwości”, zdefiniowany w sposób nie ograniczający, ma dotyczyć zarówno zmian w strukturze drugorzędowej, np. helisa lub b-kartka, jak i zmian w aktywności biologicznej, np. wiązaniu z białkami TRAF i/lub pośredniczeniu w efektach białek TRAF dotyczących śmierci komórki.
Przykłady wytwarzania podstawień aminokwasowych w białkach, które można wykorzystać do otrzymywania analogów białek wiążących się z TRAF do zastosowania w niniejszym wynalazku, obejmują dowolne znane kroki metodyczne, takie jak przedstawione w patentach USA 33653, 4959314, 4588585 i 4737462 dla Mark i wsp.; 5116943 dla Koths i wsp.,
4965195 dla Namen i wsp.; 4879111 dla Chong i wsp.; i 5017691 dla Lee i wsp.; oraz białko
z podstawieniem lizynowym przedstawione w patencie USA nr 4904584 (Shaw i wsp.).
Poza konserwatywnymi podstawieniami dyskutowanymi powyżej, które nie zmieniłyby
znacząco aktywności białka wiążącego się z TRAF, w zakres wynalazku mają wchodzić bądź
konserwatywne podstawienia, bądź mniej konserwatywne i bardziej losowe zmiany, które
prowadzą do zwiększenia aktywności biologicznej analogów białek wiążących się z TRAF.
Wówczas, kiedy zajdzie potrzeba potwierdzenia dokładnego efektu podstawienia lub
delecji, biegły w tej dziedzinie będzie wiedział, że efekt podstawienia (podstawień), delecji
(jednej lub więcej) można oszacować poprzez rutynowe testy wiązania i śmierci komórki.
Analiza przy zastosowaniu takich standardowych testów nie wymaga nadmiernego eksperymentowania.
Na poziomie genetycznym, analogi te są generalnie otrzymywane poprzez ukierunkowaną mutagenezę nukleotydów w DNA kodującym białko wiążące się z TRAF, z wytworzeniem tym sposobem DNA kodującego analog, a następnie syntetyzowanie DNA i wyrażenie
polipeptydu w hodowli rekombinowanych komórek. Analogi typowo wykazują tą samą lub
zwiększoną jakościowo aktywność biologiczną, co białko naturalnie występujące, Ausubel
i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience,
New York, NY, 1987-1995; Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Wytwarzanie białek wiążących się z TRAF według powyższego lub alternatywnej sekwencji nukleotydowej kodującej ten sam polipeptyd, ale różniącej się od naturalnej sekwencji na skutek zmian dozwolonych ze względu na znany fakt degeneracji kodu genetycznego,
można uzyskać poprzez ukierunkowaną mutagenezę DNA, który koduje wcześniej przygotowany analog lub natywną wersję białka wiążącego się z TRAF. Ukierunkowana mutageneza
umożliwia wytwarzanie analogów poprzez zastosowanie specyficznych sekwencji oligonukleotydowych, które kodują sekwencję DNA z pożądaną mutacją, 'jak również wystarczającą
liczbą sąsiednich nukleotydów, w celu uzyskania sekwencji startera o wystarczających rozmiarach i złożoności sekwencji dla utworzenia stabilnego dupleksu po obu stronach krańców
delecji, która jest przekraczana. Typowo, korzystny je st starter o długości około 20 do 25 nukleotydów, z 5 do 10 komplementarnych nukleotydów po obu stronach sekwencji, która jest
zmieniana. W ogólności, technika ukierunkowanej mutagenezy jest dobrze znana w tej dziedzinie, czego przykładem jest publikacja taka, jak Adelman i wsp., DNA 2: 183 (1983), włączona tu jako odnośnik literaturowy.
Jak będzie można się zorientować, techniki ukierunkowanej mutagenezy zwykle wykorzystują wektory fagowe, które występują zarówno w formie jednoniciowej, jak i dwuniciowej. Typowe wektory przydatne w ukierunkowanej mutagenezie obejm ują wektory takie,
jak fag M l3, na przykład jak ujawniono w Messing i wsp., Third Cleveland Symposium on
Macromolecules and Recombinant DNA, wyd. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), włączone tu jako odnośnik literaturowy. Fagi te są łatwo dostępne handlowo, a ich zastosowanie
jest ogólnie dobrze znane biegłym w tej dziedzinie. Alternatywnie, w celu otrzymania jednoniciowego DNA można zastosować wektory plazmidowe, które zawierają początek replikacji
fagów jednoniciowych (Veira i wsp., Meth. Enzymol. 153: 3, 1987).
W ogólności ukierunkowaną metagenezę zgodnie z powyższym wykonuje się poprzez
otrzymanie wyjściowo jednoniciowego wektora, który zawiera w obrębie swojej sekwencji
sekwencję DNA kodującą odpowiedni polipeptyd. Starter oligonukleotydowy o pożądanej
zmutowanej sekwencji jest wytwarzany syntetycznie poprzez syntezę DNA/oligonukleotydu.
190 709
23
Starter ten przyłącza się następnie do jednoniciowego wektora zawierającego sekwencję kodującą białko i poddaje działaniu enzymu polimeryzującego, takiego jak fragment Klenowa polimerazy I E. coli w celu dokończenia syntezy nici przenoszącej mutację. W ten sposób zm utowana sekwencja i druga nić przenoszą pożądaną mutację. Taki wektor - heterodupleks używa się następnie do transformacji odpowiednich komórek, takich jak komórki E. coli JM101
i selekcjonuje się klony, które zawierają rekombionowane wektory zawierające zmutowaną
sekwencję.
Po wyselekcjonowaniu takiego klonu, zmutowaną sekwencję białka wiążącego się
z TRAF można wyciąć i umieścić w odpowiednim wektorze, generalnie w wektorze przenoszącym lub ekspresyjnym takiego typu, który może być zastosowany do transfekcji odpowiedniego gospodarza.
A zatem gen lub kwas nukleinowy kodujący białko wiążące się z TRAF może być rów nież wykrywany, otrzymany i/lub zmodyfikowany in vitro, in situ i/lub in vivo przy zastosowaniu znanych technik powielania DNA, takich jak PCR i chemiczna synteza oligonukleotydów. PCR umożliwia powielanie (zwiększenie liczby) specyficznych sekwencji DNA poprzez
powtarzające się reakcje polimerazy DNA. Zastosowanie tej reakcji może zastąpić klonowanie; wszystko co jest potrzebne, to znajomość sekwencji kwasu nukleinowego. W celu przeprowadzenia reakcji PC R projektuje się startery, które są komplementarne do sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania. Startery wytwarza się następnie poprzez zautomatyzowaną
syntezę DNA. Ponieważ można zaprojektować startery hybrydyzujące z dowolną częścią genu, można stworzyć takie warunki, że niesparowane zasady przy komplementarnym parowaniu mogą być tolerowane. Powielanie takich nie w pełni sparowanych regionów może prowadzić do syntezy zmutowanego produktu, prowadząc w rezultacie do wytworzenia polipeptydu
0 nowych właściwościach (tj. ukierunkowana mutageneza). Patrz również np. Ausubel, jak
wyżej, Rozdz. 16. Poprzez powiązanie syntezy komplementarnego DNA (cDNA) przy użyciu
odwrotnej transkryptazy z PCR, można zastosować RNA jako materiał wyjściowy do syntezy
zewnątrzkomórkowej domeny receptora prolaktyny bez klonowania.
Ponadto można zaprojektować startery PCR w celu dodania nowych miejsc restrykcyjnych lub innych elementów, takich jak kodony terminacyjne na końcach odcinka genu, który
ma być powielony. To umieszczenie miejsc restrykcyjnych na końcach 5' i 3' powielanej sekwencji genu umożliwia handlowe przeznaczenie odcinka DNA kodującego białko wiążące
się z TRAF lub jego fragment, do ligacji z innymi sekwencjami lub miejscami klonowania
w wektorach.
PCR lub inne metody powielania RNA i/lub DNA są dobrze znane w tej dziedzinie
1 mogą być zastosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem bez nadmiernego eksperymentowania w oparciu o naukę i wskazówki przedstawione tutaj. Znane metody powielania RNA
lub DNA obejmują między innymi reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) i pokrewne procesy
powielania (patrz np. patent USA N r 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, dla Mullis
i wsp.; 4795699 i 4921794 dla Tabor i wsp.; 5142033 dla Innis; 5122464 dla Wilson i wsp.
5091310 dla Innis; 5066584 dla Gyllensten i wsp.; 4889818 dla Gelfii wsp.; 4994370 dla Silver i wsp.; 4766067 dla Biswas; 4656134 dla Ringold; oraz Innis i wsp., wyd., PCR Protocols: A Guide to M ethod and Applications) oraz powielanie za pośrednictwem RNA, w którym stosuje się antysensowny RNA w stosunku do sekwencji docelowej jako matrycę do syntezy dwuniciowego D N A (patent USA N r 5130238 dla M ałek i wsp., z nazwą handlową
NASBA) oraz immuno-PCR, który łączy powielanie DNA ze znakowaniem przeciwciałem
(Ruzicka i wsp., Science 260:487 (1993); Sano i wsp., Science 58:120 (1992); Sano i wsp.,
Biotechniques 9:1378 (1991)), przy czym cała zawartość patentów i odnośników literaturowych jest tu w całości włączona jako odniesienie.
W analogiczny sposób można otrzymać biologicznie aktywne fragmenty białek wiążących się z TRAF (np. dowolnego z białek wiążącego się z TRAF2, takiego jak np. NIK) lub
ich izoform), jak opisano powyżej w odniesieniu do analogów białek wiążących się z TRAF.
Odpowiednimi fragmentami białek wiążących się z TRAF są takie, które zachowują w łaściwości białek wiążących się z TRAF i które pośredniczą w aktywności biologicznej białek
TRAF lub innych białek związanych z białkami TRAF bezpośrednio lub pośrednio. A zatem
można wytworzyć fragmenty białek wiążących się z TRAF, które m ają efekt dominujący ne-
24
190 709
gatywny lub dominujący pozytywny, jak opisano powyżej w odniesieniu do analogów. Należy
zauważyć, że te fragmenty reprezentują specjalną klasę analogów według wynalazku, a mianowicie są określonymi częściami białek wiążących się z TRAF, pochodzącymi z pełnej sekwencji białka wiążącego się z TRAF (np. z dowolnego z białek wiążących się z TRAF2, takiego jak np. NIK lub jego izoformy), przy czym każda część lub fragment ma określone powyżej pożądane właściwości. Takim fragmentem może być np. peptyd.
Podobnie, można wytworzyć pochodne poprzez standardowe modyfikacje grup bocznych jednej lub większej liczby reszt aminokwasowych białka wiążącego się z TRAF, jego
analogów lub fragmentów, albo poprzez połączenie białka wiążącego się z TRAF, jego analogu lub fragmentu z inną cząsteczką np. przeciwciałem, enzymem, receptorem itd., co jest dobrze znane w tej dziedzinie. A zatem, stosowany tu termin „pochodne” obejmuje pochodne,
które mogą być wytwarzane z grup funkcyjnych, które występują jako łańcuchy boczne reszt
aminokwasowych lub grup funkcyjnych N- lub C-końcowych, sposobami znanymi w tej dziedzinie i są one objęte wynalazkiem. Pochodne mogą mieć ugrupowania chemiczne, takie jak
reszty węglowodanowe lub fosforanowe, przy założeniu, że m ają one tą samą lub wyższą aktywność biologiczną co białka wiążące się z TRAF.
Przykładowo, pochodne mogą obejmować estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych poprzez reakcję z amoniakiem lub pierwszorzędowymi albo drugorzędowymi aminami, pochodne N-acylowe lub wolne grupy aminowe reszt aminokwasowych
utworzone z grupą acylową (np. grupami alkonoilowymi lub karbocykloaroilowymi) lub pochodne O-acylowe wolnych grup hydroksylowych (przykładowo dla reszt serylowych lub treonylowych) utworzone z resztami acylowymi.
Termin „pochodne” ma obejmować jedynie te pochodne, które nie zmieniają jednego
aminokwasu w inny spośród dwudziestu występujących powszechnie naturalnych aminokwasów.
Białko wiążące się z TRAF jest białkiem lub polipeptydem, tj. sekwencją reszt aminokwasowych. Polipeptyd składający się z dłuższej sekwencji, która zawiera całą sekwencję
białka wiążącego się z TRAF, według przedstawionej definicji ma być zaliczana jako taki polipeptyd, o ile dodatki nie wpływają na podstawowe i nowe właściwości według wynalazku,
tj. jeżeli bądź zachowują, bądź zwiększają aktywność biologiczną białka wiążącego się
z TRAF lub mogą być odcinane z uwolnieniem białka lub polipeptydu, mającego aktywność
biologiczną białka wiążącego się z TRAF. A zatem, przykładowo, niniejszy wynalazek ma
obejmować fuzje białka wiążącego się z TRAF z innymi aminokwasami lub polipeptydami.
Jak wspomniano powyżej, należy rozumieć, że powyższymi białkami „wiążącymi się
z TRAF” są dowolne białka, które mogą wiązać się i pośredniczyć/modulować aktywność
dowolnego białka TRAF wewnątrzkomórkowo. Konkretnymi przykładami są białka wiążące
się z TRAF2, które mogą modulować lub pośredniczyć w związanej z TRAF2 aktywności
wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnałów, jak wspomniano powyżej, w szczególności
w odniesieniu do udziału TRAF2 w indukowaniu aktywności NF-KB, w szczególności po
interakcji pomiędzy TRAF2 i różnymi przedstawicielami rodziny receptora TNF/NGF i/lub
związanych z nimi białkami adapterowymi, jak opisano szczegółowo powyżej i poniżej. Konkretnym przykładem takiego białka wiążącego się z TRAF2 jest białko NIK i jego różne analogi, fragmenty itp. (patrz przykłady), które wydają się wiązać z TRAF2 bardzo specyficznie
i mieć bezpośredni udział w indukowaniu aktywności NF-KB, z różnymi dominującymi negatywnymi analogami/muteinami blokującymi tą aktywność.
Wspomniane powyżej modyfikacje pozostają w zakresie wynalazku o ile zachowują
zdolność zakodowanych białek lub polipeptydów albo ich analogów i pochodnych do wiązania się co najmniej do aminokwasów 222-501 w sekwencji aminokwasowej TRAF2.
Wszystkie białka i polipeptydy według wynalazku dzięki swojej zdolności do wiązania
się z TRAF2 są uważane za pośredniki lub modulatory w przekazywaniu sygnałów przez
TRAF2. Jako takie, te cząsteczki DNA według wynalazku odgrywają rolę na przykład w procesach przekazywania sygnałów, w których wiązanie się ligandu TRAF2 do CD30, CD40,
receptora limfokiny beta (LT-P), receptorów p55 lub p75, jak również innych receptorów lub
białek adapterowych wspomnianych powyżej, prowadzi do aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-KB. Szczególnie interesujące jest białko NIK i niepełne białko NIK kodowane przez
klon 10 według wynalazku; szczegółowa analiza sekwencji NIK i białka kodowanego przez
190 709
25
klon 10 (wyjściowo nazwanego NMPI) ujawniła zakodowaną sekwencję aminokwasową odpowiadającą konserwowanym motywom I - XI charakterystycznym dla kinaz białkowych
Ser/Thr, przypisując w ten sposób funkcję temu białku.
Nowe klony, białka, ich analogi, fragmenty i pochodne m ają pewną ilość potencjalnych
zastosowań, na przykład:
(i) M ogą być użyte do imitowania lub wzmagania aktywności NF-KB, funkcji TRAF2
i receptorów do których się wiążą, w sytuacjach, w których pożądane jest wzmożone działanie, takich jak zastosowania przeciwnowotworowe lub immunostymulujące, gdzie są pożądane efekty indukowane przez TRAF2. W tym przypadku białka według wynalazku, ich analogi,
fragmenty lub pochodne, które wzmagają efekty TRAF2 lub receptorów mogą być wprowadzone do komórek za pom ocą standardowych znanych procedur. Przykładowo, ponieważ
białka kodowane przez klony DNA według wynalazku są wewnątrzkomórkowe i powinny być
wprowadzane tylko do komórek, w których efekt TRAF2 jest pożądany, niezbędny jest system
dla specyficznego wprowadzania tych białek do komórki. Jednym ze sposobów dokonania
tego jest stworzenie rekombinowanego wirusa zwierzęcego np. pochodzącego od wirusa krowianki, do DNA którego będą wprowadzone dwa z następujących genów: gen, który koduje
ligand wiążący się z powierzchniowymi białkami komórki, specyficznie wyrażanymi przez
komórki np. taki, jak białko gp l2 0 wirusa AIDS (HIV), które wiąże się specyficznie do pew nych komórek (limfocyty CD4 i pokrewne białaczki) lub dowolny inny ligand wiążący się
specyficznie z pewnymi komórkami niosącymi receptor, który wiąże się z TRAF2, tak by rekombinowany wektor wirusowy był zdolny do wiązania się do takich komórek; i gen kodujący białka według wynalazku. Tak więc ekspresja białka wiążącego się z powierzchnią komórki na powierzchni w irusa naprowadzi wirus specyficznie na komórkę nowotworu lub inną
komórkę niosącą receptor, po czym sekwencje kodujące białka będą wprowadzone do kom órek za pomocą wirusa i po ekspresji w komórkach spowodują wzmocnienie efektu receptora
lub TFLAF2, prowadząc do pożądanego efektu immunostymulującego w tych komórkach.
Konstrukcji takiego rekombinowanego wirusa zwierzęcego dokonuje się za pomocą standardowych procedur (Sambrook i wsp., 1989). Inną możliwością jest wprowadzenie sekwencji
kodowanych białek w postaci oligonukleotydów, które m ogą być absorbowane przez te komórki i w nich wyrażane.
(ii) M ogą być one stosowane do hamowania aktywności NF-KB, efektów TRAF2 lub
receptora, który go wiąże np. w takich przypadkach, jak niszczenie tkanek w AIDS, szoku
septycznym lub odrzucaniu przeszczep-przeciw gospodarzowi, w którym pożądane jest blokowanie indukowanego wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnałów. W tej sytuacji jest
możliwe, przykładowo, wprowadzenie do komórek za pom ocą standardowych procedur oligonukleotydów mających antysensowną sekwencję kodującą dla białek według wynalazku,
które by skutecznie blokowały translację mRNA kodujących białka i w ten sposób blokowały
ich ekspresję i powodowały hamowanie niepożądanego efektu. Alternatywnie, można stosować inne oligonukleotydy - oligonukleotydy, które zachowują swoją zdolność do wiązania się
z TRAF2 w taki sposób, że przeszkadzają w wiązaniu się innych cząsteczek do tego białka,
a jednocześnie nie pośredniczą w żadnej aktywacji lub modulacji tej cząsteczki. Mając te cechy, cząsteczki te m ogą rozbijać interakcję TRAF2 z jego naturalnym ligandem, działają zatem jako inhibitory zdolne do zaburzania efektów, w których pośredniczy TRAF2, takich jak
na przykład aktywacja NF-KB. Takie oligonukleotydy m ogą być wprowadzane do komórek
przy zastosowaniu powyższego podejścia ze rekombinowanym wirusem, przy czym drugą
sekwencją niesioną przez wirus jest sekwencja oligonukleotydu.
Inną możliwością jest stosowanie przeciwciał swoistych wobec białek według wynalazku do hamowania ich wewnątrzkomórkowej aktywności przekazywania sygnałów.
Jeszcze innym sposobem hamowania niepożądanego efektu jest niedawno opracowane
podejście z rybozymami. Rybozymy są katalitycznymi cząsteczkami RNA, które specyficznie
tną RNA. Rybozymy m ogą być poddane manipulacjom tak, aby przecinały docelowe cząsteczki wybranego RNA, np. mRNA kodujące białka według wynalazku. Takie rybozymy
miałyby sekwencję specyficzną dla mRNA białek i byłyby zdolne do oddziaływania z nim
(wiązanie komplementarne) po czym nastąpiłoby cięcie mRNA, co powodowałoby obniżenie
(lub całkowitą utratę) ekspresji tego białka, przy czym poziom obniżonej ekspresji zależałby
26
190 709
od poziomu ekspresji rybozymu w komórce docelowej. Aby wprowadzić rybozymy do wybranych komórek (np. niosących białka wiążące się z TRAF2) można stosować jakikolwiek
odpowiedni wektor, np. plazmid, wirusowe wektory zwierzęce (retrowirus), które są normalnie
stosowane w tym celu (patrz też (i), powyżej gdzie wirus ma, jako drugą sekwencję, cDNA kodujący wybraną sekwencję rybozymu). (Dla przeglądu, metod itp. dotyczących rybozymów patrz
Chen i wsp., 1992; Zhao i Pick, 1993).
(iii) M ogą być one stosowane do izolacji, identyfikowania i klonowania innych białek,
które są zdolne do wiązania się z nimi, np. innych białek związanych z procesem wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnału, które działają poniżej TRAF2. Na przykład sekwencje
DNA kodujące białka według wynalazku mogą być zastosowane w systemie dwuhybrydowym, w którym zakodowane białka będą stosowane jako przynęta do izolacji, klonowania
i identyfikowania w bibliotekach cDNA lub genomowych innych sekwencji („ofiar”) kodujących białka, które mogą wiązać się z białkami klonów. W ten sam sposób też określić, czy
białka według niniejszego wynalazku mogą wiązać się z innymi białkami komórkowymi, np. innymi receptorami nadrodziny receptorów TNF/TGF.
(iv) Kodowane białka, ich analogi, fragmenty lub pochodne m ogą być też stosowane do
izolacji, identyfikacji i klonowania innych białek z tej samej klasy tzn. wiążących się z TRAF2 lub
funkcjonalnie pokrewnymi białkami i związanych z wewnątrzkomórkowym procesem przekazywania sygnałów. W tym zastosowaniu może być stosowany wymieniony powyżej system
dwuhybrydowy drożdży, albo może być stosowany niedawno opracowany system z zastosowaniem hybrydyzacji Southema w warunkach łagodnych, a następnie klonowanie za pomocą
PCR (Wilks i wsp., 1989).
(v) Jeszcze innym podejściem do użycia zakodowanych białek według wynalazku, ich
analogów, fragmentów lub pochodnych jest ich stosowanie w metodach chromatografii powinowactwa w celu izolowania i identyfikowania innych białek lub czynników, do których wiązania są one zdolne, np. białek pokrewnych względem TRAF2 lub innych białek lub czynników biorących udział w wewnątrzkomórkowym procesie przekazywania sygnałów. W tym
zastosowaniu, białka, ich analogi, fragmenty i pochodne według niniejszego wynalazku można indywidualnie przyłączać do podłoża do chromatografii powinowactwa i następnie doprowadzać do kontaktu z ekstraktami komórkowymi lub izolowanymi białkami lub czynnikami,
które podejrzewa się o udział w wewnątrzkomórkowym procesie przekazywania sygnałów. Po
zastosowaniu procedury chromatografii powinowactwa, inne białka lub czynniki, które wiążą
się z białkami, ich analogami, fragmentami lub pochodnymi według wynalazku mogą być
wymywane, izolowane i charakteryzowane.
(vi) Jak odnotowano powyżej, białka, ich analogi, fragmenty lub pochodne według wynalazku mogą być stosowane jako immunogeny (antygeny) do wytwarzania swoistych wobec
nich przeciwciał. Te przeciwciała mogą być także stosowane w celu oczyszczania białek według wynalazku bądź z ekstraktów komórkowych, bądź z wytwarzających je, ich analogi lub
fragmenty linii komórkowych. Co więcej, przeciwciała te m ogą być stosowane w celach diagnostycznych do identyfikacji chorób związanych z nienormalnym działaniem systemu receptorowego, w którym działają, na przykład nadmiernie czynnymi lub niedostatecznie czynnymi
efektami komórkowymi indukowanymi przez TRAF2. Tak więc o ile te zaburzenia będą
związane ze źle działającym wewnątrzkomórkowym systemem przekazywania sygnałów,
w którym uczestniczą białka według wynalazku, takie przeciwciała byłyby ważnym narzędziem diagnostycznym.
Określenie „przeciwciało” ma obejmować poliklonalne przeciwciała, monoklonalne
przeciwciała (mAbs), hybrydowe przeciwciała, przeciwciała anty-idiotypowe (anty-Id) wobec
przeciwciał, które mogą być wyznakowane w postaci rozpuszczalnej lub związanej, jak również ich fragmenty, takie jak na przykład fragmenty Fab i F(ab ' ) 2 pozbawione fragmentu Fc
nienaruszonego przeciwciała, które są zdolne do wiązania antygenu.
(vii) Przeciwciała, włączając w to fragmenty przeciwciał, użyteczne w niniejszym wynalazku mogą być stosowane do ilościowego lub jakościowego wykrywania klonów według
wynalazku w próbce, lub do wykrywania obecności komórek, które wyrażają klony według
niniejszego wynalazku. Może to być osiągnięte przez techniki immunofluorescencji przy za-
190 709
27
stosowaniu fluorescencyjnie wyznakowanego przeciwciała w połączeniu z detekcją za pom ocą mikroskopu świetlnego, cytometrii przepływowej lub fluorometrii.
Przeciwciała (lub ich fragmenty) przydatne w niniejszym wynalazku mogą być użyte histologicznie, jak w mikroskopii immunofluorescencyjnej lub immunoelektronowej, do wykrywania in situ klonów według niniejszego wynalazku. Detekcję in situ można przeprowadzić poprzez pobranie próbki histologicznej od pacjenta i dostarczenie wyznakowanego przeciwciała według niniejszego wynalazku do takiej próbki. Korzystne jest dostarczenie przeciwciała (lub fragmentu) poprzez zastosowanie lub nałożenie znakowanego przeciwciała (lub
fragmentu) na próbkę biologiczną. Poprzez użycie takiej procedury jest możliwe stwierdzenie
nie tylko obecności klonów, ale także jego dystrybucji w badanej tkance. Stosując niniejszy
wynalazek osoby o przeciętnych umiejętnościach łatwo zauważą, że każda z szerokiego zakresu metod histologicznych (takich jak procedury barwienia) może być zmodyfikowana tak,
aby uzyskać taką detekcję in situ.
Takie testy dla klonów według niniejszego wynalazku typowo obejmują inkubację
próbki biologicznej, takiej jak płyn biologiczny, ekstrakt z tkanki, świeżo zebrane komórki,
takie jak limfocyty lub leukocyty, lub komórki, które były inkubowane w hodowli tkankowej,
w obecności wyznakowanego w sposób wykrywalny przeciwciała, zdolnego do identyfikowania zakodowanych białek i wykrywanie przeciwciała za pomocą dowolnej z wielu technik
dobrze znanych w tej dziedzinie.
(viii)
Zakodowane białka według wynalazku mogą być także zastosowane jako pośrednie modulatory dla licznych innych białek ze względu na swą zdolność wiązania się do innych
wewnątrzkomórkowych białek lub wewnątrzkomórkowej domeny białka transmembranowego.
Dla celu modulacji tych innych białek wewnątrzkomórkowych lub wewnątrzkomórkowych domen białek transmembranowych, białka według wynalazku m ogą być wprowadzane
do komórek przy zastosowaniu szeregu sposobów wspomnianych powyżej w (ii).
Należy także zauważyć, że izolacja, identyfikacja i charakteryzacja białek według wynalazku może być przeprowadzona przy zastosowaniu dowolnej z dobrze znanych procedur poszukiwań. Na przykład, jedna z tych procedur poszukiwań, drożdżowa procedura dwuhybrydowa, była stosowana do identyfikacji białek według wynalazku. Podobnie, można zastosować
inne procedury, na przykład chromatografię powinowactwa, procedury hybrydyzacji DNA itp. dobrze znane w tej dziedzinie, aby wyizolować, zidentyfikować i scharakteryzować dodatkowe
białka, czynniki, receptory itp., które są zdolne do wiązania się z białkami według wynalazku.
Co więcej, białka, dla których stwierdzono, że wiążą się z białkami według wynalazku,
mogą być same wykorzystane w sposób analogiczny do sposobu, w którym białka według
wynalazku były użyte, jak opisano powyżej i poniżej do izolowania, identyfikacji i charakteryzowania innych białek, czynników itp., które są zdolne do wiązania się z białkami wiążącymi się do białek według wynalazku i które mogą reprezentować czynniki biorące udział
poniżej w związanym z nimi procesie przekazywania sygnałów lub które m ogą mieć aktywności przekazywania sygnałów i reprezentują zatem białka zaangażowane w odrębny proces
przekazywania sygnałów.
Sekwencje DNA i kodowane białka według wynalazku mogą być wytwarzane za pom ocą dowolnej standardowej procedury rekombinowania DNA (patrz na przykład Sambrook
i wsp., 1989), w której odpowiednie eukariotyczne lub prokariotyczne komórki gospodarza są
transformowane przez odpowiednie eukariotyczne lub prokariotyczne wektory zawierające
sekwencje kodujące białka. Tak więc niniejszy wynalazek dotyczy także takich wektorów
ekspresyjnych i stransformowanych gospodarzy do wytwarzania białek według wynalazku.
Jak wspomniano powyżej, te białka obejmują także ich biologiczne czynne analogi, fragmenty
i pochodne, a zatem kodujące je wektory obejmują także wektory kodujące analogi i fragmenty. Pochodne tych białek są pochodnymi otrzymywanymi za pom ocą standardowych modyfikacji białek lub ich analogów lub fragmentów, wytwarzanymi przez stransformowanych
gospodarzy.
Niniejszy wynalazek także dotyczy kompozycji farmaceutycznych do modulowania
efektów, w których pośredniczy TRAF2. Kompozycje farmaceutyczne obejm ująjako składnik
czynny, dowolny jeden lub więcej z następujących: (i) jedną lub więcej z sekwencji DNA według wynalazku, lub ich części, subklonowane do odpowiedniego wektora ekspresyjnego; (ii)
28
190 709
białko według wynalazku, jego fragment biologicznie czynny, analog lub pochodną lub ich
mieszanina; (iii) rekombinowany wirus zwierzęcy, kodujący białko według wynalazku, jego
biologicznie czynne fragmenty, analogi lub pochodne.
Kompozycje farmaceutyczne stosuje się w zależności od choroby, która ma być leczona
i w ilościach korzystnych dla pacjenta, w zależności od masy ciała i innych względów, ustalonych przez lekarza.
Jak zauważono powyżej, jedną ze specyficznych postaci białek wiążących się z TRAF2
według niniejszego wynalazku jest wiążące się z TRAF2 białko NIK. Biorąc pod uwagę odkrycie, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, że NIK wiąże się specyficznie z TRAF2 i jako taki
jest mediatorem/modulatorem TRAF2 i może więc pośredniczyć/modulować aktywność
TRAF2 w aktywacji NF-KB i stąd jego możliwa rola w szlakach przeżywania limfocytów
takich, w których TRAF2 działa niezależnie lub wraz z innymi białkami (np. receptory p55 TNF
i p75 TNF, receptor FAS/APOl, MORT1, RIP i TRADD), ważne jest projektowanie leków,
które mogą wzmagać lub hamować interakcję TRAF2-NTK, zależnie od potrzeby. Przykładowo, gdy jest pożądane zwiększenie cytotoksyczności komórek indukowanej przez TNF, byłoby pożądane hamowanie indukcji NF-KB przez hamowanie interakcji TRAF2-NIK lub przez
hamowanie samego TRAF2 i/lub NIK. Podobnie, na przykład, gdy jest pożądane hamowanie
cytotoksyczności komórek indukowanej przez TNF, byłoby pożądane zwiększenie indukcji
NF-KB przez zwiększenie interakcji TRAF2-NIK lub przez zwiększenie specyficznej dla
TRAF2 i/lub NIK indukcji NF-KB. Istnieje wiele chorób, w których takie leki mogą być bardzo pomocne. Między innymi (patrz również powyższa dyskusja) ostre zapalenie wątroby, w którym poważne uszkodzenie wątroby wydaje się być odbiciem śmierci komórek, w której pośredniczy receptor FAS/APOl komórek wątroby po indukowaniu przez ligand Fas; śmierć
komórek indukowana auto immunologicznie, taka jak śmierć limfocytów B Langerhansa
trzustki, która powoduje cukrzycę; śmierć komórek przy odrzucaniu przeszczepów (np. nerki,
serca i wątroby); śmierć oligodendrocytów w mózgu w stwardnieniu rozsianym i hamowane
przez AIDS samobójstwa limfocytów T, które powoduje proliferację wirusa AIDS i w efekcie
chorobę AIDS.
W takich przypadkach byłoby pożądane zahamowanie szlaku cytotoksyczności (apoptozy), w której bierze udział receptor FAS/APOl i zwiększenie indukcji NF-KB, w której pośredniczy receptor FA S/APO l, z udziałem TRAF2 i interakcji TRAF2-NIK. Jednym ze sposobów dokonania tego byłoby zwiększenie ilości TRAF2 i NIK tak, aby indukcja aktywacji
NF-KB, w której biorą udział NIK lub TRAF2-NEK zwiększyła się, dając większy poziom
aktywacji NF-KB, a więc i przeżywalności komórek, lub tak, że bezpośrednie lub pośrednie
oddziaływanie między receptorem FAS/APOl i TRAF2 (lub TRAF2-NIK) będzie zwiększone
powodując zmniejszenie interakcji receptora FAS/APOl z mediatorami cytotoksyczności komórkowej (np. MACH, patrz schemat na fig. 2b) aby uzyskać zwiększenie indukcji aktywacji
NF-KB i przeżywania komórek.
Przeciwnie, w przypadku na przykład guzów i komórek zakażonych (patrz także dyskusja powyżej) byłoby pożądane zwiększenie cytotoksyczności, w której pośredniczy receptor
FAS/APOl, aby spowodować wzmożoną śmierć komórek. W tym przypadku byłoby pożądane hamowanie interakcji receptor FAS/APOl-TRAF2 (lub TRAF2-NIK) i/lub bezpośrednie
hamowanie NIK i ten zmniejszając w ten sposób indukcję aktywności NF-KB.
Jest możliwe, że NIK łub jedna albo więcej z jej możliwych izoform, analogów lub
fragmentów mogą posłużyć, jako „naturalne” inhibitory samego NIK lub interakcji NIK-TRAF2
i jako takie działać jako inhibitory indukcji aktywacji NF-KB. Takie inhibitory m ogą być więc
stosowane jako specyficzne inhibitory opisane powyżej, na przykład te inhibitory mogą być
stosowane, gdy jest pożądane zwiększenie cytotoksycznych efektów TNF lub ligandu receptora FAS/APOl, aby zwiększyć śmierć komórek. Faktycznie, jak przedstawiono w przykładach
poniżej, wyizolowano różne analogi i muteiny NIK zgodnie z niniejszym wynalazkiem, które
są analogami/muteinami pozbawionymi aktywności kinazy i które są zdolne do blokowania
indukcji aktywacji NF-KB, w której pośredniczą receptory TNF, receptor FAS/APOl, związane z nimi białka TRADD, RIP i MORT1; jak i tej, w której pośredniczy receptor IL-1 (którego
aktywacja zachodzi poprzez NEK, ale jest niezależna od TRAF2) i w której pośredniczą także
endotoksyna LPS, octan mirystylanu forbolu i białko HTLY-1 TAX. Podobnie, inne substan-
190 709
29
cje, takie jak peptydy, związki organiczne, przeciwciała itp. mogą też być testowane w celu
uzyskania specyficznych leków, które są zdolne do hamowania interakcji TRAF2-NIK lub
aktywności NIK.
W podobny sposób, gdy jest pożądane zwiększenie aktywacji NF-KB w różnych sytuacjach, jak opisano powyżej, jest na przykład możliwe zwiększenie ilości NIK i/lub TRAF2
w komórkach za pom ocą różnych standardowych metod, opisanych tu powyżej (np. wprowadzania DNA kodującego NIK i/lub TRAF2 do komórek w celu indukowania wzmożonej ekspresji lub przygotowania odpowiednich kompozycji zawierających NIK i/lub TRAF2 do bezpośredniego wprowadzania do komórek, lub dowolnego innego sposobu znanego osobom
biegłym w dziedzinie). Podobnie, inne substancje, takie jak peptydy, związki organiczne itp.
mogą być testowane w celu uzyskania specyficznych leków, które są zdolne do hamowania
aktywności NIK lub wzmagania oddziaływania TRAF2-NIK.
Nie ograniczający przykład na to, jak inhibitory peptydowe odziaływania NDC-TRAF2
byłyby projektowane i testowane, jest oparty na uprzednich badaniach nad peptydowymi inhibitorami ICE lub proteaz ICE-podobnych, specyficznością substratową ICE i strategiami analizy epitopów przy zastosowaniu syntezy peptydów. Minimalnym wymaganiem dla skutecznego cięcia peptydu przez ICE okazały się być cztery aminokwasy na lewo od miejsca cięcia,
z silną preferencją w stosunku do kwasu asparaginowego w pozycji Pi i z metyloaminą wystarczającą na prawo od pozycji Pi (Sleath i wsp., 1990; Howard i wsp., 1991; Thomberry i wsp.,
1992). Co więcej, substrat fluorogenny (tetrapeptyd) acetylo-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-metylokumarylo-7-amid), oznaczony w skrócie Ac-DEVD-AMC, odpowiada sekwencji w polimerazie poli (ADP-rybozy)(PARP), która, jak stwierdzono, jest przecinana w komórkach
wkrótce po stymulacji FAS-R, jak również w innych procesach apoptotycznych (Kaufmann,
1989; Kaufmann i wsp., 1993; Lazebnik i wsp., 1994) i jest wydajnie przecinana przez CPP32
(przedstawiciel rodziny proteaz CED3/ICE) i proteazy MACH.
Ponieważ Asp w pozycji Pi substratu wydaje się być ważny, tetrapeptydy mające Asp
jako czwartą resztę aminokwasową i różne kombinacje aminokwasów w pozycjach pierwszych trzech reszt m ogą być szybko testowane pod kątem wiązania do aktywnego miejsca dla
proteaz, stosując na przykład metodę opracowaną przez Geysena (Geysen, 1985; Geysen
i wsp., 1987), gdzie duża ilość peptydów na stałych nośnikach była testowana pod kątem specyficznych interakcji z przeciwciałami. Wiązanie proteaz MACH do specyficznych peptydów
może być wykryte za pom ocą różnych dobrze znanych metod detekcji, leżących w zakresie
umiejętności specjalistów, w tym znakowania radioaktywnego itp. Wykazano, że tą m etodą
Geysena można testować co najmniej 4000 peptydów w każdy dzień roboczy.
W podobny sposób można oznaczyć dokładne miejsce wiązania lub obszar homologii,
która określa interakcję między TRAF2 i NIK (lub dowolnym innym białkiem TRAF i białkiem wiążącym się z TRAF) i wówczas można testować peptydy, które mogą posłużyć do
blokowania tej interakcji, np. zsyntetyzowane peptydy mające sekwencję podobną do regionu
wiązania lub komplementarną do niego, która może współzawodniczyć z naturalną NIK (lub
białkiem wiążącym się z TRAF) o wiązanie się z TRAF2 (lub TRAF).
Ponieważ może być korzystne projektowanie inhibitorów peptydowych, które wybiórczo hamują oddziaływania TRAF2-NIK (lub TRAF-białko wiążące się z TRAF), bez negatywnego wpływu na procesy fizjologicznej śmierci komórki, w których biorą udział inni
przedstawiciele wewnątrzkomórkowego szlaku przekazywania sygnału, np. proteazy MACH
szlaku śmierci komórki, które są przedstawicielami rodziny proteaz CED3/ICE, pula peptydów wiążących się z TRAF2 (lub TRAF) lub NIK (lub białka wiążącego się z TRAF) w teście
takim, jak opisane powyżej, może być dalej zsyntetyzowana jako fluorogenny substrat peptyd
do testowania pod kątem selektywnego wiązania do takich innych białek w celu wybrania
tylko specyficznych dla TRAF2/NIK (lub TRAF/białko wiążące się z TRAF). Peptydy, co do
których stwierdzono, że są specyficzne w stosunku do, na przykład, TRAF2-NIK, mogą następnie być modyfikowane, aby wzmagać przepuszczalność komórek i hamować aktywność
TRAF i/lub NIK bądź odwracalnie, bądź nieodwracalnie. Thornberry i wsp. (1994) donieśli,
że tetrapeptyd (acyloksy)metyloketon Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH 2 0 C ( 0 )-[ 2 ,6 -(CF 3 )2 ]Ph był
silnym inaktywatorem ICE. Podobnie, Milligan i wsp. (1995) donieśli, że inhibitory tetrapeptydowe mające grupy chlorometyloketonowe (nieodwracalnie) lub aldehydowe (odwracalnie)
30
190 709
hamowały ICE. Dodatkowo, wykazano, że benzyloksykarboksylo-Asp-CF^OC (0)-2,6-dichlorobenzen (DCB) hamuje ICE (Mashima i wsp. 1995). Tak więc, w analogiczny sposób
tetrapeptydy, które mogą się selektywnie wiązać na przykład do TRAF2 lub NIK, mogą być
modyfikowane na przykład przy użyciu grupy aldehydowej, chlorometyloketonu, acyloksymetyloketonu lub grupy CH 2 OC (O)-DCB aby stworzyć inhibitor peptydowy aktywności
TRAF2-NIK. Co więcej, aby polepszyć przepuszczalność, peptydy mogą na przykład być modyfikowane chemicznie lub podstawione tak, aby zwiększyć ich przepuszczalność przez błonę
komórkową i ułatwić transport takich peptydów przez błonę i do cytoplazmy. Muranichi
i wsp. (1991) opisali podstwianie hormonu uwalniającego tyrotropinę kwasem laurowym
z utworzeniem lipofilowej laurylowej pochodnej z dobrą zdolnością penetracji przez błony
komórkowe. Zacharia i wsp. (1991) donieśli także o utlenianiu metioniny do sulfotlenku
i zastąpieniu wiązania peptydowego jego izoestrem ketometylenowym (COCH 2 ) aby ułatwić
transport peptydów przez błonę komórkową. To tylko niektóre ze znanych modyfikacji i pochodnych, które są w zakresie wiedzy osoby biegłej w tej dziedzinie.
Co więcej, leki lub inhibitory peptydowe, które są zdolne do hamowania aktywności na
przykład NIK poprzez hamowanie interakcji NIK-TRAF2 i podobnie, interakcji między
TRAF i białkami wiążącymi się z TRAF, m ogą być sprzęgane lub kompleksowane z cząsteczkami, które ułatwiają wchodzenie do komórki.
Patent USA 5149782 ujawnia sprzęganie cząsteczki, która ma być przeniesiona przez
błonę komórkową, z czynnikiem łączącym się z błonami, na przykład fuzogennymi polipeptydami, polipeptydami tworzącymi kanały jonowe, innymi polipeptydami błonowymi oraz
długołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi np. kwasem mirystylowym, kwasem palmitynowym. Te związki łączące z błonami wstawiają molekularne koniugaty do podwójnej warstwy
lipidów błon komórkowych i ułatwiają ich wejście do cytoplazmy.
Low i wsp., Patent USA 5108921, omawia dostępne metody dostarczania przez błonę
cząsteczek takich jak, między innymi, białka i kwasy nukleinowe, poprzez mechanizm aktywności endocytozy, w której pośredniczy receptor. Te systemy receptorów obejmują te, które
rozpoznają galaktozę, mannozę, mannozo- 6 -fosforan, transferrynę, asialoglikoproteinę, transkobalaminę (B 12 ), a - 2 makroglobuliny, insulinę i inne peptydowe czynniki wzrostowe, takie
jak nabłonkowy czynnik wzrostowy (EGF). Low i wsp. naucza, że receptory składników odżywczych, takie jak receptory dla biotyny i folianu, m ogą być korzystnie użyte dla wzmagania
transportu przez błonę komórkową ze względu na lokalizację i znaczną ilość receptorów biotyny i folianu na powierzchni błony większości komórek i związane z nimi procesy transportu
transmembranowego, w których pośredniczą związane receptory. Tak więc doprowadza się do
kontaktu kompleksu wytworzonego między związkiem, który ma być wprowadzony do cytoplazmy i ligandem, takim jak biotyna lub folian, z błoną komórkową niosącą receptory biotyny lub folianu aby zainicjować transport transbłonowy, w którym pośredniczy receptor i w ten
sposób umożliwić wejście pożądanego związku do komórki.
Wiadomo, że ICE ma zdolność do tolerowania wielu podstawień w pozycji P 2 i ta tolerancja na liczne substytucje została wykorzystana, aby opracować silny i wysoce specyficzny
znacznik powinowactwa zawierający biotynę (Thomberry i wsp., 1994). W konsekwencji pozycja P 2 jak również może N-koniec inhibitora tetrapeptydowego może być modyfikowany
lub podstawiany, tak jak przez dodatkek cząsteczki biotyny, aby wzmóc przenikanie tych
peptydowych inhibitorów przez błonę komórkową.
Dodatkowo, wiadomo w tej dziedzinie, że połączenie pożądanej sekwencji peptydowej
z sekwencją lidera/sygnałową aby stworzyć „peptyd hybrydowy” pozwoli takiemu „peptydowi
hybrydowemu” na transport przez błonę do cytoplazmy.
Będzie docenione przez osoby biegłe w dziedzinie peptydów, że inhibitory peptydowe
interakcji TRAF-białko wiążące się z TRAF, na przykład interakcji TRAF2-NIK według niniejszego wynalazku, ma obejmować leki lub inhibitory peptydomimetyczne, które mogą też
być szybko badane pod kątem na przykład wiązania się do TRAF2-NIK, aby ewentualnie zaplanować bardziej stabilne inhibitory.
Będzie też docenione, że te same sposoby ułatwiania lub wzmagania transportu peptydowych inhibitorów przez błonę komórkową, jak przedyskutowano powyżej, mogą też być
stosowane do samych białek wiążących się z TRAF, na przykład NIK, ich analogów, fragmen-
190 709
31
tów, lub jej izoform, ja k i innych peptydów, które mogą wywierać swoje efekty wewnątrzkomórkowo.
O
ile chodzi o tu wspomniane przeciwciała, określenie „przeciwciało” ma obejmować
przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklonalne (mAbs), przeciwciała-hybrydy, przeciwciała anty-idiotypowe (anty-Id) wobec przeciwciał, które m ogą być oznakowane w formie
rozpuszczalnej lub związanej, jak i ich fragmenty dostarczone za pomocą znanych technik,
takich jak, między innymi, cięcie enzymatyczne, synteza peptydu lub techniki rekombinacji.
Poliklonalne przeciwciała są heterogenną populacją cząsteczek przeciwciał pochodzących z surowic zwierząt immunizowanych antygenem. Monoklonalne przeciwciało zawiera
zasadniczo homogenną populację przeciwciał swoistych w stosunku do antygenów, która to
populacja ma zasadniczo podobne miejsca wiązania epitopów. Mabs m ogą być uzyskane za
pomocą metod znanych specjalistom. Patrz na przykład Kohler i Milstein, Nature, 256: 495-497
(1975); Patent USA N r 4376110; Ausubel i wsp., wyd., Harlow i Lane Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spm g Harbor Laboratory (1988); oraz Colligan i wsp., wyd., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing As-soc. and Wiley Interscience N.Y., (1992-1996),
których treść jest tu w łączona w całości w postaci odniesienia. Takie przeciwciała mogą być
z dowolnej klasy immunoglobulin w tym IgG, IgM, IgE, IgA, GILD i dowolnej ich podklasy.
Hybrydoma produkującą mAb według niniejszego wynalazku może być hodowana in vitro, in situ
lub in vivo. Produkcja wysokiego miana przeciwciał mAb in vitro lub in situ sprawia, że jest
to obecnie preferowana metoda produkcji.
Hybrydowe przeciwciała są cząsteczkami, których różne części pochodzą z różnych gatunków zwierząt, jak takie, które mają region zmienny pochodzący z mysiego mAb i region
stały ludzkiej immunoglobuliny. Hybrydowe przeciwciała są przede wszystkim stosowane,
aby zmniejszyć immunogenność w stosowaniu i zwiększyć wydajności produkcji, na przykład
gdy mysie mAbs dają w yższą wydajność z hybrydom, ale w yższą immunogenność u ludzi, tak
że stosuje się hybrydowe mAbs ludzkie/mysie. Hybrydowe przeciwciała i metody ich wytwarzania są znane w dziedzinie (Cabilly i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277
(1984); Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne i wsp.,
Nature 312: 643-646 (1984); Cabilly i wsp., europejskie zgłoszenie patentowe 125023 (opublikowane 14 listopada, 1984); Neuberger i wsp., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi
i wsp., europejskie zgłoszenie patentowe 171496 (opublikowane 19 lutego, 1985); M orrison
i wsp., europejskie zgłoszenie patentowe 173494 (opublikowane 5 marca, 1986); Neuberger
i wsp., zgłoszenie PCT WO 8601533, (opublikowane 13 marca, 1986); Kudo i wsp., europejskie zgłoszenie patentowe 184187 (opublikowane 11 czerwca, 1986); Sahagan i wsp., J. Im munol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson i wsp., międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr
WO 8702671 (opublikowane 7 maja,1987); Liu i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 3439-3443
(1987); Sun i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 214-218 (1987); Better i wsp., Science
240:1041-1043 (1988); oraz Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, jak wyżej. Te
odnośniki są tu włączone w całości w formie odniesienia.
Anty-idiotypowe (anty-Id) przeciwciało jest przeciwciałem, które rozpoznaje unikalne
determinanty na ogół związane z miejscem wiązania antygenu przeciwciała. Przeciwciało Id
może być przygotowane przez immunizację zwierzęcia tego samego gatunku i genetycznego
typu (np. szczep myszy) co źródło mAb, na który jest przygotowywany anty-Id. Immunizowane zwierzę rozpozna i zareaguje na idiotypowe determinanty immunizującego przeciwciała
przez wytworzenie przeciw ciała na te idiotypowe determinanty (przeciwciało anty-Id). Patrz
na przykład Patent U SA N r 4699880, który jest tu w całości włączony w formie odniesienia.
Przeciwciało anty-Id może też być użyte jako „immunogen” w celu indukowania odpowiedzi immunologicznej w jeszcze innym zwierzęciu, dając tak zwane przeciwciało antyanty-Id. Anty-anty-Id m oże być epitopowo identyczne z oryginalnym mAb, które indukowało
anty-Id. Tak więc przez stosowanie przeciwciał na idiotypowe determinanty mAb jest m ożliwa identyfikacja innych klonów wyrażających przeciwciała o identycznej specyficzności.
Tak więc mAb wytwarzane przeciw białkom wiążącym się z TRAF, analogom, fragmentom lub pochodnym (np. NIK, jego izoformy, analogi, fragmenty lub pochodne) według niniejszego wynalazku m ogą być wykorzystane do indukowania przeciwciał anty-Id u stosowanych zwierząt, takich ja k myszy BALB/c. Komórki śledziony z takich immunizowanych my-
32
190 709
szy są stosowane do produkowania hybrydom anty-Id wydzielających mAbs anty-Id. Co więcej, mAbs anty-Id mogą być sprzęgane z nośnikiem, takim jak hemocyjanina skałoczepu
(KLH) i użyte do immunizacji dodatkowych myszy BALB/c. Surowice z tych myszy będą
zawierać przeciwciała anty-anty Id, które m ają zdolności wiążące oryginalnego mAb specyficznego dla epitopu powyższego białka wiążącego się z TRAF lub jego analogów, fragmentów i pochodnych.
Tak więc mAbs anty-Id m ają swoje własne epitopy anty-idiotypowe, lub „idiotopy”
strukturalnie podobne do oznaczanego epitopu, takie jak GRB białko a.
Określenie „przeciwciało” ma także obejmować obie nienaruszone cząsteczki, jak i ich
fragmenty, takie jak na przykład Fab i F(ab')z, które są zdolne do wiązania antygenu. Fragmenty Fab i F(ab ' ) 2 pozbawione fragmentu Fc nienaruszonego przeciwciała są łatwiej usuwane
z krwiobiegu i mogą wykazywać mniej niespecyficznego wiązania do tkanek niż nienaruszone
przeciwciało (Wahl i wsp., J. Nuci. Med. 24:316-325(1983)).
Będzie docenione, że fragmenty Fab i F(ab ') 2 i inne fragmenty przeciwciał pożyteczne
w niniejszym wynalazku mogą być użyte do detekcji i określenia ilości białka wiążącego się
TRAF według metod tu ujawnionych dla nienaruszonych cząsteczek przeciwciała. Takie
fragmenty są typowo wytwarzane przez cięcie proteolityczne, przy zastosowaniu enzymów
takich jak papaina (aby wyprodukować fragmenty Fab) lub trypsyna (aby wyprodukować
fragmenty F(ab')2 ).
Mówi się, że przeciwciało jest „zdolne do wiązania” cząsteczki, jeśli jest zdolne do specyficznej reakcji z cząsteczką, wiążąc ten sposób cząsteczkę z przeciwciałem. Określenie
„epitop” oznacza tę część cząsteczki zdolną do wiązania z przeciwciałem, która może być też
rozpoznawana przez to przeciwciało. Epitopy, lub „antygenowe determinanty” na ogół składają się z chemicznie czynnych ugrupowań powierzchniowych cząsteczek, takich jak aminokwasy lub boczne łańcuchy cukrowe i m ają specyficzne trójwymiarowe strukturalne cechy,
takie jak specyficzne własności ładunku.
„Antygen” jest cząsteczką lub częścią cząsteczki zdolną do bycia wiązaną przez przeciwciało, która dodatkowo jest zdolna do indukowania zwierzęcia do wytwarzania przeciwciała zdolnego do wiązania się do epitopu tego antygenu. Antygen może mieć jeden lub więcej
niż jeden epitop. Specyficzna reakcja, do której jest odniesienie powyżej ma oznaczać, że antygen będzie reagował w sposób wysoce wybiórczy z odpowiednim przeciwciałem, a nie
z licznymi innymi przeciwciałami, które mogą być wywoływane przez inne antygeny.
Przeciwciała, w tym fragmenty przeciwciał przydatne w niniejszym wynalazku mogą
być użyte w celu ilościowego lub jakościowego wykrywania białka wiążącego się z TRAF
(np. NIK) w próbce lub aby wykryć obecność komórek, które wyrażają białko wiążące się
z TRAF według niniejszego wynalazku. Może to być uzyskane za pom ocą technik immunofluorescencyjnych stosujących przeciwciało znakowane fluorescencyjnie (patrz poniżej)
w połączeniu z detekcją w mikroskopie świetlnym, za pom ocą cytometrii przepływowej lub
fluorometrii.
Przeciwciała (lub ich fragmenty) przydatne w niniejszym wynalazku mogą być stosowane histologicznie, jak w mikroskopii immunofluorescencyjnej lub immunoelektronowej, do
detekcji in situ białka wiążącego się z TRAF według niniejszego wynalazku. Detekcja in situ
może być uzyskana przez pobranie próbki histologicznej od pacjenta i dostarczenie znakowanego przeciwciała według niniejszego wynalazku do takiej próbki. Przeciwciało (lub fragment) jest korzystnie dostarczane przez zastosowanie lub nałożenie znakowanego przeciwciała (lub fragmentu) na próbkę biologiczną. Przez użycie takiej procedury jest możliwe określenie nie tylko obecności białka wiążącego TRAF, ale jego rozkładu w badanej tkance. Stosując
niniejszy wynalazek osoby o przeciętnych umiejętnościach łatwo zauważą, że każda z szerokiego zakresu metod histologicznych (takich jak metody barwienia) może być tak zmodyfikowana, aby uzyskać taką detekcję in situ.
Takie oznaczenia białka wiążącego się z TRAF według niniejszego wynalazku typowo
obejmuje inkubację próbki biologicznej, takiej jak płyn biologiczny, ekstrakt tkankowy, świeżo zebrane komórki, takie jak limfocyty lub leukocyty lub komórki, które były inkubowane
w hodowli tkankowej, w obecności wykrywalnie znakowanego przeciwciała zdolnego do
190 709
33
identyfikacji białka wiążącego się z TRAF i wykrywanie przeciwciała przez dowolną z szeregu technik dobrze znanych w tej dziedzinie.
Próbka biologiczna może być traktowana podłożem w fazie stałej lub nośnikiem, takimi
jak nitroceluloza lub inne stałe podłoże lub nośnik, które są zdolne do immobilizacji komórek, części komórek lub białek rozpuszczalnych. Podłoże lub nośnik m ogą być potem odmyte
odpowiednimi buforami, a następnie zachodzi traktowanie wykrywalnie znakowanym przeciwciałem zgodnie z niniejszym wynalazkiem, jak opisano powyżej. Podłoże lub nośnik fazy
stałej m ogą być wówczas przepłukane buforem drugi raz, aby usunąć niezwiązane przeciwciało. Ilość związanego znacznika na tym stałym podłożu lub nośniku może być wtedy wykryta
za pomocą konwencjonalnych sposobów.
Przez „podłoże w fazie stałej”, „nośnik w fazie stałej”, „stałe podłoże”, „stały nośnik”,
„podłoże” lub „nośnik” rozumie się każde podłoże lub nośnik zdolne do wiązania antygenu
lub przeciwciał. Dobrze znane podłoża lub nośniki obejmują szkło, polistyren, polipropylen,
polietylen, dekstran, amylazy nylonowe, naturalne i modyfikowane celulozy, poliakryloamidy, gabros i magnetyty. Natura nośnika może być albo rozpuszczalna w pewnym stopniu
albo nierozpuszczalna dla celów niniejszego wynalazku. Materiał podłoża może mieć wirtualnie każdą możliwą strukturalną konfigurację, o ile połączona cząsteczka jest zdolna do wiązania do antygenu lub przeciwciała. Tak więc konfiguracja podłoża lub nośnika może być sferyczna, jak w paciorku, cylindryczna, jak w wewnętrznej powierzchni probówki, lub zewnętrznej powierzchni bagietki. Odmiennie, powierzchnia może być płaska, taka jak arkusz,
testowy pasek itp. Korzystne podłoża lub nośniki obejmują paciorki polistyrenowe. Osoby
biegłe w dziedzinie będą znały wiele innych odpowiednich nośników do wiązania przeciwciała lub antygenu albo będą w stanie ustalić to za pomocą rutynowych doświadczeń.
Aktywność wiążąca danej partii przeciwciał według wynalazku, jak zanotowano powyżej, może być określona za pom ocą dobrze znanych metod. Osoby biegłe w dziedzinie będą
zdolne do określenia operacyjnych i optymalnych warunków oznaczenia dla każdego oznaczenia przez stosowanie rutynowych eksperymentów.
Inne etapy takie jak płukanie, mieszanie, wytrząsanie, sączenie i tym podobne mogą być
dodane do oznaczeń, jak jest w zwyczaju lub z konieczności w danej sytuacji.
Inny ze sposobów, za pomocą którego przeciwciało według niniejszego wynalazku m oże być wykrywalnie wyznakowane, jest przez połączenie go z enzymem i zastosowanie
w enzymatycznym oznaczeniu immunologicznym (EIA). Enzym z kolei, gdy jest później eksponowany wobec odpowiedniego substratu, będzie reagował z substratem w taki sposób, aby
wytworzyć resztę chemiczną, która może być wykryta na przykład za pom ocą sposobów spektrometrycznych, fluorometrycznych lub wzrokowych. Enzymy, które mogą być stosowane do
znakowania przeciwciała w sposób wykrywalny obejmują, miedzy innymi, dehydrogenazę
jabłczanową, nukleazę gronkowców, izomerazę delta-5-steroidu, dehydrogenazę alkoholową
drożdży, dehydrogenazę alfa glicerolofosforanu, izmomerazę triozofosforanu, peroksydazę
z chrzanu, fosfatazę alkaliczną, asparaginazę, oksydazę glukozy, betagalaktozydazę, rybonukleazę, ureazę, katalazę, dehydrogenazę glikozo- 6 -fosforanu, glukoamylazę i esterazę actylocholiny. Detekcja może być uzyskana przez wzrokowe porównanie stopnia reakcji enzymatycznej substratu w porównaniu z podobnie przygotowywanymi standardami.
Detekcje można uzyskać stosując dowolne z różnych innych oznaczeń immunologicznych. N a przykład za pom ocą radioaktywnego znakowania przeciwciał lub fragmentów przeciwciał możliwe jest wykrycie R-PTPazy przy zastosowaniu oznaczenia radioimmunologicznego (RIA). Dobiy opis RIA można znaleźć w Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, T.S. Work i wsp., North Holland Publishing Company, NY (1978) ze szczególnym odniesieniem do rozdziału pod tytułem „An Introduction to Radioimmune Assay and
Related Techniques” autor T. Chard, włączonego tu w postaci odniesienia. Izotop radioaktywny może być wykryty za pomocą takich sposobów, jak licznik g, licznik scyntylacyjny lub
autoradiografia.
Jest też możliwe wyznakowanie przeciwciała w zgodzie z niniejszym wynalazkiem
związkiem fluorescencyjnym. Gdy fluorescencyjnie znakowane przeciwciało jest wystawione
na światło o odpowiedniej długości fali, jego obecność może być wykryta za pomocą fluorescencji. W śród najczęściej stosowanych związków fluorescencyjnych do znakowania są izo-
34
190 709
tiocyjanian fluoresceiny, rodamina, fikoerytryna, pikocyjanian, allofikocyjanian, aldehyd ofitalowy i fluorescamina.
Przeciwciało może też być wyznakowane w sposób wykrywalny przy zastosowaniu metali emitujących fluorescencję, takich jak 153E lub innych z serii lantanowców. Te metale mogą
być dołączone do przeciwciała, przy zastosowaniu takich grup chelatujących metal, jak kwas
dietylenotriaminopentaoctowy (ETPA).
Przeciwciało może też być wykrywalnie wyznakowane poprzez połączenie go ze związkiem chemiluminescencyjnym. Obecność przeciwciała wyznakowanego chemiluminescencyjnie jest potem oznaczana poprzez wykrywanie obecności luminescencji, która pojawia się
w trakcie reakcji chemicznej. Przykłady szczególnie użytecznych związków chemiluminescencyjnych do znakowania to: luminol, izoluminol, teromatyczny ester akrydyny, imidazol,
sól akrydynowa i ester szczawiowy.
Podobnie, związek bioluminescencyjny może być użyty do wyznakowania przeciwciała
według niniejszego wynalazku. Bioluminescencja jest typem chemiluminescencji spotykanym
w systemach biologicznych, w których białko katalityczne zwiększa skuteczność reakcji chemiluminescencyjnej. Obecność białka bioluminescencyjnego jest oznaczana przez wykrywanie obecności luminescencji. Ważne związki bioluminescencyjne do znakowania to lucyferyna, lucyferaza i aekworyna.
Cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku może być przystosowana do
użycia w oznaczeniu immunometrycznym, znanym także jako oznaczenie „dwumiejscowe”
lub typu „kanapka” . W typowym oznaczeniu immunometrycznym, pewna ilość nieznakowanego przeciwciała (lub fragmentu przeciwciała) jest wiązana ze stałym podłożem lub nośnikiem i pewna ilość wykrywalnie znakowanego rozpuszczalnego przeciwciała jest dodawana
w celu umożliwienia detekcji i/lub jakościowego oznaczenia kompleksu trójskładnikowego
wytworzonego przez przeciwciało w fazie stałej, antygen i wyznakowane przeciwciało.
Typowe i korzystne oznaczenia immunometiyczne obejmują oznaczenia „w przód”, w których przeciwciało związane z fazą stałą jest najpierw kontaktowane z badaną próbą, aby wyekstrahować antygen z próbki przez stworzenie dwuskładnikowego kompleksu przeciwciało
w fazie stałej-antygen. Po odpowiednim okresie inkubacji stałe podłoże lub nośnik odmywa
się, aby usunąć resztkę płynnej próby, w tym nieprzereagowanego antygenu, o ile takowy jest
obecny, a następnie kontaktowanie z roztworem zawierającym nieznaną ilość znakowanego
przeciwciała, (które działa jako cząsteczka „wskaźnikowa”). Po drugim okresie inkubacji, aby
pozwolić wyznakowanemu przeciwciału na skompleksowanie z przeciwciałem związanym ze
stałym podłożem lub nośnikiem poprzez nieoznakowane przeciwciało, stałe podłoże lub nośnik są przepłukiwane drugi raz, aby usunąć nieprzereagowane oznakowane przeciwciało.
W innym typie oznaczenia typu „kanapka”, które może także być użyteczne z antygenami według niniejszego wynalazku stosowane są tak zwane oznaczenia „równoczesne”
i „odwróconym”. Oznaczenie równoczesne obejmuje pojedynczy etap inkubacji, jako że przeciwciało związane ze stałym podłożem lub nośnikiem i oznakowane przeciwciało są razem
dodawane do badanej próbki w tym samym momencie. Po zakończeniu inkubacji stałe podłoże lub nośnik płucze się, aby usunąć resztę płynnej próby i nie skompleksowane wyznakowane przeciwciało. Obecność wyznakowanego przeciwciała związanego z podłożem stałym lub
nośnikiem można następnie oznaczyć, jak w konwencjonalnym teście kanapkowym „w przód”.
W teście „odwróconym” stosuje się stopniowe dodawanie do płynnej próbki roztworu
pierwszego przeciwciała, po czym, po odpowiednim okresie czasu dodaje się nie wyznakowane przeciwciała związane ze stałym podłożem lub nośnikiem. Po drugiej inkubacji fazę stałą
odpukuje się w konwencjonalny sposób w celu pozbycia się resztek testowanej próbki i roztworu nieprzereagowanych wyznakowanych przeciwciał. Następnie przeprowadza się oznaczenie wyznakowanego przeciwciała związanego ze stałym podłożem lub nośnikiem jak
w testach „równoczesnych” i „w przód”.
Jak wspomniano powyżej, niniejszy wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznych zawierających zwierzęcy wektor wirusowy kodujący białko wiążące się z TRAF,
przy czym wektor koduje również powierzchniowe białko wirusowe zdolne do wiązania się
z białkami powierzchniowymi komórki docelowej (np. komórek nowotworowych) w celu
kierowania wprowadzeniem sekwencji białka wiążącego się z TRAF do komórek. Dalsze
190 709
35
kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają jako składnik aktywny a) sekwencję oligonukleotydową kodującą sekwencję antysensowną w stosunku do sekwencji białka
wiążącego się z TRAF lub b) leki, które blokują oddziaływania TRAF z białkiem wiążącym
się z TRAF.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają wystarczającą ilość aktywnego składnika, aby osiągnąć zamierzony skutek. Dodatkowo, kompozycje farmaceutyczne
mogą zawierać odpowiednie farmaceutycznie akceptowalne nośniki, zawierające zaróbkę i substancje wspomagające, które ułatwiają przekształcenie aktywnych związków w preparaty, które mogą być stosowane farmaceutycznie i które mogą stabilizować takie preparaty do podawanie osobom potrzebującym, co jest dobrze znane biegłym w tej dziedzinie.
Istnieje podejrzenie, że białko wiążące się z TRAF oraz jego izoformy łub izotypy są
wyrażane w różnych tkankach na znacząco różniących się poziomach, a również z różniącym
się wzorem izotypów, w analogiczny sposób jak ekspresja różnych innych białek zaangażowanych w wewnątrzkomórkowe przekazywanie sygnałów, jak wskazano w wymienionych
powyżej stanowiących współwłasność i równocześnie biegnących zgłoszeniach patentowych.
Różnice te być m ogą mieć udział w tkankowo-specyficznym charakterze odpowiedzi na ligand Fas/APOl i TNF. Jak w przypadku innych homologów CED3/ICE (Wang i wsp., 1994;
Alnemri i wsp., 1995), obecni wynalazcy pokazali uprzednio (we wspomnianych powyżej
zgłoszeniach patentowych), że izoformy MASH, które zawierają niekompletne regiony
CED3/ICE (np. MASHa3) wykazują działanie hamujące na aktywność równolegle wyrażanych cząsteczek M A SH al lub MASHa2; stwierdzono również że blokują one indukcję śmierci przez Fas/APOl i p55-R. Ekspresja takich hamujących izoform w komórce może stanowić
mechanizm komórkowej samoobrony przed cytotoksycznością, w której uczestniczy
Fas/APOl i TNF. Duża heterogenność izoform MASH, która znacznie przekracza obserwowaną dla innych proteaz z rodziny CED3/ICE, powinna umożliwiać szczególnie subtelne m odulowanie funkcji aktywnych izoform MASH.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem wyizolowano również analogi/muteiny jednego
z białek wiążących się z TRAF, a mianowicie białka wiążącego się z TRAF2, NIK. Te analogi/muteiny NIK (patrz powyżej i patrz przykłady poniżej) są inhibitorami dla indukcji aktywacji NF-KB, w której pośredniczy NIK, jak również inhibitorami tej indukcji, w której pośredniczy receptor TNF, receptor Fas/APOl, spokrewnione z nimi białka, receptor IL-1 i inne
czynniki. A zatem, jak zaznaczono powyżej, białka wiążące się z TRAF lub ich możliwe izoformy
mogą mieć zmienne działanie w różnych tkankach w odniesieniu do ich oddziaływania z białkami TRAF i ich wpływu wywieranego w związku z tym na aktywność białek TRAF lub w ewnątrzkomórkowe przekazywanie sygnałów, w którym pośredniczą białka TRAF.
Jest również możliwe, że niektóre z możliwych izoform białka wiążącego się z TRAF
spełniają inne funkcje. Przykładowo, NIK i pewne analogi lub izoformy NIK mogą również
działać jako miejsca zakotwiczenia dla cząsteczek, które m ają udział w innych niecytotoksycznych działaniach, przykładowo, receptorów Fas/APOl i TNF poprzez oddziaływanie
z TRAF2 lub nawet niezależnie od TRAF2.
N a skutek wyjątkowej zdolności receptorów Fas/APOl i TNF do powodowania śmierci
komórki, jak również zdolności receptorów TNF do włączania innych aktywności uszkadzających tkankę, nieprawidłowości w funkcjonowaniu tych receptorów będą szczególnie szkodliwe dla organizmu. Rzeczywiście, wykazano, że zarówno nadmiar, jak i wadliwe funkcjonowanie tych receptorów m a swój udział w patologicznych objawach różnych chorób (Vassalli,
1992; Nagata i Golstein, 1995). Zidentyfikowanie cząsteczek, które uczestniczą w aktywności
przekazywania sygnałów tych receptorów i znalezienie sposobów modulowania aktywności
tych cząsteczek mogłoby prowadzić bezpośrednio do nowych podejść terapeutycznych.
W świetle podejrzewanej ważnej roli białek TRAF, np. TRAF2, a zatem TRAF-białko w iążące się z TRAF, np. oddziaływań TRAF2-NIK przy aktywacji NF-KB, w której pośredniczy
Fas/APOl i TNF, wydaje się szczególnie ważne zaprojektowanie lekarstw, które blokują oddziaływanie TRAF-białko wiążące się z TRAF, np. oddziaływań TRAF2-NIK, kiedy pożądane
jest zabijanie komórek (poprzez hamowanie aktywacji NF-KB) i przeciwnie, kiedy pożądane
jest zachowanie komórek, to oddziaływanie powinno być wzmocnione (dla zwiększenia aktywacji NF-KB).
36
190 709
Niniejszy wynalazek dotyczy również białek lub innych ligandów, które mogą wiązać
się z białkami wiążącymi się z TRAF według wynalazku i w ten sposób modelować/pośredniczyć w aktywności białek wiążących się z TRAF. Takich białek lub ligandów
można poszukiwać, izolować i wytwarzać dowolną z powyżej wspomnianych metod. Przykładowo, można izolować szereg nowych ligandów, włączając w to białka zdolne do wiązania
się z białkami NIK według wynalazku (z wyłączeniem spośród takich nowych białek/ligandów
znanego TRAF2 i prawdopodobnie I-kB, jeżeli NIK rzeczywiście wiąże się z I-kB).
Jak przedstawiono szczegółowo poniżej, takie nowe białka/ligandy, wiążące się z białkami wiążącymi się z TRAF, np. białka wiążące się z NIK, mogą służyć jako, przykładowo,
inhibitory lub wzmacniacze aktywności, w której pośredniczy NIK lub aktywności, w której
pośredniczy, przykładowo, oddziaływanie TRAF2-NEK i jako takie będą miały ważną rolę
w różnych stanach patologicznych i innych sytuacjach, jak opisano szczegółowo poniżej. Inną
funkcją takich nowych białek/ligandów, wiążących się z białkami wiążącymi się z TRAF, byłoby pełnienie funkcji specyficznych czynników do oczyszczania białek wiążących się z TRAF
poprzez, przykładowo, chromatografię powinowactwa, gdzie te nowe białka/ligandy są przytwierdzone do odpowiednich podłóż chromatograficznych z utworzeniem podłoża/matrycy
stałego lub powinowactwa, przez który będzie przechodzić roztwór, ekstrakt lub temu podobne, zawierający białka wiążące się z TRAF, np. NIK, ułatwiając w ten sposób ich oczyszczenie. Takie metody chromatografii powinowactwa są dobrze znanymi i generalnie standardowymi procedurami w tej dziedzinie.
Podobnie, wszystkie wspomniane powyżej białka wiążące się z TRAF, analogi, fragmenty, izoformy lub pochodne według niniejszego wynalazku można zastosować do oczyszczenia poprzez chromatografię powinowactwa różnych białek TRAF, do których się wiążą.
Przykładowo, białka wiążące się z TRAF2, jak NIK, jej analogi, fragmenty i muteiny NIK
(patrz przykłady poniżej) można stosować do oczyszczania TRAF2 poprzez chromatografię
powinowactwa. A zatem w ten sam sposób jak białko NIK, można izolować i wytwarzać analogi/muteiny według niniejszego wynalazku (patrz przykłady poniżej) przy zastosowaniu metod i dowolnych innych ekwiwalentnych metod oczywistych dla biegłych w tej dziedzinie (jak
przedstawiono szczegółowo powyżej), jak również można identyfikować i wytwarzać dowolne inne białka wiążące się z TRAF2. Takie metody identyfikacji i wytwarzania tych białek
wiążących się z TRAF, np. białek wiążących się z TRAF2, będą obejmować etap przeszukiwania, w którym białko TRAF (np. TFLAF2) lub co najmniej jego specyficzna część (np. część
TRAF2 pomiędzy aminokwasami 222-501) stosuje się jako substrat lub „przynętę” do otrzymania białek lub innych ligandów zdolnych do wiązanie się z nim; po czym następują etapy
identyfikacji i charakteryzowania takich białek/ligandów otrzymanych w ten sposób; i wreszcie wytworzenie takich białek /ligandów w zasadniczo wyizolowanej i oczyszczonej postaci.
Wszystkie te etapy są dobrze znane biegłym w tej dziedzinie i przedstawione tu szczegółowo
powyżej i poniżej.
Wynalazek będzie teraz opisany bardziej szczegółowo w następujących nie-ograniczających przykładach i towarzyszących im rysunkach:
Należy również zaznaczyć, że procedury:
i) przeszukiwania dwuhybiydowago i dwuhybrydowy test na ekspresję b-galaktozydazy; (ii)
indukowanej ekspresji, metabolicznego znakowania i immunoprecypitacji białek; (iii) wiązania in vitro; (iv) pomiaru cytotoksyczności oraz (v) analizy Northern i sekwencji, jak również inne
procedury zastosowane w następujących dalej przykładach zostały szczegółowo opisane w poprzednich publikacjach przez obecnych wynalazców w odniesieniu do innych białek i szlaków
przenoszących sygnały wewnątrzkomórkowe (patrz przykładowo, Boldin i wsp., 1995a, 1995b,
oraz Boldin i wsp. 1996). Procedury te pojawiają się również szczegółowo w będących współwłasnością równocześnie biegnących zgłoszeniach izraelskich nr 114615, 114986, 115319, 116588,
117932 i 120367, jak również odpowiadającym im zgłoszeniu P C TN r PCT/US96/10521. A zatem
pełne ujawnienia wszystkich tych publikacji i zgłoszeń patentowych są tu włączone w całości
i w co najmniej takim zakresie, który wyznaczają szczegółowe procedury eksperymentalne.
Przykłady
Materiał i Metody
i) biblioteki cDNA
190 709
37
a) biblioteka cDNA z limfocytów B
Użyto bibliotekę skonstruowaną z zastosowaniem oligo dT z ludzkich limfocytów B
(Durfee i wsp., 1993). cDNA z biblioteki wstawiono w miejsce XhoI wektora pSE1107, na
bazie pACT, jako fuzja z domeną aktywacyjną GAL4.
b) biblioteka cDNA z jąder w λgt10
Użyto bibliotekę cDNA z ludzkich jąder. Biblioteka zawierająca wstawki o średniej wielkości od 200 do 400 bp została utworzona z zastosowaniem losowych heksanukleotydów.
ii) Szczepy drożdży
Dwa szczepy drożdży zastosowano jako szczepy gospodarzy do transformacji i poszukiwań: szczep HF7c, który użyto w teście dwuhybrydowym i szczep SFYS26, który użyto
w testach na b-galaktozydazę. Obydwa szczepy niosą auksotroficzne markery trp l i leu2,
a mianowicie szczepy drożdży nie mogą rosnąć na syntetycznym podłożu bez tryptofanu i leucyny o ile nie są transformowane plazmidem przenoszącym dziką wersję tych genów (TRP1,
LEU2). Dwa szczepy drożdży niosą mutacje delecyjne w genach GAL4 i GAL80 (mutacje
g a l4-542 i gal 80-538, odpowiednio).
Szczepy SFY526 i HF7c zawierają wskaźnik lacZ w swoich genotypach: w szczepie
SFY526 przyłączony do odcinka UAS i TATA promotora G ALI, w HF7c do lacZ są dołączone trzy kopie 17-merowej sekwencji największej zgodności GAL4 i odcinek TATA promotora
CYC1. Zarówno UAS G A L1, jak i 17-mery GAL4 odpowiadają na aktywator transkrypcyjny
GAL4. Dodatkowo, szczep HF7c niesie wskaźnik HIS3 dołączony do UAS i odcinka TATA
promotora GAL1.
iii) Klonowanie ludzkiego TRAF2
Ludzki TRAF2 sklonowano poprzez PGR z biblioteki cDNA z HL60 (sekwencja TRAF2
i inne szczegóły patrz Rothe i wsp., 1994; Rothe i wsp., 1995a; Cheng i wsp., 1996; Hsu i wsp.,
1996; i Waliach, 1996). Zastosowanymi starterami były: a) starter lewy - 30-mer CAGGATCCT
ATGGCTGCAGCTAGCGTGAC odpowiadający sekwencji kodującej hTRAF2 rozpoczynającej
się od kodonu dla pierwszej metioniny (podkreślona) i obejmującej łącznik z miejscem BamHI; b)
starter lewy - 32-mer GGTCGACTTAGAGCCCTGTCAGGTCCACAATG, który obejmuje kodon stop hTRAF2 (podkreślony) i miejsce restrykcyjne Sali w łączniku. Program PCR obejmował
początkowy etap denaturacji 2 min. w 94°C, a następnie 30 cykli: 1 min. w 94°C, 1 min. W 64°C,
1 min. i 40 sek. w 72°C. Powielony ludzki TRAF2 wstawiono następnie w m iejsca BamHI Sali wektora pGBT9, łącząc go z domeną wiążą się z DNA GAL4.
iv) Przeszukiwanie biblioteki z limfocytów B testem dwuhybrydowym
Test dwuhybrydowy jest techniką (patrz szczegóły w powyżej wspomnianych publikacjach i zgłoszeniach patentowych) zastosowaną w celu zidentyfikowania czynników, które są
związane z konkretnymi cząsteczkami, które służą jako przynęta. W niniejszym wynalazku
TRAF2, który był sklonowany w wektorze pGBT9, służył jako przynęta. TRAF2 wyrażano
równocześnie z przeszukiwaną biblioteką cDNA z limfocytów B w szczepie drożdży HF7c.
TRAF2, sklonowany poprzez PCR, stanowił rekombinowaną fuzję z dom eną wiążącą się
z DNA GAL4, a przeszukiwana biblioteka cDNA była dołączona do domeny aktywacyjnej
GAL4 w wektorze pSE1107. Genem wskaźnikowym w HF7c był HIS3, dołączony do sekwencji aktywacyjnej 5' (UAS) w promotorze GAL1, który daje podpowiedź na aktywator
transkrypcyjny GAL4. Transformanty, które zawierały zarówno plazmid pGBT9, jak i pS E 1,
były selekcjonowane pod kątem wzrostu na podłożu bez tryptofanu i leucyny. W drugim etapie klony pozytywne, które wyrażały białka dwuhybrydowe, które wzajemnie ze sobą oddziaływały, a zatem aktywowały GAL1-HIS3, pobierano z płytek bez tryptofanu, leucyny i histydyny, a zawierających 50 mM 3-aminotriazol (3AT).
v) Test na b-galaktozydazę
Klony pozytywne pobrane w teście dwuhybrydowym poddano testowi barwnemu na lacZ
w komórkach drożdży SFYS26, zgodnie z instrukcją Clontech Laboratories (dla szczegółów, patrz
powyżej wspomniane publikacje i zgłoszenia patentowe). Pokrótce, transformantom umożliwiono
wzrost w 30°C przez 2-4 dni do osiągnięcia średnicy około 2 mm, a następnie przenoszono na
filtry Whatman. Filtry poddano zamrażaniu i rozmrażaniu w celu permabilizacji, a następnie m oczono w buforze (16,1 mg/ml N a 2 HP 0 4 7 Hz0 ; 5,5 mg/ml N a 2 H P 0 4 H 2 0 ; 0,75 mg/ml K C l;
0,75 mg/ml MgSO4 i 7H 2 O , pH=7), zawierającym 0,33 mg/ml X-gal i 0,35 mM β-merkaptoeta-
38
190 709
nol. Kolonie obserwowano pod kątem pojawienia się niebieskiego koloru, który jest wskaźnikiem
indukcji β-galaktozydazy.
vi) Ekspresja sklonowanego cDNAs
Skonstruowano dwa rodzaje wektorów ekspresyjnych:
a) wektory oparte o pUHD10-3 zawierające otwartą ramkę odczytu (ORF) klonu 9, 10
lub 15 połączoną z epitopem hemaglutyniny.
b) wektory oparte o pUHD10-3, do których została wstawiona sekwencja oktapeptydu
FLAG tuż przed sklonowanym TRAF2, nazwane zatem FLAGB6/TRAF2.
Konstrukty zawierające ORF klonów 9, 10 lub 15 transfekowano do komórek HeLa-Bujard
(dla tych komórek patrz Gossen, M. i Bujard, M. (1992)) same lub kotransfekowane z FLAGB6/TRAF2 przy zastosowaniu standardowej metody wapniowo-fosforanowej (metoda, przykładowo, w Current Protocols in Molecular Biology, wyd. Ausubel, F.M i wsp.).
vii) Test na lucyferazę
Typowo, 5x10 transfekowanych komórek zbierano poprzez trzykrotne przemywanie
zimnym PBS i zawieszano ponownie w 400 μl buforu do ekstrakcji (0,1 M K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4
pH=7,8; 1 mM DTT). Lizę komórek uzyskiwano poprzez trzykrotne zamrażanie w ciekłym
azocie i rozmrażanie. Resztki komórek usuwano poprzez wirowanie (5 min. przy 10000 x g).
W celu wykonania testu na lucyferazę, dodawano 200 μl buforu do lucyferazy (25 mM glicyloglicyna, 15 mM K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 , pH=7,8, 15 mM M gSO4, 4 mM EGTA, 2 mM ATP, 1 mM
DTT) do 50 μl lizatu. Następnie do reakcji dodawano 100 μl 0,2 mM D-lucyferyny, 25 mM
glicyloglicyny, 1 mM DTT. Aktywność lucyferazy oznaczano poprzez odczyt emisji światła
przy zastosowaniu zestawu lumenometrycznego.
Lumitron przy integracji 10 sekund (patrz powyższe publikacje i zgłoszenia patentowe
dla dodatkowych szczegółów).
Przykład 1
Klonowanie nowych klonów 9, 10 i 15
Bibliotekę cDNA przygotowaną z komórek-B przeszukiwano pod kątem białek, które
łączą się z TRAF2 przy zastosowaniu techniki dwuhybrydowej, jak opisano w Materiałach
i Metodach (iv). Jedynie u transformantów, w których następowała ekspresja zarówno
TRAF2, jak i białka zdolnego do oddziaływania z nim, domena wiążąca DNA GAL4 i domena transaktywacji transkrypcji stykały się ze sobą. Skutkiem tego była aktywacja i ekspresja
genu wskaźnikowego, w tym przypadku HIS3, dołączonego do UAS i odcinka TATA promotora GAL1.
W wyniku przeszukiwania uzyskano około 2000 klonów, które miały zdolność do wzrostu na płytkach Trp-, Leu-, His-, 3AT. DNA otrzymane ze 165 losowo wybranych klonów pozytywnych służyły do przejściowej kotransfekcji szczepu drożdży SFYS26 razem z TRAF2
sklonowanym w wektorze pGBT9. Test na aktywność b-galaktozydazy przeprowadzono na
stransformowanych koloniach drożdży 5FY526, jak opisano w Materiałach i Metodach (v).
Pojawiający się niebieski kolor wskazywał na kolonie drożdży, które zawierały cDNA kodujący białko lub polipeptyd, który wiąże się z TRAF2.
Wyniki testu dwuhybrydowego: zdolność pobranych klonów do wzrostu na płytkach
3AT i do indukowania lacZ, co mierzono w teście barwnym, są zebrane w tabeli 1. Spośród
sprawdzonych pozytywnych klonów, dwa były cDNA kodującym znane białka: sam TRAF2,
który ma zdolność łączenia się ze sobą i tworzenia homodimerów, oraz receptor limfotoksyny
beta, dla którego wykazano, że jego wewnątrzkomórkowa domena wiąże się z YTRAF2. Trzy
spośród sklonowanych cDNA (klony 9, 10 i 15) były nowe.
Klony pozytywne sprawdzano dalej w teście specyficzności wiązania, a mianowicie
sprawdzano pod kątem ich oddziaływań z niezależnymi przynętami. Jak pokazano w tabeli 2,
klony 9 i 10, reagowały jedynie z TRAF2 i nie wiązały się żadnym spośród licznych innych
testowanych białek. Klon 15 z drugiej strony nie wiązał się ani z MORT1, ani wewnątrzkomórkowymi domenami receptorów p55 i p75, ale wiązał się słabo z laminą i cykliną D.
W celu zawężenia cząsteczki TRAF2 do regionu, który oddziałuje z klonami 9, 10 i 15,
wykonano dwa dodatkowe konstrukty. Jeden konstrukt zawierał N-końcową część cząsteczki
TRAF2, aminokwasy od 1 do 221, które obejmują motywy palca serdecznego i palca cynkowego. Drugi konstrukt zawierał jedynie C-końcową część cząsteczki, aminokwasy 222 do
190 709
39
501, obejmując „domenę TRAF” i dodatkowe 42 aminokwasy. Te dwa konstrukty służyły jako
przynęty w testach dwuhybrydowych. Wyniki jasno pokazują, że jakkolwiek klony 9, 10 i 15
nie reagowały z konstruktem zawierającym aminokwasy od 1 do 221 z cząsteczki TRAF2,
wszystkie one wiązały się z C-końcowym konstruktem zawierającym „domenę TRAF” z taką
samą wydajnością, z ja k ą wiążą się do cząsteczki TRAF2 pełnej długości.
Ta b e l a II
Podsumowanie wyników testu dwuhybrydowewgo przy zastosowaniu TRAF2 jako
„przynęty”, w którym uzyskano klony 9, 10 i 15.
Wzrost na
Test barwny
ED/nazwa klonu, jak
Liczba
50 mM 3AT
(min)
określono przez
niezależych
sekwencjonowanie
klonów
+++
10 min
TRAF2
150
++
nowy klon numer 9
2 0 min
6
+++
nowy klon numer 10
2
15 min
++++
receptor limfotoksyny beta
2
10 min
+
nowy klon numer 15
15 min
5
Ta b e l a III
Test specyficzności (oddziaływanie z niezależnymi przynętami w teście dwuhybiydowym)
klon:
klon 9
klon 10
klon 15
przynęta
+
lamina
+
cyklina D
p75-IC
p55-IC
MORT1
+++
+++
+++
TRAF2
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Poprzez zastosowanie wobec cDNA klonu 10 kilku etapów PCR, sklonowano cDNA pełnej
długości z bibliotek cDNA otrzymanych z RNA z tkanek ludzkich. Białko to oznaczono jako NIK,
od kinazy indukującej NF-KB, ang. „NF-KB inducing kinase”, z powodu tego, że zawiera region
kinazy białkowej (patrz poniżej). Należy zauważyć, że sekwencja klonu 10, przy wyjściowej analizie (przed otrzymaniem NIK przez PCR) wydawała się kodować białko, początkowo nazwane
NMPI (patrz stanowiące współwłasność, równocześnie biegnące, IL 117800). To NMPI lub białko
kodowane przez klon 10 okazało się mieć sekwencję odpowiadającą konserwowanym motywom I
do XI, które charakteryzują kinazy białkowe Ser/Thr.
Przykład 2
Sekwencjonowanie nowych klonów
Trzy nowe klony cDNA (klony 9, 10 i 15) oczyszczono, powielono w E. coli, a ich DNA
poddano analizie sekwencji. Okazało się, że wszystkie trzy klony są częściowymi klonami
cD-NA.
Całkowita długość klonów 9, 10 i 15 wynosiła około 2000, 2700 i 1300 par zasad, odpowiednio.
Figury 3 i 5 pokazują zsekwencjonowaną część klonów 9 i 15, a fig. 4 pokazuje pełną
sekwencję klonu 10.
Figura 5a-b - całą sekwencję nukleotydową klonu 15 zsekwencjonowanego z dwóch
końców - 5' i 3' (a) i kodowaną przez nie sekwencję nukleotydową (b). Klon 15, który jest
częściowym klonem cDNA okazał się kodować białko o długości 172 aminokwasów.
Klony 9 i 15 są częściowymi klonami, którym brakuje 5' końcowej części sekewencji
kodujących DNA. W szystkie wydedukowane sekwencje aminokwasowe, pokazane na fig. 3b,
4b i 5b rozpoczynają się od pierwszego nukleotydu odpowiedniego klonu.
Sekwencja klonu 10 (klon z częściowym cDNA), który był najbardziej starannie analizowany, koduje białko nazwane N M PI, jak wspomniano powyżej, zawierające motywy kinazy białkowej Ser/Thr. K lon cDNA pełnej długości otrzymany poprzez PCR przy zastosowaniu
klonu 10, jak zaznaczono powyżej, okazał się być nową kinazą wiążącą się z TRAF2, NIK,
jak wspomniano powyżej.
40
190 709
Pełna sekwencja nukleotydowa i wydedukowana sekwencja aminokwasowa NIK są pokazane na fig 6 , na której kodon inicjatorowy ATG w pozycji nukleotydowej 232 jest podkreślony i w której kodon stop w pozycji nukleotydowej 3073 jest zaznaczony gwiazdką. W pełni
zsekwencjonowany klon NIK na fig. 6 ma długość 4596 nukleotydów, w obrębie których zawarta jest sekwencja kodująca NIK, przy czym koduje ona białko NIK złożone z 947 reszt
aminokwasowych.
Przeszukanie banku danych ujawniło, że nowa sekwencja aminokwasowa NIK wykazuje szczególnie wysoką homologię do grupy kinaz, spośród których o kilku wiadomo, że pełnią
rolę kinazy MAP.
Figura 7 pokazuje dopasowanie:
- mysiej MEKKK (S 1),
- BYR2 (S2),
- Tpl-2 (S3),
- onkogenu mięsaka Ewinga (S4),
- SS3 (S5),
- (STE11) (S 6 ),
- (NPK1) (S7),
- (BCK1) (S 8 ) i
- (NIK) (S9).
Niektóre z tych kinaz zostały zidentyfikowane na podstawie aktywności onkogennej,
którą posiada ich zmutowana postać.
Przykład 3
Ekspresja sklonowanych cDNA i ich koimmunoprecypitacja z TRAF2.
Komórki HeLa-Bujard transfekowano TRAF2 wyznakowanym przy użyciu FLAG,
w wektorze ekspresyjnym opartym o pHUD10-3 i konstruktami zawierającymi ORF jednego
z klonów 9, 10 lub 15, z dołączonym epitopem HA, jak opisano w Materiałach i Metodach
(iv). Komórki hodowano przez 24 godz. w podłożu Dulbecco's Modified Eagle's Medium
(DMEM) plus 10% surowicy cielęcej z dodaną metioniną 35S i cysteiną 3 5 S. Na zakończenie
tego czasu inkubacji komórki poddano lizie w buforze do radioimmunoprecypitacji (10 mM
Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Nonident P-40, 1% dezoksycholan, 0,1% SDS i 1 mM
EDTA; 1 ml/ 5 x 105 komórek) i lizat wstępnie klarowano poprzez inkubację z niezależną
surowicą odpornościową z królika i kulkami Protein B-Sepharose (Pharmacia, Sweden). Immunoprecypitację przeprowadzano poprzez 1-godzinną inkubację w 4°C próbek lizatu z monoklonalnymi przeciwciałami anty-FLAG (otrzymanymi z Eastman Kodak Co.) lub anty-HA
(klon 12CA5 (Field, J. i wsp., (1988)). Wyrażone białka analizowano w żelu SDS-PAGE, który następnie poddawano autoradiografii.
Wyniki tych doświadczeń pokazały, że częściowe cDNA klonów 9, 10 i 15 kodowały
białka o ciężarze cząsteczkowym około 50-65,45 i 26 kDa, odpowiednio.
Nie można było stwierdzić żadnych interakcji między klonem 15 a TRAF2, ale białka
kodowane przez klon 9 i 10 (NIK), jak również pełnej długości NIK podlegały koimmunoprecypitacji z białkiem TRAF2. Próbki komórek, które były kotransfekowane TRAF2 i jednym
z tych dwóch klonów i poddane immunoprecypitacji bądź z przeciwciałami anty-FLAG, bądź
anty-HA, a następnie analizie poprzez SDS-PAGE, jak opisano powyżej, wykazywały trzy
pasma w każdej ścieżce; jedno pasmo odpowiadające białku kodowanemu przez klon 9 lub 10
i dwa inne stanowiące dublet o wielkości 42 i 44 kDa, odpowiadający białku TRAF2.
Przykład 4
Testy funkcjonalne
Stwierdzono, że NIK daje indukcję NF-KB przy zastosowaniu testu opóźnienia w żelu.
Typowo, 0,5-1 x 106 komórek 293 EBNA transfekowano bądź 10 ¡ug klonu 10 w pcDNA3
(fig. 7, ścieżka 1), bądź 3 ug pcDNA3, zawierającego cDNA dla receptora TNF p75 (fig. 7,
ścieżka 3), bądź jednocześnie klonem 10 (10 μg) i receptorem TNF p75 (3 μg), na fig. 7,
ścieżka 2. W każdej z transfekcji całkowita ilość DNA doprowadzano do 15 μg „pustym”
wektorem pcDNA3. Jako kontrola służyły komórki 293 EBNA transfekowane 15 μg samego
wektora (fig. 7, ścieżka 4). Komórki hodowano przez 24 godz. w podłożu DMEM + 10% surowica cielęca, a następnie zbierano i traktowano według Schreiber i wsp. (Schreiber, E.
190 709
41
i wsp., (1989). Próbki rozdzielano w 5% żelu poliakryloamidowym. NF-KB śledzono przy zastosowaniu jako sondy zestawu wyznakowanych radioaktywnie 32P oligonukleotydów, odpowiadających miejscom wiązania NF-KB. (Sondami były GATGCCATTGGGGATTTCCTCTTT i CAGTAAAGAGGAAATCCCCAATGG).
Jak pokazano w tabeli IV, NIK indukuje NF-KB nawet bardziej wydajnie niż TRAF2.
Z drugiej strony, klon 10 nie dawał tego efektu wcale.
Test na gen wskaźnikowy przeprowadzono jak następuje:
Komórki 293 EBNA kotransfekowano wektorem pcDNA3 zawierającym HI V LTR, dołączonym do genu wskaźnikowego lucyferazy, razem z plazmidem pcDNAS zawierającym
cDNA dla samego receptora p75 TNF, plazmidem pcDNA3 zawierającym sam cDNA klonu
10 lub cDNA dla receptora p75 TNF i plazmidem pcDNA3 wymienionym w tabelach IV i V.
Wynik pokazany w tabeli V pokazuje:
a) że transfekcji klonem 10 nie aktywuje indukcji NF-KB, podczas gdy NIK czyni to silnie,
b) że klon 10, tak samo jak NIK, w której aktywna lizyna została zastąpiona alaniną
(NIK*) silnie hamuje indukcję NF-KB przez cDNA wymienione w pierwszej kolumnie tabeli IV.
c) delecja 3' U TR NIK (NIK-3'UTR) ogromnie zwiększa jej ekspresję i w konsekwencji
jej zdolność do blokowania indukcji NF-KB, jeżeli jest wyrażana w postaci zmutowanej.
Ta b e l a IV
Aktywacja NF-KB przez NIK. Test opóźnienia w żelu. Liczby są zliczeniami rozpadów
radioaktywnych wykrywanych przez płytkę „phosphoimager”.
Transfekowany cDNA
zliczenia
powierzchnia (mm2)
pusty wektor
327
70,7
TRAF2
3411
70,7
NIK
6532
70,7
klon 10
343
70,7
Tabela V
Dominujący negatywny efekt klonu 10, mutanta NIK K —>A na indukcję NF-KB poprzez
nadprodukcję TRAF2, TRADD, MORT1/FADD, TNFR-i, TNFR-II, hybrydy TNFR-I/FAS,
RIP i aktywację NF-KB przez NIK. Test lucyferazy.
TRAF2
Induktor
pusty
NIKKlon NIK* NIK*NIK
wektor
3'UTR 1 0
225NF-KB
3'UTR
501 aa
TRAF2
300
30
ND
1000
25
100
TRADD
300
1000
100
5
ND
800
MORT1/FADD 300
80
25
90
1000
TNFR-I
2 0 0
100
1000
50
5
ND
800
TNFR-II
2 0 0
90
800
20
6
ND
750
hybryda FAS
300
25
50
30
1200
RIP
300
75
50
ND
800
NIK
500
100
10
ND
TNF
2 0 0
80
RelA
1000
ND 1 0 0 0
ND
ND
ND
ND
Przykład 5
Dodatkowa charakterystyka NIK
Poza testami na specyficzność z przykładu 2, powyżej, dalsze badanie w testach dwuhybrydowych właściwości wiązania NIK wykazały (wyniki nie pokazane), że wyjściowo wyizolowany częściowy klon NIK (NIK 624-947) wiąże się specyficznie z C-końcowym regionem
TRAF2 (domeną CTRAF), podczas gdy, przeciwnie, pełnej długości NIK wiązał się zarówno
do domeny C-TRAF, ja k i regionu przed nim (domena N-TRAF). NIK również nie wiąże się
zTRAF3. Ponadto, hybrydowe białko zawierające domenę C-TRAF z TRAF2 i N-końcową
część TRAF3 mógł wiązać niepełną cząsteczkę NIK (NIK 624-947), ale nie NIK pełnej długości, wskazując, że wiązanie pełnej długości NIK z TRAF2 wymaga zarówno domeny C-TRAF, jak
i N-TRAF TRAF2.
42
190 709
Ponadto, NIK nie łączy się ze sobą, ani nie wiąże się z wewnątrzkomórkowymi domenami receptorów p55 i p75, receptora TNF; receptora CD40 (przedstawiciel rodziny receptorów TNF/NGF); i FAS/APO1 (receptora CD9S). NIK nie wiąże się również z wewnątrzkomórkowymi białkami związanymi z tymi receptorami, jak na przykład TRADD, MORTI
i RIP. Wyniki te korelują z danymi pokazanymi powyżej w tabeli II, dotyczącymi specyficzności wiązania białek kodowanych przez klony 9, 10 i 15. Różne oddziaływania pomiędzy różnymi receptorami i białkami są przedstawione schematycznie na fig. 2 a, i 2 b, przy czym fig. 2 b jest
bardziej kompletna.
Analiza Northern wykazała, że występuje pojedynczy transkrypt NIK, wyrażany w różnych tkankach na różnych poziomach, którego wielkość wynosi około 5000 nukleotydów,
czyli zasadniczo tyle samo, co sklonowany cDNANIK (jak wspomniano powyżej, patrz fig. 6 ).
Ponadto, jak zaznaczono powyżej w odniesieniu do białka kodowanego przez klon 10
(wyjściowo oznaczonego NMPI), białko NIK pełnej długości ma również motyw kinazy serynowo/treoninowej, podobny do kilku kinaz kinazy kinazy MAP(MAPKKK), co również widać z dopasowania sekwencji pokazanego na fig. 7.
Testowanie in vitro aktywności kinazy NIK wykazało, że NIK może być autofosforylowana, ale nie wtedy, gdy lizyna w miejscu aktywnym i sąsiadująca lizyna, zostaną zastąpione
alaniną (analog NIK lub muteina oznaczona jako NIK KK429-430AA, co wskazuje że lizyny
w pozycji 429 i 430 są zastąpione przez alaninę). To również koreluje z powyższymi wynikami przedstawionymi w przykładzie 4 i pokazanymi w tabeli IV w odniesieniu do muteiny NIK*.
Jak wspomniano powyżej, nadprodukcja NIK w komórkach 293 EBNA indukuje NF-KB
nawet do wyższego stopnia, niż nadprodukcja TRAF2, ale nadprodukcja niepełnego NIK
(NIK 624-947) nie prowadzi do aktywacji NF-KB. Ponadto, wspomniane powyżej analogi/muteiny NIK KK429-430AA również nie dają aktywacji NF-KB, kiedy są nadprodukowane
w tych komórkach. A zatem, indukcja NF-KB przez NIK zależy od nienaruszonej funkcji kinazy NIK. W przeciwieństwie do tego, białko RIP (patrz fig. 2a, b), które również ma domenę
kinazową, może nadal indukować aktywację NF-KB, kiedy jego aktywność kinazowa jest
zaburzona przez mutację.
Aktywacja NF-KB w wyniku nadekspresji NIK była nie do odróżnienia od uzyskiwanej
przez traktowanie limfocytów TNF i jak przy nadekspresji TNF lub TRAF2, głównymi NF-KB
aktywowanego NIK były p50 i p65. Nadekspresja NIK powodowała degradację I-KB i blokowanie tej degradacji przez N-acetylo-Leu-Leu-norleucynol (ALLN), czego rezultatem (jak
w przypadku TNF) jest akumulacja cząsteczek I-KB o wolniejszej migracji w SDS-PAGE,
wskazującej na ufosforylowanie I-KB.
Inne testy wykazały, że NF-KB może być aktywowany w komórkach 293-EBNA przez
TNF, jak również przez nadekspresję receptorów TNF p55 i p75 oraz nadprodukcję receptora
TNF p55, w którym wewnątrzkomórkowa domena receptora TNF p55 jest zamieniona na domenę receptora FAS/APO1. NF-KB może być również aktywowany przez TRAF2, TRADD,
RIP lub MORTI, ale nie przez mutanta delecyjnego M ORTI, pozbawionego regionu znajdującego się przed „domeną śmierci” MORTI. Jak wspomniano powyżej, NIK pełnej długości, ale nie
muteina NIK KK429-430AA, ani nie część NIK (NIK 624-947), indukuje aktywację NF-KB. Ponadto ekspresja muteiny NIK KK429-430AA lub NIK 624-947 w komórkach 293-EBNA łącznie
z dowolnym z powyżej wspomnianych czynników tj. receptorów lub związanych z nimi białek,
prowadzi w rezultacie do blokowania indukcji aktywacji NF-KB przez wszystkie te czynniki,
wskazując, że aktywność NIK jest bezpośrednio zaangażowana w tą indukcję NF-KB. Podobnie, powyżej obserwowane hamowanie przez nieaktywne cząsteczki NIK koreluje z mniejszą
redukcją I-KB.
NF-KB jest również aktywowany przez IL-1 (patrz schemat na fig. 2b). Efekt ten jest
niezależny od TRAF2 (IL-1 nie wiąże się z TRAF2 i działanie IL-1 nie jest blokowane przez
ekspresję dominujących negatywnych mutantów TRAF2). Jednakże to działanie IL-1 jest hamowane przez ekspresję mutantów NIK. Ponadto na aktywność NF-KB obserwowaną w wyniku nadprodukcji homologa R el p65 w komórkach 293-EBNA nie miała wpływu koekspresja
mutantów NIK z brakiem aktywności kinazy, wskazując, że NIK nie ma bezpośredniego
wpływu na działanie białek Rel, ale uczestniczy w ich aktywacji indukowanej poprzez receptor.
190 709
43
Aktywność cytotoksyczna TNF (w której pośredniczy proteaza MACH zawiązana
z MORT1 - patrz fig. 2b) podlega negatywnej regulacji przez niektóre geny indukowane przez
NF-KB. Antagonizujące konsekwencje indukcji genu, w której pośredniczy NF-KB i aktywacji MACH, mogą wyjaśniać dlaczego sam TNF, jak również IL-1 mogą indukować komórkową odporność na cytotoksyczność TNF. Zgadza się to także z wykryciem, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, że ekspresja dominujących negatywnych mutantów NIK w 293-EBNA
znacząco zwiększa ich podatność na zabijanie przez TNF i że nadprodukcja natywnej (pełnej
długości, typu dzikiego) NIK hamowała zabijanie komórek przez TNF lub przez receptor TNF p55
(receptor ten ma wewnątrzkomórkową domenę zawierającą region domeny śmierci, który,
jeżeli jest wyrażany w komórkach w nieobecności jakiegokolwiek TNF, może indukować sam
z siebie cytotoksyczność komórki (patrz powyżej w odniesieniu do publikacji obecnych wynalazców i równocześnie biegnących zgłoszeń będących ich współwłasnością).
Przykład 6
Dalsze testy funkcjonalne na aktywność biologiczną NIK.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem stwierdzono również, że ekspresja dominujących
negatywnych mutantów NIK może również blokować indukcję aktywacji NF-KB w komórkach 293-EBNA przez inne czynniki indukujące, włączając w to: (i) dobrze poznaną bakteryjną endotoksynę, lipopolisacharyd (LPS); (ii) dobrze poznany octan mirystylanu forbolu, który
jest znanym aktywatorem kinazy białkowej C; i (iii) białko TAX HTLV-1.
Ponadto stwierdzono również, że ekspresja dominujących negatywnych mutantów NIK
w komórkach 293-EBNA zasadniczo nie wpływa na indukowaną TNF aktywację kinazy Jun,
wskazując, że NIK działa w specyficzny i prawdopodobnie bezpośredni sposób, zwiększając
fosforylację I-KB bez wpływu na kinazy MAP zaangażowane w fosforylację Jun. W świetle
powyższego wygląda na to, że aktywność kinazy NIK jest częścią kaskady przekazywania
sygnałów, która jest odpowiedzialna za aktywację NF-KB, która to kaskada jest wspólna dla
dwóch receptorów TNF, receptora FAS/APO1 i receptora IL-1. Wydaje się, że NIK spełnia
specyficzną rolę w tej kaskadzie. Wiązanie się NIK do TRAF2 może służyć do umożliwienia
NIK podlegania wpływowi zarówno receptorów TNF, jaki i receptora FAS/APO1. Przez analogię do kaskady kinazy MAP, NIK może służyć jako substrat dla kinazy (MAPKKKK) po
rekrutacji przez TRAF2 do pobudzonych receptorów, a zatem wówczas, kiedy NIK jest ufosforylowana, fosforyluje i aktywuje inne kinazy (lub może indukować bezpośrednio aktywację
NF-KB poprzez bezpośrednią fosforylację I-KB). Indukowana poprzez IL-1 aktywacja NF-KB
jest niezależna od TRAF2, a zatem w aktywacji NIK przez receptor IL-1 może pośredniczyć
inne białko, IRAK, kinaza serynowo/treoninowa, która jest przyłączana do receptora IL-1 po
stymulacji (Cao i wsp., 1996b), jak również TRAF 6 , który wiąże IRAK (patrz Cao i wsp.,
1996a, jak również schemat na fig. 2b). Jak wspomniano powyżej celem NIK, lub kaskady
kinaz przez nią aktywowanych jest prawdopodobnie I-KB. NIK może również fosforylować
białka TRAF lub białka regulatorowe, które wiążą się do nich, na przykład TANK-I/TRAF (patrz
Cheng i Baltimore,1996; Rothe i wsp., 1996), tworząc miejsca zakotwiczenia dla innych białek.
44
190 709
Literatura:
1.Adelman et al., (1983) D N A 2, 183.
2.
Alnemri, E.S. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 4312-4317.
3. Ausubel, F.M. et al. eds., Current Protocols in Molecular Biology.
4. Baeuerle, P.A, and Henkel, T. (1994) Annu Rev Immunol.
5. Bazan, J.F. (1993). Current Biology 3, 603-606.
6 . Berberich, I, Shu, G..L., and Clark, E.A. (1994)..-J Immunol 153, 4357-66.
7. Beutler, B., and van Huffel, C. (1994). Science 264, 667-8.
8 . Blank, V., Kourilsky, P., and Israel, A. (1992). Trends Biochem. Sei 17, 135-40.
9. Boldin, M.P. et al. (1995a) J. Biol. Chem. 270, 337-341.
10. Boldin, M.P., Varfolomeev, E.E., Pancer, Z., Mett, I.L., Camonis, J.H., and Waliach,
D. (1995b). J. Biol. Chem. 270, 7795-7798.
11. Boldin, M.P. et al. (1996) Cell 85, 803-815.
12. Cao, Z. et al. (1996a) Nature 383, 443-446.
13. Cao, Z. et al. (1996b) Science 271, 1128-1131.
14. Chen, C.J. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sei. 660:271-273.
15. Cheng, G., Cleary, A.M., Ye, Z-s., Hong, D.I., Lederman, S. and Baltimore, D.
(1995) Science 267:1494-1498).
16. Cheng, G. and Baltimore, D. (1996) Genes Dev. 10, 963-973.
17.. Chinnalyan, A.M., O'Rourke, K., Tewari, M., and Dixit, V.M. (1995) Cell 81, 505-512.
18. Creighton, T.E., Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co.,
San Francisco, Ca. 1983.
19. Croston, G.E., Cao, Z., and Goeddel, D.V. (1995). J Biol Chem 270,16514-7.
20. DiDonato, J.A, Mercurio, F., and Karin, M. (1995). Mol Cell Biol 15, 1302-11.
21. Durfee, T. et al. (1993) Genes Dev. 7:555-569.
22. Field, J. et al. (1988) Mol. Cell Biol. 8:2159-2165.
23. Geysen, H.M. (1985) Immunol. Today 6 , 364-369.
24. Geysen, H.M. et al. (1987) J. Immunol. Meth. 102, 259-274.
25. Gilmore, T.D., and Morin, P.J. (1993). Trends Genet 9, 427-33.
26. Gossen, M. and Bujard, M. (1992) PNAS 89:5547-5551.
27. Grell, M., Douni, E., Wajant, H., Lohden, M., Clauss, M., Baxeiner, B., Georgopoulos, S., Lesslauer, W., Kollias, G., Pfizenmaier, K., and Scheurich, P. (1995). Cell 83,
793-802.
28. Grilli, M., Chiu, J.J., and Lenardo, M.J. (1993). Int Rev Cytol.
29. Hanks, S.K., Quinn, A.M., and Hunter, T. (1988). Science 241, 42-52.
30. Howard, A.D. et al. (1991) J. Immunol. 147, 2964-2969.
31. Hsu, H., Shu, H.-B., Pan, M.-G., and Goeddel, D.V. (1996). Cell 84, 299-308.
32. Hsu, H, Xiong, J., and Goeddel, D.V. (1995). Cell 81, 495-504.
33. Kaufmann, S.H. (1989) Cancer Res. 49, 5870-5878.
34. Kaufmann, S.H. (1993) Cancer Res. 53, 3976-3985.
35. Lalmanach-Girard, A.C., Chiles, T.C., Parker, D.C., and Rothstein, T.L. (1993). J.
Exp Med 177, 1215-1219.
36. Lazebnik, Y.A. et al. (1994) Nature 371, 346-347.
37. Mashima, T. et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209, 907-915.
38. McDonald, P.P., Cassatella, M.A., Bald, A., Maggi, E., Romagnani, S., Gruss, H.J.,and
Pizzolo, G. (1995). Eur J Immunol 25, 2870-6.
39. Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant
DNA, Ed.A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981).
40. Milligan, C.E. et al. (1995) Neuron 15, 385-393.
41. Mosialos, G., Birkenbach, M ., Yalamanchili, R., VanArsdale, T., Ware, C., and Kieff,
E. (1995). Cell 80,389-399.
42. Muranishi, S. et al. (1991) Pharm. Research 8 , 649.
43. Nagata, S. and Golstein, P. (1995) Science 267, 1449-1456.
44. Rensing-Ehl, A., Hess, S., Ziegler-Heitbrock, H.W.L., Riethmüller, G., and Engelmann, H. (1995). J. Inlamm. 45, 161-174.
190 709
45
45. Rothe, M., Pan, M.-G., Henzel, W.J., Ayres, T.M., and Goeddel, D. V. (1995b). Cell
83, 1243-1252.
46. Rothe, M., Sarma, V., Dixit, V.M., and Goeddel, D.V. (1995a). Science 269,1424-1427.
47. Rothe, M., Wong, S.C., Henzel, W.J., and Goeddel, D.V. (1994). Cell 78, 681-692.
48. Rothe, M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 93, 8241-8246.
49. Ruzicka et al., (1993) Science 260, 487.
50. Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N Y.
51. Sano et al., (1992) Science 258, 120.
52. Sano et al., (1991) Biotechniques 9, 1378.
53. Schreiber, E., Matthias, P., Muller, M.M. and Schaffner, W. (1989), Nuc. Acids
R es.17:6419.
54. Schulz et al., G.E., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York,
N.Y.1798.
55. Sleath, P.R. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 14526-14528.
56. Smith, C. A., Farrah, T„ and Goodwin, R. G. (1994). Cell 76, 959-962.
57. Stanger, B.Z. et al. (1995) Cell 81, 513-523.
58. Thomberry, N.A. et al. (1992) Nature 356, 768-774.
59. Thomberry, N.A. et al. (1994) Biochemistry 33, 3934-3940.
60. Vandenabeele, P., Declercq, W., Beyaert, R., and Fiers, W. (1995). Trends Cell Biol.
5, 392-400.
61. Varfolomeev, E. E., Boldin, M. P., Goncharov, T. M., and Waliach, D.(1996).. J. Exp.
Med. in press.
62. Vassalli, P. (1992) Ann. Rev. Immunol. 10, 411-452.
63. Veira et al., (1987) Meth. Enzymol. 153, 3.
64. Wallach, D. (1996) Eur. Cytokine Net. 7, 713-724.
65. Wang, L. et al. (1994) Cell 78, 739-750.
66. Wilks, A.F. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:1603-1607.
67. Zaccharia, S. et al. (1991) Eur. J. Pharmacol. 203, 353-357.
68. Zhao, J.J. and Pick, L. (1993) Nature 365: 448-451.
46
190 709
LISTA SEKWENCJI
(1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY:
(A) NAZWA: Yeda Research and Development Co. Ltd.
(B) ADRES: Weizmann Institute of Science
(C) MIASTO: P.O.B. 95
(D) STAN: Rehovot
(E) KRAJ: Izrael
(F) KOD POCZTOWY (ZIP): 76100
(G) TELEFON: +972-8-9344093
(H) TELEFAX: +972-8-9470739
(A)
(B)
(C)
(E)
(F)
NAZWISKO: David Wallach
ADRES: 24 Borochov Street
MIASTO: Rehovot
KRAJ: Izrael
KOD POCZTOWY (ZIP): 76406
(A)
(B)
(C)
(E)
(F)
NAZWISKO: Nikolai Malinin
ADRES: Beit Clore, Weizmann Institute of Science
MIASTO: Rehovot
KRAJ: Izrael
KOD POCZTOWY(ZIP): 76100
(A)
(B)
(C)
(E)
(F)
NAZWISKO: Mark Boldin
ADRES: Beit Clore, Weizmann Institute of Science
MIASTO: Rehovot
KRAJ: Izrael
KOD POCZTOWY(ZIP): 76100
(A)
(B)
(C)
(E)
(F)
NAZWISKO: Andrei Kovalenko
ADRES: Beit Clore, Weizmann Institute of Science
MIASTO: Rehovot
KRAJ: Izrael
KOD POCZTOWY(ZIP): 76100
(A)
(B)
(C)
(E)
(F)
NAZWISKO: Igor Mett
ADRES: 60 Levin Epstein Street
MIASTO: Rehovot
KRAJ: Izrael
KOD POCZTOWY(ZIP): 76462
(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Modulatory czynnika związanego z receptorem TNF
(TRAF) , ich wytwarzanie i zastosowanie
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 11
(iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) RODZAJ NOŚNIKA: Floppy disk
(B) KOMPUTER: IBM PC compatible
(C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS
(D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
(v) DANE DOT. OBECNEGO ZGŁOSZENIA:
NUMER ZGŁOSZENIA: PCT/IL97/00117
47
190 709
(vi) DANE DOT. POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: IL 117800
(B) DATA ZGŁOSZENIA: 02-APR-1996
(vi) DANE DOT. POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: IL 119133
(B) DATA ZGŁOSZENIA: 26-AUG-1996
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1906 par zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 1:
CATTGGGTCA CGCGGTGGCG GCGCTCTAGA ATAGTGGATC CCCCGGGCTG CAGGAATTCG
60
ATTCGAGGCC ACGAAGGCCG GCGGCGCGGC GCANGCACCG GCCCGGGGAN AGGCNCCATG
120
AGCGGATCNC NGAACNATGA CAAAAGACAA TTTCTGCTGG AGCGACTGCT GGATGCAGTG
180
AAACAGTGCC AGATCCGCTT TNGAGGGAGA AAGGAGATTG CCTCGGATTC CGACAGCAGG
240
GTCACCTGTC TGTGTGCCCA GTTTGAAGCC GTCCTGCAGC ATGGCTTGAA GAGGAGTCGA
300
GGATTGGCAC TCACAGCGGC AGCGATCAAG CAGGCAGCGG GCTTTGCCAG CAAAACCGAA
360
ACAGAGCCCG TGTTCTGGTA CTACGTGAAG GAGGTCCTCA ACAAGCACGA GCTGCAGCGC
420
TTCTACTCCC TGCGCCACAT CGCCTCAGAC GTGGGCCGGG GTCGCGCCTG GCTGCGCTGT
480
GCCCTCAACG AACACTCCCT GGAGCGCTAC CTGCACATGC TCCTGGCCGA CCGCTGCAGG
540
CTGAGCACTT TTTATGAAGA CTGGTCTTTT GTGATGGATG AAGAAAGGTC CAGTATGCTT
600
CCTACCATGG CAGCAGGTCT GAACTCCATA CTCTTTGCGA TTAACATCGA CAACAAGGAT
660
TTGAACGGGC AGAGTAAGTT TGCTCCCACC GTTTCAGACC TCTTAAAGGA GTCAACGCAG
720
AACGTGACCT CCTTGCTGAA GGAGTCCACG CAAGGAGTGA GCAGCCTGTT CAGGGAGATC
780
ACAGCCTCCT CTGCCGTCTC CATCCTCATC AAACCTGAAC AGGAGACCGA CCCTTGCCTG
840
TCGTGTCCAG GAATGTCAGT GCTGATGCCA AATGCAAAAA GGAGCGGAAG AAGAAAAAGA
900
AAGTGACCAA CATAATCTCA TTTGATGATG AGGAAGATGA GCAGAACTCT GGGGACGTGT
960
TTAAAAAGAC ACCTGGGGCA GGGGAGAGCT CAGAGGACAA CTCCGACCGC TCCTCTGTCA
1020
ATATCATGTC CGCCTTTGAA AGCCCCTTCG GGCCTAACTC CAATGGAATC AGAGCAGCAA
1080
48
190 709
CTCATGGAAA ATTGATTCCC TGTCTTTGAA CGGGGAGTTT GGGTACCAGA AGCTTGATGT
1140
GAAAAGCATC GATGATGAAG ATGTGGATGA AAACGAAGAT GACGTGTATG GAAACTCATC
1200
AGGAAGGAAG CACAGGGGCC ACTCGGAGTC GCCCGAGAAG CCACTGGAAG GGAACACCTG
1260
CCTCTCCCAG ATGCACAGCT GGGCTCCGCT GAAGGTGCTG CACAATGACT CCGACATCCT
1320
CTTCCCTGTC AGTGGCGTGG GCTCCTACAG CCCAGCAGAT GCCCCCCTCG GAAGCCTGGA
1380
GAACGGGACA GGACCAGAGG ACCACGTTCT CCCGGATCCT GGACTTCGGT ACAGTGTGGA
1440
AGCCAGCTCT CCAGGCCACG GAAGTCCTCT GAGCAGCCTG TTACTTCTGC CTCAGTGCCA
1500
GAGTCCATGA CAATTAGTGA ACTGCGCCAG GCCACTGTGG CCATGATGAA CAGGAAGGAT
1560
GAGCTGGAGG AGGAGAACAG ATCACTGCGA AACCTGCTCG ACGGTGAGAT GGAGCACTCA
1620
GCCGCGCTCC GGCAAGAGGT GGACACCTTG AAAAGGAAGG TGGCTGAACA GGAGGAGCGG
1680
CAGGGCATGA AGGTCCAGGC GCTGGCCAGC TATCTTTGCT ATTTTGTGAG GAGATTCTAA
1740
CCCCACGTGA GAACCATGTG GTGGAGAAAT GGAGGGAGAG AGAAATCCAA CAGTTCCTGA
1800
TAGTCTCATT TGAGCTCCTG GATCCAGTCT TTCCTGAAGC TGTGTTTCCT CTGGACTTTT
1860
CATGTATGTG AGCCAATAAA TTGCTTTCAT TCCTTGAAAA AAAAAA
1906
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR::2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 604 aminokwasy
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 2:
Xaa Thr Gly Pro Gly Xaa Gly Xaa Met Ser Gly Ser Xaa Asn Xaa Asp
1
5
10
15
Lys Arg GinPhe Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala Val
20
25
Gin Ile Arg
35
Phe
Xaa
Gly
40
Arg
Lys
Glu
45
Arg Val ThrCys Leu Cys Ala Gin Phe Glu Ala Val Leu
50
55
60
Lys Gin Cys
30
Ile
Ala
Gin His Gly
LeuLys Arg Ser Arg Gly LeuAla Leu Thr Ala Ala Ala Ile Lys Gin
65
70
75
80
Ala Ala Gly Phe Ala Ser Lys Thr Glu Thr Glu Pro Val Phe Trp Tyr
Ser
AspSerAspSer
190 709
85
49
90
Tyr Val LysGlu Val Leu Asn Lys
100
Leu Arg His Ile Ala Ser Asp
115
His Glu Leu Gin Arg
105
Phe Tyr Ser
110
Val Gly Arg Gly Arg Ala Trp Leu Arg
120
125
Cys Ala Leu Asn
130
Glu
Ala Asp Arg
145
Cys
ArgLeu Ser
150
Met Asp Glu
Glu
ArgSer Ser
165
135
His
Asn Ser IleLeu Phe Ala Ile Asn
180
Gin Ser Lys PheAla Pro Thr
195
95
SerLeu GluArg Tyr Leu HisMetLeuLeu
140
Thr
Met
170
PheTyr Glu
155
LeuPro Thr
Ile Asp Asn Lys Asp
185
Asp Trp
160
Ser
PheVal
Met Ala
175
Ala
GlyLeu
Ser Ile
240
Leu
IleLys
Pro Gly
255
Met
SerVal
Leu Asn Gly
190
Val Ser Asp Leu Leu Lys Glu Ser Thr
200
205
Gin Asn Val ThrSer Leu Leu Lys Glu Ser Thr Gin Gly Val Ser Ser
210
215
220
Leu Phe
225
Arg
Glu
IleThr Ala
230
Ser
Pro Glu
Gin
Glu
245
ThrAsp Pro
Cys
250
Leu Met
Pro
Asn
260
Ala
Lys
Thr Xaa Ser HisLeu Met Met
275
Cys Leu Lys
290
Arg
His
Arg
265
Leu
295
Leu
SerIle Ser
310
Cys
Leu Thr
Pro
Met
325
GluSer Glu
Gin
330
Val Phe
Glu
Arg
340
Gly
Val
Arg Xaa Xaa
355
Arg
Cys
Gly
360
Ile Arg Lys
370
Glu
Ala
His
SerGly Arg ArgLys
270
ArgLysXaaPro
GlyGin GlyArg Ala Gin ArgThrThrPro
300
Pro
Glu
LeuSer Cys
Arg Lys Met Ser Arg Thr Leu Gly Thr
280
285
Thr Ala
305
Gly Arg
385
SerAla Val
235
Gin
375
LeuPro Leu
390
Trp
345
ProPro Leu
315
GinLeu Met
Lys Ala
320
Pro
SerGly
Glu Asn
335
Xaa
PhePro
ValPro Glu Ala Xaa
350
CysGluLysHis
XaaLys ArgArg Xaa Arg ValTrpLysLeu
365
GlyPro LeuGly Val Ala ArgGluAlaThr
380
Pro
AspAla Gin
395
Leu Gly
400
Gly Ala Ala Gin Xaa Leu Arg His Pro Leu Pro Cys Gin Trp Arg Gly
Ser
AlaGlu
50
190 709
405
410
415
Leu Leu Gin Pro Ser Arg
420
Cys Pro
Arg Thr Arg Gly Pro Arg
435
Ser Pro Gly Ser Trp Thr Ser Val Gin Cys
440
445
Gly Ser Gin
450
Leu
Pro Arg Lys Pro Gly
425
Glu Arg Asp
430
SerArgProArgLys Ser Ser Glu Gin Pro Val Thr
455
460
Ser Ala Ser Val Pro Glu Ser Met Thr Ile
465
470
Ser Glu Leu Arg Gin Ala
475
480
Thr Val Ala Met Met Asn Arg Lys Asp Glu Leu Glu Glu Glu Asn Arg
485
490
495
Ser Leu Arg Asn Leu Leu Asp Gly Glu Met Glu His Ser
500
505
Ala Ala Leu
510
Arg Gin Glu Val Asp Thr Leu Lys Arg Lys Val Ala Glu Gin Glu Glu
515
520
525
Arg Gin Gly
530
Met
LysValGinAlaLeu Ala Ser Tyr Leu Cys Tyr Phe
535
540
Val Arg Arg Phe Xaa Pro His Val Arg Thr Met Trp Trp Arg Asn Gly
545
550
555
560
Gly Arg Glu Lys Ser Asn Ser Ser Xaa Xaa Ser His Leu Ser Ser Trp
565
570
575
Ile Gin Ser Phe Leu Lys Leu Cys
580
Glu Pro Ile Asn Cys Phe
595
Phe Leu Trp Thr Phe
585
His Val Cys
590
His Ser Leu Lys Lys Lys
600
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2631 par zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 3:
CCCCTCTCAC
AGCCCAGGCCATCCAAGAGG GGCTGAGGAA AGAGCCCATC CACCGCGTGT
60
CTGCAGCGGA
GCTGGGAGGGAAGGTGAACC GGGCACTACA GCAAGTGGGA GGTCTGAAGA
120
GCCCTTGGAG
GGGAGAATATAAAGAACCAA GACATCCACC GCCAAATCAA GCCAATTACC
180
ACCAGACCCT
CCATGCCCAGCCGAGAGAGC TTTCGCCAAG GGCCCCAGGG CCCCGGCCAG
240
190 709
51
CTGAGGAGAC AACAGGCAGA GCCCCTAAGC TCCAGCCTCC TCTCCCACCA GAGCCCCCAG
300
AGCCAAACAA GTCTCCTCCC TTGACTTTGA GCAAGGAGGA GTCTGGGATG TGGGAACCCT
360
TACCTCTGTC CTCCCTGGAG CCAGCCCCTG CCAGAAACCC CAGCTCACCA GAGCGGAAAG
420
CAACCGTCCC GGAGCAGGAA CTGCAGCAGC TGGAAATAGA ATTATTCCTC AACAGCCTGT
480
CCCAGCCATT TTCTCTGGAG GAGCAGGAGC AAATTCTCTC GTGCCTCAGC ATCGACAGCC
540
TCTCCCTGTC GGAT GACAGT GAGAAGAACC CATCAAAGGC CTCTCAAAGC TCGCGGGACA
600
CCCTGAGCTC AGGCGTACAC TCCTGGAGCA GCCAGGCCGA GGCTCGAAGC TCCAGCTGGA
660
ACATGGTGCT GGCCCGGGGG CGGCCCACCG ACACCCCAAG CTATTTCAAT GGTGTGAAAG
720
TCCAAATACA GTCTCTTAAT GGTGAACACC TGCACATCCG GGAGTTCCAC CGGGTCAAAG
780
TGGGAGACAT CGCCACTGGC ATCAGCAGCC AGATCCCAGC TGCAGCCTTC AGCTTGGTCA
840
CCAAAGACGG GCAGCCTGTT CGCTACGACA TGGAGGTGCC AGACTCGGGC ATCGACCTGC
900
AGTGCACACT GGCCCCTGAT GGCAGCTTCG CCTGGAGCTG GAGGGTCAAG CATGGCCAGC
960
TGGAGAACAG GCCCTAACCC TGCCCTCCAC CGCCGGCTCC ACACTGCCGG AAAGCAGCCT
1020
TCCTGCTCGG TGCACGATGC TGCCCTGAAA ACACAGGCTC AGCCGTTCCC AGGGGATYTG
1080
NCCAGCCCCC CGGCTCARCA GNTGGGAACC AGGGCCTCGN CAGCNAGCNA AGGTNGGGGG
1140
CAAGCNAGAA TGCCTCCCAG GATTTCACAN CCTGAGCCCN TGCCCCANCC CTGCTGAADA
1200
AAACAYTNCC GCCACGTGAA GAGACAGAAG GAGGATGGNC AGGAGTTNNA CCTYGGGGAA
1260
ACAAAACAGG GATCTTTNTT CTGCCCCTGC TCCAGTNCGA GTTGGCCTGN ACCCGCTTGG
1320
ANTCAGTGAC CATTTGTTGG CAGANCAGGG GAGAGCAGCT TCCAGCCTGG GT CAGAAGGG
1380
GTGGGCGAGC CCTTCGGCCC CTCACCCTNC CAGGCTGCTG TGNAGAGTGT CAAGTGTGTA
1440
AGGGNCCCAA ANCTCAGGNT TCAGTGCAGA ACCAGGTNCA GCAGGTATGC CCGCCCGNTA
1500
GGTTAANNGG GGGCCCTCTN AAACCCCTTG CCTNGGCCTN CACCTNGGCC AGCTCANCCC
1560
CTTTTGGGTG TAGGGGAAAA GAATGCCTGA CCCTGGGAAG GCTWCCCTGG TAGAATACAC
1620
CACACTTTTC AGGTTGTTGC AACACAGGTC CTGAGTTGAC CTCTGGTTCA GCCAAGGACC
1680
AAAGAAGGTG TGTAAGTGAA GTGGTTCTCA GTNCCCCAGA CATGTGCCCC TTTGCTGCTG
1740
GCTACCACTC TTCCCCAGAG CAGCAGGCCC CGAGCCCCTT CAGGCCCAGC ACTGCCCCAG
1800
ACTCGCTGGC ACT CAGTTCC CTCATCTGTA AAGGTGAAGG GTGATGCAGG ATATGCCTGA
1860
CAGGAACAGT CTGTGGATGG ACATGAT CAG TGCTNAAGGN AAAGCAGCAG AGAGAGACGY
1920
TCCGGCGCCC CAGNCCCCAC TNATCAGTGT NCCAGCGTGC TNGGTTNCCC CAGNAGCACA
1980
GCTNCAGNCA TCANCACTGA CACTNCACCC TNGCCCTGCC CCTNGGCCAN GAGGGTACTG
2040
52
190 709
CCGNACGGCA CTTTGCACNT CTGATGNACC TCAAAGCACT TTCATGGCTN GCCCTCTNNG
2100
GCAGGGNCAG GGNCAGGGNC AGTGACANCT GTAGGNAGCA TANGCAANGC CAGGAGATGG
2160
GGTGNAAGGG ANGACAGTCT TGAGCTGTCC ANCATGCATG TGACTNCCTC AAACCTCTTN
2220
NCCAGNATTT CTCTAAGAAT AGCANCCCCC TTNCCCCATT GCCCCAGCTT AGCCTCTTCT
2280
CCCAGGGGAG CTANCTCAGG ACTCACGTAG CATTAAAT CA GCTGTGNAAT CGTCAGGGGG
2340
TGTCTGCTAG CCTCAACCTC CTGGGGCAGG GGACGCCGAG ACTCCGTGGG AGAAGCTCAT
2400
TCCCACATCT TGCCAAGACA GCCTTTNGTC CAGCTGTCCA CATTGAGTCA GACTGCTCCC
2460
GGGGAGAGAG CCCCGGCCCC CAGCACATAA AGAACTGCAG CCTTGGTACT GCAGAGTCTG
2520
GGTTGTAGAG AACTCTTTGT AAGCAATAAA GTTTGGGGTG ATGACAAATG TTAAAAAAAG
2580
GCCTTCGTGG CCTCGAATCA AGCTTAT CGA TACCGTCGAC CTCGAGGGGG G
2631
(2) INFORMACJA DLA ID,. SEKW. NR:<1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1253 pary zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 4:
CATTGGAGTC ACGCGGTGGC GGCGCTCTAG AATAGTGGAT CCCCGGGCTG CANGGAATTC
60
GATTCGAGCC CACGAAGGCC CCTTCTTCTG TGGTCGCGGC ACGTTTACAG CCGCAAGCAC
120
CCAGCGGCAG CTGAAGGAGG CTTTTGAGAG GCTCCTGCCC CAGGTGGAGG CGGCCCGCAA
180
GGCCATCCGC GCCGCTCAGG TGGAGCGCTA TGTGCCCGAA CACGAGCGAT GCTGCTGGTG
240
CCTGTGCTGC GGCTGTGAGG TGCGGGAACA CCTGAGCCAT GGAAACCTGA CGGTGCTGTA
300
CGGGGGGCTG CTGGAGCATC TGGCCAGCCC AGAGCACAAG AAAGCAACCA ACAAATTCTG
360
GTGGGAGAAC AAAGCTGAGG TCCAGATGAA AGAGAAGTTT CTGGTCACTC CCCAGGATTA
420
TGCGCGATTC AAGAAATCCA TGGTGAAAGG TTTGGATTCC TATGAAGAAA AGGAGGATAA
480
AGTGATCAAG GAGATGGCAG CTCAGATCCG TGAGGTGGAG CAGAGCCGAC AGGAGGTGGT
540
TCGGTCTGTC TTAGAGCCTC AGGCAGTGCC AGACCCAGAA GAGGGCTCTT CAGCACCTAG
600
AAGCTGGAAA GGGATGAACA GCCAAGTAGC TTCCAGCTTA CAGCAGCCCT CAAATTTGGA
660
CCTGCCACCA GCTCCAGAGC TTGACTGGAT GGAGACAGGA CCATCTCTGA CATTCATTGG
720
53
190 709
CCATCAGGAT ATACCAGGAG TTGGTAACAT CCACTCAGGT GCCACACGTC CCTGGATGAT
780
CCAAGATGAA GAATACATTG CTGGGAACCA AGAAATAGGA CCATCCTATG AAGAATTT CT
840
TAAAGAAAAG GAAAAACAGA AGTTGAAAAA ACTCCCCCCA GACCGAGTTG GGGCCAACTT
900
TGATCACAGC TCCAGGACCA GTGCAGGCTG GCTGCCCTCT TTTGGGCCGC GTCTGGAATA
960
ATGGACGCCG CTGGCAGTCC AGACAT CAAC TCCAAAACTG AAGCTGCAGC AATGAAGAAG
1020
CAGTCACATA CAGAAAAAAG CTAATCATGC TCTCTACCAA CTAC CAT GAG GCTAAAAGCC
1080
AAAGTCAACC AAACCCCTAT TATACCTTCC ACCCAAATTC TTTATCATTG TCTTTCTTAG
1140
GAAACAGACA TACTCATTCA TTTGATTTAA TAAAGTTTTA TTTTTCGGCC TTCGTGGCCT
1200
CGAATCAAGC TTATCGATAC CGTCGACCTC GAGGGGGGGC CGTACCCACT TTT
1253
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 417 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 5:
Ile Gly Val
1
5
Ala
Xaa
Thr
Asn
20
Arg
Trp
Arg
10
SerIle Arg
Ala
25
Arg
Ser
Arg
15
Ile
Val
HisGlu Gly
Pro
30
Phe
PheCysGlyArg
Gly Thr
Phe
35
Thr
AlaAlaSerThr
40
Gin
Arg
Glu Arg
50
Leu
Leu
ProGinValGlu
55
Ala
Ala
Ala Gin
65
Val
Glu
Leu Cys
Cys
Gly
85
Thr
Val
Lys Lys
Leu
100
Ala
115
Thr
60
Gin
45
LeuLysGluAlaPhe
Arg
LysAlaIleArgAla
Arg
70
Tyr
Val
Pro
75
Glu
His
Cys
Glu
Val
90
Arg
Glu
TyrGly Gly
Leu
105
LeuGlu His
AsnLysPheTrp
120
Trp
Glu
Asn
125
Asp
Pro
Glu
Arg
Cys
Cys
His
95
Leu
Ser
His
Gly
Leu
110
Ala
SerProGluHis
80
LysAlaGluValGin
Met Lys Glu Lys Phe Leu Val Thr Pro Gin Asp Tyr Ala Arg Phe Lys
130
135
140
54
190 709
Lys Ser MetVal Lys
145
Gly Leu Asp Ser Tyr
150
Glu Glu Lys
155
Glu Asp Lys
160
Val Ile Lys Glu Met Ala Ala Gin Ile Arg Glu Val Glu
165
170
Gin Ser Arg
175
Gin Glu Val Val Arg Ser
180
Glu Glu Gly
195
Ser
Val Leu Glu Pro Gin Ala Val Pro Asp Pro
185
190
Ser
Ala
200
ProArg Ser
Trp
205
Lys
GlyMetAsnSerGin
Val Ala SerSer Leu Gin Gin Pro Ser Asn Leu Asp Leu Pro Pro Ala
210
215
220
Pro Glu Leu
225
Asp
TrpMet Glu
230
Thr
His Gin Asp
Ile
245
ProGly Val
Gly
250
Pro Trp Met Ile Gin Asp
260
Gly
235
Asn
ProSer Leu
IleHis Ser
255
ThrPheIleGly
240
GlyAlaThrPro
Glu Glu Tyr Ile Ala Gly Asn Gin Glu Ile
265
270
Gly Pro Ser Tyr Glu Glu Phe
275
Leu Lys Glu Lys Glu
280
Lys Gin Lys Leu
285
Lys Lys LeuPro Pro Asp Arg Val Gly Ala Asn Phe Asp His Ser Ser
290
295
300
Arg Thr SerAla Gly
305
Trp Leu Pro Ser Phe
310
Gly Pro Arg
315
Leu Glu Xaa
320
Trp Thr ProLeu Ala Val Gin Thr Ser Thr Pro Lys Leu
325
330
Lys Leu Gin
335
Gin Xaa Arg Ser Ser His
340
Ile Gin Lys Lys Ala Asn His Ala Leu Tyr
345
350
Gin Leu ProXaa Gly Xaa Lys
355
Pro Lys Ser Thr Lys
360
Pro Leu Leu Tyr
365
Leu Pro Pro Lys Phe Phe Ile Ile Val Phe Leu Arg Lys Gin Thr Tyr
370
375
380
Ser Phe Ile Xaa Phe
385
Asn Lys Val Leu Phe
390
Phe Gly Leu
395
Arg Gly Leu
400
Glu Ser SerLeu Ser Ile Pro Ser Thr Ser Arg Gly Gly
405
410
Arg Thr His
415
Phe
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4596 par zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
55
190 709
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 6:
AGCGGGGGGA CTGTGCCGTG TGGAACGTGT AGCTGTTGAA GGTGGACTCT GTTACCATTG
60
AGGATGTTTG GAGGATGAGT ATGTGTGGCA GAGG CACACA TAAACAGGCA GAGACCCTTT
120
GCCCCTGCCT TTCTCCCCCA ACCCAAGGCT GACCTGTGTT CTCCCAGGTC TGGGATTCTA
180
AGTGACCTGC TCTGTGTTTG GTCTCTCTCA GGATGAGCAC AAGCCTGGGA GATGGCAGTG
240
ATGGAAATGG CCTGCCCAGG TGCCCCTGGC TCAGCAGTGG GGCAGCAGAA GGAACTCCCC
300
AAGCCAAAGG AGAAGACGCC GCCACTGGGG AAGAAACAGA GCTCCGTCTA CAAGCTTGAG
360
GCCGTGGAGA AGAGCCCTGT GTTCTGCGGA AAGTGGGAGA TCCTGAATGA CGTGATTACC
420
AAGGGCACAG CCAAGGAAGG CTCCGAGGCA GGGCCAGCTG CCATCTCTAT CATCGCCCAG
480
GCTGAGTGTG AGAATAGCCA AGAGTTCAGC CCCACCTTTT CAGAACG CAT TTTCATCGCT
540
GGGTCCAAAC AGTACAGCCA GTCCGAGAGT CTTGATCAGA TCCCCAACAA TGTGGCCCAT
600
GCTACAGAGG GCAAAATGGC CCGTGTGTGT TGGAAGGGAA AGCGTCGCAG CAAAGCCCGG
660
AAGAAACGGA AGAAGAAGAG CTCAAAGTCC CTGGCTCATG CAGGAGTGGC CTTGGCCAAA
720
CCCCTCCCCA GGACCCCTGA GCAGGAGAGC TGCACCATCC CAGTGCAGGA GGATGAGTCT
780
CCACTCGGCG CCCCATATGT TAGAAACACC CCGCAGTTCA CCAAGCCTCT GAAGGAACCA
840
GGCCTTGGGC AACTCTGTTT TAAGCAGCTT GGCGAGGGCC TACGGCCGGC TCTGCCTCGA
900
TCAGAACTCC ACAAACTGAT CAGCCCCTTG CAATGTCTGA ACCACGTGTG GAAACTGCAC
960
CACCCCCAGG ACGGAGGCCC CCTGCCCCTG CCCACGCACC CCTTCCCCTA TAGCAGACTG
1020
CCTCATCCCT TCCCATTCCA CCCTCTCCAG CCCTGGAAAC CTCACCCTCT GGAGTCCTTC
1080
CTGGGCAAAC TGGCCTGTGT AGACAGCCAG AAACCCTTGC CTGACCCACA CCTGAGCAAA
1140
CTGGCCTGTG TAGACAGTCC AAAGCCCCTG CCTGGCCCAC ACCTGGAGCC CAGCTGCCTG
1200
TCTCGTGGTG CCCATGAGAA GTTTTCTGTG GAGGAATACC TAGTGCATGC TCTGCAAGGC
1260
AGCGTGAGCT CAAGCCAGGC CCACAGCCTG ACCAGCCTGG CCAAGACCTG GGCAGCACGG
1320
GGCTCCAGAT CCCGGGAGCC CAGCCCCAAA ACTGAGGACA ACGAGGGTGT CCTGCTCACT
1380
GAGAAACTCA AGCCAGTGGA TTATGAGTAC CGAGAAGAAG TCCACTGGGC CACGCACCAG
1440
CTCCGCCTGG GCAGAGGCT C CTT CGGAGAG GTGCACAGGA TGGAGGACAA GCAGACTGGC
1500
TTCCAGTGCG CTGTCAAAAA GGTGCGCCTG GAAGTATTTC GGGCAGAGGA GCTGATGGCA
1560
56
190 709
TGTGCAGGAT TGACCTCACC CAGAATTGTC CCTTTGTATG GAGCTGTGAG AGAAGGGCCT
1620
TGGGT CAACA TCTTCATGGA GCTGCTGGAA GGTGGCTCCC TGGGCCAGCT GGT CAAGGAG
1680
CAGGGCTGTC TCCCAGAGGA CCGGGCCCTG TACTACCTGG GCCAGGCCCT GGAGGGTCTG
1740
GAATACCTCC ACT CACGAAG GATTCTGCAT GGGGACGT CA AAGCTGACAA CGTGCTCCTG
1800
TCCAGCGATG GGAGCCACGC AGCCCTCTGT GACTTTGGCC ATGCTGTGTG TCTTCAACCT
1860
GATGGCCTGG GAAAGTCCTT GCTCACAGGG GACTACATCC CTGGCACAGA GACCCACATG
1920
GCTCCGGAGG TGGTGCTGGG CAGGAGCTGC GACGCCAAGG TGGATGTCTG GAGCAGCTGC
1980
TGTATGATGC TGCACATGCT CAACGGCTGC CACCCCTGGA CTCAGTTCTT CCGAGGGCCG
2040
CTCTGCCTCA AGATTGCCAG CGAGCCTCCG CCTGTGAGGG AGATCCCACC CTCCTGCGCC
2100
CCTCTCACAG CCCAGGCCAT CCAAGAGGGG CTGAGGAAAG AGCCCATCCA CCGCGTGTCT
2160
GCAGCGGAGC TGGGAGGGAA GGTGAACCGG GCACTACAGC AAGTGGGAGG TCTGAAGAGC
2220
CCTTGGAGGG GAGAATATAA AGAACCAAGA CATCCACCGC CAAATCAAGC CAATTACCAC
2280
CAGACCCTCC ATGCCCAGCC GAGAGAGCTT TCGCCAAGGG CCCCAGGGCC CCGGCCAGCT
2340
GAGGAGACAA CAGGCAGAGC CCCTAAGCTC CAGCCTCCTC TCCCACCAGA GCCCCCAGAG
2400
CCAAACAAGT CTCCTCCCTT GACTTTGAGC AAGGAGGAGT CTGGGATGTG GGAACCCTTA
2460
CCTCTGTCCT CCCTGGAGCC AGCCCCTGCC AGAAACCCCA GCTCACCAGA GCGGAAAGCA
2520
ACCGTCCCGG AGCAGGAACT GCAGCAGCTG GAAATAGAAT TATTCCTCAA CAGCCTGTCC
2580
CAGCCATTTT CTCTGGAGGA GCAGGAGCAA ATTCTCTCGT GCCTCAGCAT CGACAGCCTC
2640
TCCCTGTCGG ATGACAGTGA GAAGAACCCA TCAAAGGCCT CTCAAAGCTC GCGGGACACC
2700
CTGAGCTCAG GCGTACACTC CTGGAGCAGC CAGGCCGAGG CTCGAAGCTC CAGCTGGAAC
2760
ATGGTGCTGG CCCGGGGGCG GCCCACCGAC ACCCCAAGCT ATTTCAATGG TGTGAAAGTC
2820
CAAATACAGT CTCTTAATGG TGAACACCTG CACATCCGGG AGTTCCACCG GGTCAAAGTG
2880
GGAGACATCG CCACTGGCAT CAGCAGCCAG ATCCCAGCTG CAGCCTTCAG CTTGGTCACC
2940
AAAGACGGGC AGCCTGTTCG CTACGACATG GAGGTGCCAG ACTCGGGCAT CGACCTGCAG
3000
TGCACACTGG CCCCTGATGG CAGCTTCGCC TGGAGCTGGA GGGTCAAGCA TGGCCAGCTG
3060
GAGAACAGGC CCTAACCCTG CCCTCCACCG CCGGCTCCAC ACTGCCGGAA AGCAGCCTTC
3120
CTGCTCGGTG CACGATGCTG CCCTGAAAAC ACAGGCTCAG CCGTTCCCAG GGGATTGCCA
3180
GCCCCCCGGC TCACAGTGGG AACCAGGGCC TCGCAGCAGC AAGGTGGGGG CAAGCAGAAT
3240
GCCTCCCAGG ATTTCACACC TGAGCCCTGC CCCACCCTGC TGAAAAAACA TCCGCCACGT
3300
GAAGAGACAG AAGGAGGATG GCAGGAGTTA CCTGGGGAAA CAAAACAGGG ATCTTTTTCT
3360
190 709
57
GCCCCTGCTC CAGTCGAGTT GGCCTGACCC GCTTGGATCA GTGACCATTT GTTGGCAGAC
3420
AGGGGAGAGC AGCTTCCAGC CTGGGTCAGA AGGGGTGGGC GAGCCCTTCG GCCCCTCACC
3480
CTCCAGGCTG CTGTGAGAGT GTCAAGTGTG TAAGGGCCCA AACTCAGGTT CAGTGCAGAA
3540
CCAGGTCAGC AGGTATGCCC GCCCGTAGGT TAAGGGGGCC CTCTAAACCC CTTGCCTGGC
3600
CTCACCTGGC CAGCTCACCC CTTTTGGGTG TAGGGGAAAA GAATGCCTGA CCCTGGGAAG
3660
GCTCCCTGGT AGAATACACC ACACTTTTCA GGTTGTTGCA ACACAGGTCC TGAGTTGACC
3720
TCTGGTTCAG CCAAGGACCA AAGAAGGTGT GTAAGTGAAG TGGTTCTCAG TCCCCAGACA
3780
TGTGCCCCTT TGCTGCTGGC TACCACTCTT CCCCAGAGCA GCAGGCCCCG AGCCCCTTCA
3840
GGCCCAGCAC TGCCCCAGAC TCGCTGGCAC TCAGTTCCCT CATCTGTAAA GGTGAAGGGT
3900
GATGCAGGAT ATGCCTGACA GGAACAGTCT GTGGATGGAC ATGATCAGTG CTAAGGAAAG
3960
CAGCAGAGAG AGACGTCCGG CGCCCCAGCC CCACTATCAG TGTCCAGCGT GCTGGTTCCC
4020
CAGAGCACAG CTCAGCATCA CACTGACACT CACCCTGCCC TGCCCCTGGC CAGAGGGTAC
4080
TGCCGACGGC ACTTTGCACT CTGATGACCT CAAAGCACTT TCATGGCTGC CCTCTGGCAG
4140
GGCAGGGCAG GGCAGTGACA CTGTAGGAGC ATAGCAAGCC AGGAGATGGG GTGAAGGGAC
4200
ACAGTCTTGA GCTGTCCACA TGCATGTGAC TCCTCAAACC TCTTCCAGAT TTCTCTAAGA
4260
ATAGCACCCC CTTCCCCATT GCCCCAGCTT AGCCTCTTCT CCCAGGGGAG CTACTCAGGA
4320
CTCACGTAGC ATTAAATCAG CTGTGAATCG TCAGGGGGTG TCTGCTAGCC TCAACCTCCT
4380
GGGGCAGGGG ACGCCGAGAC TCCGTGGGAG AAGCTCATTC CCACATCTTG CCAAGACAGC
4440
CTTTGTCCAG CTGTCCACAT TGAGTCAGAC TGCTCCCGGG GAGAGAGCCC CGGCCCCCAG
4500
CACATAAAGA ACTGCAGCCT TGGTACTGCA GAGTCTGGGT TGTAGAGAAC TCTTTGTAAG
4560
CAATAAAGTT TGGGGTGATG ACAAATGTTA AAAAAA
4596
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR : 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 947 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 7:
Met Ala Val Met Glu Met Ala Cys Pro Gly Ala Pro Gly Ser Ala Val
1
5
10
15
58
190 709
Gly Gin
Gly Lys
Gin Lys Glu Leu Pro Lys Pro Lys Glu Lys Thr
Pro Pro
Leu
Lys Gin Ser Ser Val Tyr Lys Leu Glu Ala Val
Glu Lys
Ser
Asn Asp Val Ile Thr
Lys
20
25
35
40
45
Pro Val Phe Cys Gly Lys Trp Glu Ile Leu
50
55
30
60
Gly Thr
AlaLys Glu Gly Ser Glu Ala Gly Pro
Ala Ala Ile
Ile Ala
GinAla Glu Cys Glu Asn Ser Gin Glu
Phe Ser Pro Thr Phe
Ser Glu
Arg Ile
65
Ser Leu
70
75
85
90
Phe
100
Ile
Ala
105
Gly
Ser
120
125
Met Ala Arg Val Cys Trp Lys Gly Lys Arg
130
135
80
95
Asp Gin Ile Pro Asn Asn Val Ala His Ala Thr
115
Ser Ile
Lys
Gin
Glu Gly
Lys
110
His Ala Gly Val Ala
Leu Ala
LysPro Leu Pro Arg Thr Pro Glu Gin
Glu Ser Cys Thr Ile
Pro Val
Gin Glu
Thr Pro
155
165
170
Asp
180
Glu
Ser
185
210
Pro
Leu
Gly
190
Ala
Gly Gin
Leu
Pro Ala Leu Pro Arg
Ser
205
215
220
Glu Leu
HisLys Leu Ile Ser Pro Leu Gin Cys
Leu Asn His Val Trp
Lys Leu
HisHis Pro Gin Asp Gly Gly Pro Leu
Pro Leu Pro Thr His
Pro Phe
Pro Tyr
225
Gin Pro
230
235
245
250
Ser
260
Arg
Leu
265
290
Pro
His
285
295
Pro
270
Phe
Lys Leu Ala
Pro His Leu Ser Lys Leu
300
Ala Cys
ValAsp Ser Pro Lys Pro Leu Pro Gly
Pro His Leu Glu Pro
Ser Cys
LeuSer Arg Gly Ala His Glu Lys Phe
Ser Val Glu Glu Tyr
305
310
325
315
330
Val
Arg
Pro
Phe
His
Pro
255
280
Cys Val Asp Ser Gin Lys Pro Leu Pro Asp
Tyr
240
Trp Lys Pro His Pro Leu Glu Ser Phe Leu Gly
275
Pro
175
200
Cys Phe Lys Gin Leu Gly Glu Gly Leu Arg
Ser
160
Gin Phe Thr Lys Pro Leu Lys Glu Pro Gly Leu
195
Gin
140
LysLys Lys Ser Ser Lys Ser Leu Ala
150
Ser
Arg Ser Lys Ala Arg Lys
Lys Arg
145
Tyr
320
335
190 709
59
Leu Val His Ala Leu Gin Gly Ser Val Ser Ser Ser Gin Ala His Ser
340
345
Leu Thr Ser LeuAla Lys Thr
Trp Ala Ala Arg Gly
355
Glu Pro Ser Pro Lys Thr
370
360
Glu Asp Asn Glu Gly
375
Lys Leu Lys Pro Val
Asp Tyr Glu Tyr
Thr His Gin Leu Arg
Leu Gly Arg Gly
Met
Lys
385
405
Glu
Asp
420
390
Gin
Leu Glu Val PheArg Ala Glu
450
Leu
470
Glu
His Gly Asp ValLys Ala Asp
530
Val
Trp
Asp
Val
580
Cys His Pro
595
Ser
TrpThr Gin Phe
Ala Ser Glu Pro Pro Pro
610
Leu
GluTyrLeu
His
510
Met
LeuAsnG
Ser Asp Gly Ser
525
Cys Leu Gin Pro Asp
540
560
Gly Arg Ser Cys Asp Ala Lys
570
575
Cys
Val Arg Glu Ile Pro
615
Glu Leu Gly Gly
645
His
495
CysMetMet
600
Arg Val Ser Ala Ala
ArgIleL
480
Phe Arg Gly Pro Leu
630
Arg
460
555
Ser
Ile Gin Glu Gly
625
Ser
445
Asp Tyr Ile Pro Gly Thr Glu
585
Leu Thr Ala Gin Ala
LysValA
Asp Arg Ala Leu Tyr Tyr Leu
535
Glu Val Val Leu
Lys
Ala Gly Leu Thr
490
Phe Gly His Ala Val
Thr His Met Ala Pro
Val
Arg Glu Gly Pro Trp
520
550
Ala
430
475
Gly
Leu Leu Thr Gly
565
PheGinCys
Gly Gly Ser Leu Gly Gin Leu
505
Gly Leu Gly Lys Ser
545
Gly
Asn Val Leu Leu Ser
515
His Ala Ala Leu Cys Asp
415
455
Gly Gin
Ala
Ser Phe Gly Glu Val His Arg
410
Leu Tyr Gly Ala Val
Cys Leu Pro Glu
500
400
440
Val Lys Glu Gin Gly
485
380
395
Thr
Glu Leu Leu Glu
465
365
Arg Glu Glu Val His Trp Ala
425
Val Asn Ile Phe Met
Ser Arg Ser Arg
Val Leu Leu Thr Glu
Glu Leu Met Ala Cys
435
Ser Pro Arg Ile Val Pro
350
Leu
590
Cys Leu Lys Ile
605
Pro Ser Cys Ala Pro
620
Leu Arg Lys Glu Pro Ile
635
His
640
Lys Val Asn Arg Ala Leu Gin
650
655
60
190 709
Gin Val Gly Gly Leu Lys Ser Pro Trp Arg Gly Glu Tyr Lys Glu Pro
670
660
665
Arg His Pro Pro Pro Asn Gin Ala Asn Tyr His Gin Thr Leu His Ala
675
685
680
Gin Pro Arg Glu Leu Ser Pro Arg Ala Pro Gly Pro Arg Pro Ala Glu
690
700
695
Glu Thr Thr Gly Arg Ala Pro Lys Leu Gin Pro Pro Leu Pro Pro Glu
705
720
710
715
Pro Pro Glu Pro Asn Lys Ser Pro Pro Leu Thr Leu Ser Lys Glu Glu
735
725
730
Ser Gly Met Trp Glu Pro Leu Pro Leu Ser Ser Leu Glu Pro Ala Pro
750
740
745
Ala Arg Asn Pro Ser Ser Pro Glu Arg Lys Ala Thr Val Pro Glu Gin
755
765
760
Glu Leu Gin Gin Leu Glu Ile Glu Leu Phe Leu Asn Ser Leu Ser Gin
770
780
775
Pro Phe Ser Leu Glu Glu Gin Glu Gin Ile Leu Ser Cys Leu Ser Ile
785
800
790
795
Asp Ser Leu Ser Leu Ser Asp Asp Ser Glu Lys Asn Pro Ser Lys Ala
815
805
810
Ser Gin Ser Ser Arg Asp Thr Leu Ser Ser Gly Val His Ser Trp Ser
830
820
825
Ser Gin Ala Glu Ala Arg Ser Ser Ser Trp Asn Met Val Leu Ala Arg
335
845
840
Gly Arg Pro Thr Asp Thr Pro Ser Tyr Phe Asn Gly Val Lys Val Gin
850
860
855
Ile Gin Ser Leu Asn Gly Glu His Leu His Ile Arg Glu Phe His Arg
865
880
875
870
Val Lys Val Gly Asp Ile Ala Thr Gly Ile Ser Ser Gin Ile Pro Ala
895
885
890
Ala Ala Phe Ser Leu Val Thr Lys Asp Gly Gin Pro Val Arg Tyr Asp
910
900
905
Met Glu Val Pro Asp Ser Gly Ile Asp Leu Gin Cys Thr Leu Ala Pro
925
915
920
Asp Gly Ser Phe Ala Trp Ser Trp Arg Val Lys His Gly Gin Leu Glu
940
930
935
Asn Arg Pro
945
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:8:
190 709
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
(A) OPIS: /desc = "oligonucleotide PCR
primer"
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 8:
CAGGATCCTC ATGGCTGCAG CTAGCGTGAC
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NICIOWOŚĆ: pojedynicza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
(A) OPIS: /desc = "oligonucleotide PCR
primer"
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 9:
GGTCGACTTA GAGCCCTGTC AGGTCCACAA TG
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2 4 par zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
(A) OPIS: /desc = "oligonucleotide probe"
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 10:
GATGCCATTG GGGATTTCCT CTTT
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2 4 pary zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
61
190 709
62
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy
(A) OPIS: /desc = "oligonucleotide probe"
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR: 11:
CAGTAAAGAG GAAATCCCCA ATGG
190 709
FIG. 2a
63
64
190 709
FIG. 2B
190 709
FIG. 3A
65
66
190 709
FIG . 3B
190 709
F IG . 3C
67
68
190 709
FIG . 3D
190 709
69
FIG. 4A
70
190 709
FIG. 4B
190 709
FIG. 5A
71
72
190 709
F IG . 5B
190 709
73
FIG . 6A
74
190 709
FIG. 6B
190 709
FIG.
75
6C
76
190 709
F IG . 6D
190 709
F i g . 6E
77
78
190 709
FIG . 6F
190 709
F IG . 6G
79
80
190 709
FIG. 7A
190 709
Fig.
7B
81
82
190 709
FIG. 7C
190 709
Fig.
7D
83
84
190 709
FIG. 7E
190 709
F ig.
7F
85
86
190 709
FIG. 7G
190 709
F ig .
7H
87
88
190 709
FIG. 71
190 709
Fig.
7J
89
90
190 709
FIG. 7K
190 709
Fig.
7L
91
92
190 709
FIG. 7M
190 709
Fig.
93
7N
94
190 709
FIG. 70
190 709
Fig. 7P
95
96
190 709
FIG. 7Q
190 709
Fig.
7R
97
98
190 709
FIG. 7S
190 709
Fig.
7T
99
100
190 709
FIG. 7U
190 709
F ig.
101
7V
102
190 709
FIG. 7W
190 709
Fig.
7X
103
104
190 709
FIG. T i
190 709
Fig.
IZ
105
106
190 709
FIG. 7AA
190 709
Fig.
107
7BB
108
190 709
F IG . 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.
Cena 6,00 zł.