Streszczenie PCR w czasie rzeczywistym stała się jedną z

advertisement
Streszczenie
PCR w czasie rzeczywistym stała się jedną z najczęściej używanych metod analizy
ilościowej stosowanych w biologii molekularnej i diagnostyce medycznej. Metoda łączy w
sobie klasyczną reakcję PCR oraz detekcję ilości produktu. Oznaczenie w czasie
rzeczywistym zwiększenia liczby kopii badanego fragmentu możliwe jest dzięki
zastosowaniu niespecyficznych barwników lub specyficznych sond fluorescencyjnych,
które po związaniu z cząsteczką DNA generują sygnał fluorescencji o intensywności
proporcjonalnej do ilości powstałego produktu. Dokładność i powtarzalność analizy
ilościowej uzależniona jest nie tylko od metod śledzenia przebiegu reakcji PCR i składu
mieszaniny reakcyjnej, ale również stosowanych modeli matematycznych niezbędnych do
analizy danych doświadczalnych. Kluczowymi etapami analizy jest określenie cyklu
progowego reakcji, wydajności powielania oraz ilości amplikonu. Cykl progowy reakcji
PCR jest to numer cyklu, w którym ilość cząsteczek produktu reakcji PCR generuje sygnał
fluorescencji o intensywności osiągającej wartość progową fluorescencji, ustalaną w fazie
wykładniczej reakcji PCR. W celu wyznaczenia cyklu progowego stosuje się metodę
analizy szumów lub metodę analizy maksimum drugiej pochodnej. Wydajność
powielania, zależna od składników reakcji PCR jest ważnym czynnikiem podczas
wykonywania analizy ilościowej i ma największy wpływ na kinetykę tej reakcji. Metody
obliczania wydajności można podzielić na metody pośrednie i bezpośrednie. Bezpośrednie
metody oparte są na metodach wykorzystujących krzywą standardową lub na pomiarze
wzrostu fluorescencji w fazie wykładniczej. Natomiast metody pośrednie wykorzystują
obliczenia wydajności na podstawie dopasowania modeli matematycznych takich jak
model sigmoidalny lub logistyczny oraz dopasowanie krzywej wykładniczej. W celu
wyznaczenia stężenia badanej sekwencji w próbach można stosować dwie metody,
bezwzględną i względną analizę ilościową. W metodzie bezwzględnej analizy ilościowej
wykorzystuje się krzywą standardową określoną na podstawie serii rozcieńczeń roztworu
zawierającego znane stężenia oczyszczonego produktu PCR lub innego standardu
zawierającego powielaną sekwencję. Względne metody analizy ilościowej mierzą zmiany
początkowej ilości DNA względem kalibratora. Na podstawie stosunku ilości produktów
PCR w próbie badanej do kalibratora oszacowuje się początkową ilość badanej sekwencji.
Istnieje również możliwość połączenia względnej i bezwzględnej metody analizy
ilościowej za pomocą sigmoidalnego dopasowania krzywej opierającego się na
dopasowaniu modelu matematycznego do kinetyki reakcji PCR. Ta metoda modelowania
reakcji PCR za pomocą regresji nieliniowej daje możliwość wyznaczenia bezwzględnej
ilości badanej sekwencji, nie wymagając przy tym generowania krzywej standardowej.
Ponieważ ilościowa PCR staje się coraz ważniejszą i dostępną technologią należy sobie
zdawać sprawę z wielu opcji analizy danych. W przeciwieństwie do tradycyjnej metody
PCR, istnieje wiele złożoności związanych z metodą ilościowej PCR, które mogą mieć
wpływ na ostateczne wyniki. Jednak dobrze zaprojektowany i zrealizowany PCR w czasie
rzeczywistym może być jedną z najbardziej wrażliwych, wydajnych, szybkich i
powtarzalnych metod analizy DNA, jakościowej i przede wszystkim ilościowej.
Download