Streszczenie PCR w czasie rzeczywistym stała się jedną z
advertisement
Streszczenie PCR w czasie rzeczywistym stała się jedną z najczęściej używanych metod analizy ilościowej stosowanych w biologii molekularnej i diagnostyce medycznej. Metoda łączy w sobie klasyczną reakcję PCR oraz detekcję ilości produktu. Oznaczenie w czasie rzeczywistym zwiększenia liczby kopii badanego fragmentu możliwe jest dzięki zastosowaniu niespecyficznych barwników lub specyficznych sond fluorescencyjnych, które po związaniu z cząsteczką DNA generują sygnał fluorescencji o intensywności proporcjonalnej do ilości powstałego produktu. Dokładność i powtarzalność analizy ilościowej uzależniona jest nie tylko od metod śledzenia przebiegu reakcji PCR i składu mieszaniny reakcyjnej, ale również stosowanych modeli matematycznych niezbędnych do analizy danych doświadczalnych. Kluczowymi etapami analizy jest określenie cyklu progowego reakcji, wydajności powielania oraz ilości amplikonu. Cykl progowy reakcji PCR jest to numer cyklu, w którym ilość cząsteczek produktu reakcji PCR generuje sygnał fluorescencji o intensywności osiągającej wartość progową fluorescencji, ustalaną w fazie wykładniczej reakcji PCR. W celu wyznaczenia cyklu progowego stosuje się metodę analizy szumów lub metodę analizy maksimum drugiej pochodnej. Wydajność powielania, zależna od składników reakcji PCR jest ważnym czynnikiem podczas wykonywania analizy ilościowej i ma największy wpływ na kinetykę tej reakcji. Metody obliczania wydajności można podzielić na metody pośrednie i bezpośrednie. Bezpośrednie metody oparte są na metodach wykorzystujących krzywą standardową lub na pomiarze wzrostu fluorescencji w fazie wykładniczej. Natomiast metody pośrednie wykorzystują obliczenia wydajności na podstawie dopasowania modeli matematycznych takich jak model sigmoidalny lub logistyczny oraz dopasowanie krzywej wykładniczej. W celu wyznaczenia stężenia badanej sekwencji w próbach można stosować dwie metody, bezwzględną i względną analizę ilościową. W metodzie bezwzględnej analizy ilościowej wykorzystuje się krzywą standardową określoną na podstawie serii rozcieńczeń roztworu zawierającego znane stężenia oczyszczonego produktu PCR lub innego standardu zawierającego powielaną sekwencję. Względne metody analizy ilościowej mierzą zmiany początkowej ilości DNA względem kalibratora. Na podstawie stosunku ilości produktów PCR w próbie badanej do kalibratora oszacowuje się początkową ilość badanej sekwencji. Istnieje również możliwość połączenia względnej i bezwzględnej metody analizy ilościowej za pomocą sigmoidalnego dopasowania krzywej opierającego się na dopasowaniu modelu matematycznego do kinetyki reakcji PCR. Ta metoda modelowania reakcji PCR za pomocą regresji nieliniowej daje możliwość wyznaczenia bezwzględnej ilości badanej sekwencji, nie wymagając przy tym generowania krzywej standardowej. Ponieważ ilościowa PCR staje się coraz ważniejszą i dostępną technologią należy sobie zdawać sprawę z wielu opcji analizy danych. W przeciwieństwie do tradycyjnej metody PCR, istnieje wiele złożoności związanych z metodą ilościowej PCR, które mogą mieć wpływ na ostateczne wyniki. Jednak dobrze zaprojektowany i zrealizowany PCR w czasie rzeczywistym może być jedną z najbardziej wrażliwych, wydajnych, szybkich i powtarzalnych metod analizy DNA, jakościowej i przede wszystkim ilościowej.
