Mikrosekwencjonowanie białek i peptydów
advertisement
Rozdział 9 Mikrosekwencjonowanie białek i peptydów 9.1. Zarys historyczny sekwencjonowania łańcucha polipeptydowego Sekwencjonowaniem białek nazywamy techniki prowadzące do poznania struktury pierwszorzędowej ich łańcucha polipeptydowego czyli innymi słowy określania kolejności aminokwasów w tym łańcuchu. Jest to więc metoda nastawiona przede wszystkim na wynik jakościowy, w odróŜnieniu od omówionej wcześniej w rozdziale 7 analizy składu aminokwasowego, która jest metodą ilościową. Analiza składu aminokwasowego mówi bowiem ile jakich reszt znajduje się w próbce lecz nie podaje ich kolejności w wyjściowym łańcuchu polipeptydowym. Fundamentalna róŜnica między technikami analizy aminokwasowej i sekwencjonowania wynika jednak z tego, Ŝe skład aminokwasowy jest jedynie statycznym parametrem analitycznym, natomiast sekwencja reszt aminokwasowych w białku daje badaczom potęŜne narzędzie badań funkcjonalnych na zintegrowanym poziomie zarówno proteomu jak i genomu. Bardzo trudno wymienić jakieś konkretne zastosowanie sekwencjonowania białek i peptydów, jest to po prostu podstawowe narzędzie charakterystyki kaŜdego łańcucha polipeptydowego, fundament chemii białek, biologii molekularnej oraz biologii porównawczej i ewolucyjnej. Historia sekwencjonowania białek jest nieodłącznie związana z nazwiskiem szwedzkiego badacza Petera Edmana, który w latach pięćdziesiątych XX wieku zaproponował do kolejnego odszczepiania aminokwasów od N-końca białka uŜycie fenyloizotiocyjanianu (PITC) oraz przedstawił mechanizm takiej reakcji (nazwanej później degradacją Edmana). Jego pionierskie prace doprowadziły najpierw do opracowania szczegółowego ciągu reakcji umoŜliwiających ręczne przeprowadzenie odszczepiania aminokwasów, a później pozwoliły na skonstruowanie urządzenia zdolnego do samoczynnego wykonywania tych reakcji, czyli automatycznego sekwenatora białek. Aparat taki został skonstruowana po raz pierwszy w Sant Vincent's School of Medical Research w Melbourne w Australii, gdzie Edman po emigracji w roku 1957 otrzymał posadę dyrektora do spraw badań naukowych. Pierwszy prototypowy automatyczny sekwenator został ostatecznie ukończony w roku 1967, natomiast w roku 1969 amerykańska firma Beckman wypuściła na rynek pierwszy komercyjny sekwenator oparty na projekcie Edmana. Urządzenie to wykorzystywało nietypowy reaktor chemiczny w postaci szybko wirującego kubka szklanego i stąd teŜ wywodziła się jego angielska nazwa „spinning-cup seqenator”. Na zmatowionej wewnętrznej powierzchni tego kubka szklanego absorbowano sekwencjonowane białka w formie cienkiej warstwy (filmu), chemikalia były dozowane przez odpowiednie pompy na dno kubka i pod wpływem siły odśrodkowej opływały próbkę wchodząc kolejno w niezbędne reakcje. Cały ten obrotowy reaktor był hermetycznie zamknięty i pracował pod ochronną atmosferą argonu ze względu na wraŜliwość produktów pośrednich sekwencjonowania na utlenianie. Odszczepione reszty identyfikowano technikami analizy aminokwasowej. Do uzyskania sekwencji niezbędne było kilkaset nanomoli białka, zaś cykl reakcji prowadzących do odszczepienia jednej reszty trwał około 1,5 godziny. W roku 1971 ukazał się na rynku następny udoskonalony model sekwenatora, zwany sekwenatorem z fazy stałej (ang. solid-phase sequenator). Posiadał on te same parametry funkcjonalne co aparat poprzedni lecz był duŜo bardziej niezawodny bowiem skomplikowany układ wirującego kubka został w nim zastąpiony kolumienką z kowalencyjnie związanym sekwencjonowanym białkiem. Białko to było wiązane do wypełnienia kolumny poprzez ugrupowania γ-karboksylowe kwasu glutaminowego, dlatego teŜ w uzyskiwanych sekwencjach aminokwas ten nie był oznaczany. Sekwenator był niezawodny i prosty w konstrukcji bowiem reakcje były przeprowadzane wskutek prostego pompowania chemikaliów przez sekwencjonowania kolumnę tylko z białek immobilizowanym zawierających białkiem. niezbędny do Niestety moŜliwość immobilizacji kwas glutaminowy (i to w dodatku ulokowany blisko C-końca) znacznie ograniczała jego funkcjonalność. Na pojawienie się kolejnego, ulepszonego modelu trzeba było czekać do roku 1981, kiedy to zaprezentowano konstrukcję podobną lecz zawierającą dwa istotne usprawnienia. Pierwszym ulepszeniem był efektywny sposób immobilizacji próbek zarówno białek jak i peptydów za pomocą polikationowego polimeru o nazwie polibren (ang. polybrene, patrz rozdział 9.3), którym pokryty był mikroporowaty filtr z włókniny szklanej. Białka i peptydy efektywnie wiązały się za pomocą jonowych oddziaływań niekowalencyjnych z powierzchnią polimeru na filtrze i pozostawały na nim trwale związane pod warunkiem unikania kontaktu takiej matrycy z wodnymi roztworami elektrolitów. Reakcje sekwencjonowania na filtrze pokrytym polibrenem prowadzone były podobnie jak w poprzednim modelu sekwenatora, czyli chemikalia przepływały przez mikroporowaty filtr z próbką, analogicznie jak przez kolumnę. Natomiast druga innowacja zastosowana w sekwenatorze z roku 1981 polegała na tym, Ŝe niektóre reakcje były prowadzone w fazie gazowej. Innymi słowy na filtr z immobilizowanym białkiem lub peptydem dozowano nie porcję roztworu z danym odczynnikiem lecz lotny, gazowy odpowiednik tego odczynnika. Pozwoliło to znacznie zmniejszyć zanieczyszczenia systematyczne stosowanych odczynników i ograniczyć jej stopniową hydrolizę, a tym samym wydatnie zwiększyć czułość. Sekwenator był w stanie oznaczyć sekwencję na poziomie czułości 5 pikomoli, zaś czas odszczepienia jednej reszty mieścił się w granicach 50 minut. Taka konstrukcja zasadniczej części sekwenatora przetrwała do chwili obecnej, bez zmian przetrwała równieŜ główna część chemiczna procesu odszczepiania reszt, nadal oparta na reakcji z PITC. Współczesne urządzenia w większości składają się z jednostki głównej automatycznie odszczepiającej aminokwasy od N-końca immobilizowanego za pomocą polibrenu białka oraz z oddzielnej jednostki będącej funkcjonalnie automatycznym analizatorem aminokwasowym odszczepianych reszt. Jedyne wprowadzone usprawnienia dotyczą minimalizacji konsumpcji odczynników oraz doskonalenia konstrukcji zaworów i pomp. Ponadto stale ulepsza i optymalizuje się protokoły reakcji chemicznych prowadzonych przez sekwenator, a takŜe wprowadza modyfikacje samej reakcji sekwencjonowania, zwłaszcza w kierunku moŜliwości uzyskiwania sekwencji równieŜ od C-końca. 9.2. Reakcje przeprowadzane podczas sekwencjonowania łańcucha polipeptydowego od N-końca Wszystkie współczesne automatyczne sekwenatory białek i peptydów wykorzystują reakcje z PITC do kolejnego odszczepiania i identyfikacji reszt aminokwasowych od N-końca. Przebieg reakcji oraz operacji wykonywanych przez sekwenator sprowadza się do siedmiu zasadniczych etapów: 1. Sprzęganie z fenyloizotiocyjanianem (PITC) PITC uŜywany na tym etapie występuje w postaci roztworu w n-heptanie i ilościowo reaguje z wszystkimi wolnymi grupami aminowymi białek, w tym z N-końcową. PoniewaŜ reakcja z PITC wymaga utrzymania zasadowego pH, przed reakcją sprzęgania na białko dozowana jest porcja lotnej zasady organicznej, N-metylopiperydyny. Powstała fenylotiokarbamidowa pochodna (PTC-pochodna) łańcucha polipeptydowego jest wraŜliwa na utlenienie i w związku z tym ten etap reakcji, jak i zresztą wszystkie następne, jest prowadzony w atmosferze argonu. 2. Ekstrakcja produktów ubocznych sprzęgania Etap ten ma na celu zmycie z próbki resztek PITC, metylopiperydyny i wszelkich innych pozostałych ewentualnych produktów ubocznych reakcji PITC z zanieczyszczeniami niskocząsteczkowymi próbki. Ekstrakcja odbywa się pod działaniem przepływających kolejno przez próbkę dwóch rozpuszczalników organicznych, octanu etylu i chlorobutanu, tak dobranych pod względem swych własności fizykochemicznych, by selektywnie zmywały zanieczyszczenia nie naruszając immobilizowanej próbki białka czy peptydu. 3. Odszczepienie ATZ-pochodnej Na etapie tym na próbkę dozowana jest porcja stęŜonego kwasu trifluorooctowego (TFA), będącego silnym i lotnym kwasem organicznym. Pod wpływem jego działania dochodzi do cyklizacji w obrębie PTC-pochodnej białka wraz z równoczesnym odszczepieniem utworzonej anilinotiazolinowej (ATZ) pochodnej. Dla prawidłowego zajścia tej reakcji szczególnie istotne jest bezwodne środowisko działania TFA. Po zakończeniu tego cyklu na filtrze pokrytym polibrenem będzie się znajdowała odszczepiona ATZ-pochodna N-końcowego aminokwasu oraz polipeptyd skrócony o ten właśnie aminokwas. 4. Transfer ATZ-pochodnej Odszczepiona ATZ-pochodna musi zostać fizycznie oddzielona od sekwencjonowanego białka i odbywa się to pod ponownym działaniem porcji octanu etylu oraz chlorobutanu. Rozpuszczalniki te podobnie jak poprzednio nie zmywają białka lecz tylko niskocząsteczkową ATZ-pochodną aminokwasu i przenoszą ją równocześnie do naczynia reakcyjnego. Po ukończeniu tego cyklu na filtrze pozostaje skrócony o jeden aminokwas polipeptyd zaś w naczyniu reakcyjnym znajduje się odszczepiona od niego reszta. 5. Konwersja do PTH-pochodnej ATZ-aminokwas jest związkiem stosunkowo nietrwałym i przed poddaniem go analizowaniu musi ulec konwersji do bardziej stabilnej pochodnej. Odbywa się to pod działaniem wodnego 25% roztworu TFA, który przekształca ATZ-aminokwas w pochodną fenylotiohydantoinową (PTH). Jest ona trwała i w dodatku moŜna ją oznaczać spektrofotometrycznie przy 264 nm. 6. Rozpuszczenie PTH-pochodnej i injekcja na kolumnę Utworzona PTH-pochodna jest rozpuszczana w 20% wodnym roztworze acetonitrylu i przenoszona do injektora, który wstrzykuje ją na kolumnę chromatograficzną. 7. Rozdział chromatograficzny PTH-pochodnej i analiza chromatogramu Rozdział chromatograficzny PTH-pochodnych aminokwasów odbywa się na zestawie HPLC wyposaŜonym w kolumnę z odwróconymi fazami. Większość sekwenatorów stosuje omówione w rozdziale 7 systemy mikro-LC, czyli takie, w których kolumna ma małą średnicę. Minimalizuje to konsumpcję solwentów, skraca czas rozdziału oraz zwiększa czułość oznaczeń. Przed kaŜdym sekwencjonowaniem układ automatycznie nakłada na kolumnę mieszaninę kalibracyjną wszystkich PTH-pochodnych aminkwasów i zapamiętuje ich wzorcowe czasy retencji, wykorzystując je później przy identyfikacji kolejno odszczepianych reszt. Po ukończeniu cyklu tych siedmiu procesów aparat wraca do stanu wyjściowego i zaczyna procedurę od początku, identyfikując następny aminokwas od N-końca. Niestety jak kaŜdy rzeczywisty proces chemiczny wszystkie kolejno przeprowadzane reakcje posiadają swoją określoną wydajność. Średnio wydajność odszczepiania pojedynczej reszty wynosi 95% i w praktyce wydajność ta jest podstawowym ograniczeniem rzutującym na moŜliwą do oznaczenia maksymalną liczbę reszt z jednego łańcucha polipeptydowego. Wydajność ta bowiem oznacza, Ŝe po pierwszym cyklu nastąpi odszczepienie następnej reszty od 95% pozostałego białka, w drugim cyklu od 95% z pozostałych 95% czyli w sumie od 90%, w trzecim od 95% z pozostałych 90% czyli od 85% itd. Poziom sekwencji będzie więc systematycznie spadał w miarę odszczepiania kolejnych reszt, ponadto białko traktowane podczas kolejnych reakcji miedzy innymi stęŜonym kwasem TFA będzie podlegało powolnej hydrolizie i poziom szumów na chromatogramach będzie się podnosił. W pewnym momencie poziom odszczepianych reszt zrówna się z poziomem aminokwasów pochodzących z niespecyficznej hydrolizy białka oraz z poziomem kumulujących się zanieczyszczeń chemicznych i identyfikacja uwolnionego aminokwasu stanie się niemoŜliwa. W praktyce więc udaje się uzyskać sekwencje liczące maksymalnie około 50 reszt i liczba ta podlega sporym wahaniom w zaleŜności od rodzaju białka, siły jego wiązania się z polibrenem, stopnia czystości, obecności modyfikowanych aminokwasów itp. Oczywiście peptydy krótsze od 50 aminokwasów zostaną zsekwencjonowane do końca. Natomiast oznaczenie całkowitej struktury pierwszorzędowej białka dłuŜszego wymaga jego fragmentacji (patrz rozdział 8), rozdzielenia powstałych peptydów i oddzielnego ich sekwencjonowania. 9.3. Budowa automatycznego sekwenatora białek Automatyczne sekwenatory białek produkowane były tylko przez cztery firmy oferujące aparaturę naukową: Applied Biosystems (ABI), Beckman, Knauer oraz Hewlett-Packard. Rozwiązania techniczne stosowane przez ABI okazały się najbardziej niezawodne i sekwenatory tej firmy praktycznie opanowały ponad 70% obecnego rynku. Budowa automatycznego sekwenatora białek zostanie zaprezentowana na przykładzie najbardziej popularnego modelu ABI 491A. Kluczowa cecha jego budowy oraz działania wynika z faktu, Ŝe wszystkie reakcje prowadzone podczas sekwencjonowania muszą się odbywać w atmosferze gazu obojętnego, czyli w tym przypadku argonu. Gaz ten pełni jednak nie tylko rolę ochronną lecz równieŜ słuŜy jako medium napędowe, pneumatycznie tłoczące chemikalia w odpowiednie miejsca aparatu i dodatkowo zapewnian teŜ odprowadzenie ich trujących i agresywnych chemicznie oparów. Aparat składa się z kilu podstawowych bloków funkcjonalnych (Rys. 9-1): ze szklanego cylindrycznego bloku pełniącego rolę obsady filtra z próbką, z reaktora chemicznego w kształcie zwęŜającej się ku dołowi probówki, z injektora i kolumny oraz z pomp HPLC wraz z detektorem. Dodatkowo sekwenator posiada port z hermetycznie przyłączonym do niego butelkami zawierającymi odczynniki chemiczne oraz kilka bloków zaworów otwierających dopływ tych odczynników do próbki lub reaktora. Butelki znajdują się pod nadciśnieniem spręŜonego argonu z butli i otwarcie odpowiedniego zaworu powoduje samoczynny wypływ odczynnika do poŜądanego miejsca. W przypadku odczynników dozowanych w postaci gazowej ich podawanie odbywa się w strumieniu argonu wdmuchującego pary odczynnika zgromadzone nad jego lotnym roztworem. Ze względu na agresywny chemicznie oraz trujący charakter chemikaliów całość jest hermetycznie zamknięta, wszystkie części wewnętrzne zbudowane są z teflonu lub stali kwasoodpornej i połączone są teflonowymi węŜykami. Nad działaniem urządzenia czuwa komputer, który w pełni steruje wszystkimi reakcjami oraz procesami. Działanie operatora sprowadza się do załadowania chemikaliów, nałoŜenia próbki oraz uruchomieniu programu sekwencjonowania. Szklany blok zawierający próbkę sekwencjonowanego białka zaabsorbowaną na filtrze pokrytym polibrenem Zawory wejściowe bloku próbki Zawory reaktora konwersji ATZ-PTH Reaktor w którym dochodzi do konwersji pochodnych z ATZ do PTH Detektor 264 nm Argon Injektor Zawory wyjściowe bloku próbki Kolumna Pompy HPLC Butelki z chemikaliami: A B C D E F G A – TFA + H2O B – 20% acetonitryl w H2O C – PITC D – N-metylopiperydyna E – octan etylu F – chlorobutan G - TFA Rysunek 9-1: Uproszczony schemat blokowy automatycznego sekwenatora białek. Teoretycznie wszystkie próbki powinny być sekwencjonowane w ten sam sposób lecz w rzeczywistości sytuacja nieco się komplikuje bowiem nieco inaczej naleŜy traktować próbkę białka, a inaczej peptydu, inny będzie program sekwencjonowania całkowicie w fazie ciekłej, a inny dla fazy gazowej, ponadto celem uniknięcia nagromadzenia się zanieczyszczeń naleŜy co jakiś czas uruchomić procedurę płukania wnętrza układu metanolem itd. Tak więc operator ma do wyboru kilka trybów pracy sekwenatora. Podstawowy tryb to sekwencjonowanie próbki zaabsorbowanej na filtrze pokrytym polibrenem i uŜywanie wyłącznie ciekłych odczynników. Tryb ten oferuje największą wydajność odszczepiania reszt, a tym samym umoŜliwia najdłuŜsze, efektywne sekwencjonowanie. Drugi tryb jest identyczny, lecz część reakcji jest przeprowadzana w fazie gazowej i konkretnie dotyczy to etapu dozowania kwasu TFA na próbkę. Sekwencjonowanie w fazie gazowej oferuje nieco niŜszą wydajność odszczepiania reszt w porównaniu od fazy ciekłej lecz w zamian daje wyŜszą czułość, zwłaszcza w odniesieniu do próbek nieco zanieczyszczonych. Trzeci tryb pracy sekwenatora wynika z komplikacji podczas sekwencjonowania białek bogatych w prolinę. Odszczepianie ATZ-pochodnych tego aminokwasu od wyjściowego łańcucha polipeptydowego jest bowiem procesem mało wydajnym i białka posiadające duŜo reszt proliny poddawane są specjalnym wydłuŜonym czasowo cyklom. Kolejne tryby pracy wynikają z faktu, Ŝe we współczesnych sekwenatorach coraz częściej białka sekwencjonowane są nie tylko z filtra szklanego pokrytego polibrenem lecz równieŜ z innych matryc, a konkretnie z membrany PVDF. Alternatywne sposoby immobilizacji białek i peptydów do sekwencjonowania omówiono obszerniej w następnym podrozdziale, tutaj naleŜy tylko wspomnieć, Ŝe sposób immobilizacji próbki jest właśnie kolejną przyczyną konieczności stosowania zmodyfikowanych trybów pracy sekwenatora. 9.3. Sposoby immobilizacji sekwencjonowanych próbek Podstawowym współczesnym sposobem immobilizacji sekwencjonowanych próbek białkowych i peptydowych jest unieruchomienie ich na filtrze z mikroporowatej włókniny szklanej pokrytej polibrenem (Rys. 9-2). Roztworem tego polikationowego polimeru zwilŜa się filtr, a następnie suszy w strumieniu argonu. Polibren tworzy wówczas na powierzchni włókien szklanych rodzaj filmu znakomicie absorbującego zarówno białka jak i peptydy. Próbka taka wiąŜe się z polibrenem niekowalencyjnymi wiązaniami o charakterze głównie jonowym. Rysunek 9-2: Struktura chemiczna polibrenu uŜywanego do immobilizacji białek i peptydów podczas sekwencjonowania. Drugim często uŜywanym sposobem immobilizacji jest unieruchamianie próbek poprzez ich hydrofobową absorbcję na membranach z PVDF (polifluorku winylidenu). Membrany te wprowadzono jako zamiennik nietrwałych membran nitrocelulozowych, PVDF jest bowiem tworzywem o odporności chemicznej porównywalnej z teflonem, a zarazem posiadającym duŜą wytrzymałość mechaniczną. Membrany PVDF stosuje się jako medium, na które przenoszone są białka podczas elektrotransferu z Ŝelu poliakrylamidowego. Membrana jest następnie wybarwiana i uwidoczniony prąŜek białka moŜna poddać sekwencjonowaniu umieszczając go w miejscu filtra szklanego. Przy barwieniu naleŜy stosować jedynie Coomassie Brillant Blue lub czerń amidową, barwniki te bowiem nie interferują z reakcjami sekwencjonowania. Elektroblotting jest jednak tylko jednym ze sposobów adsorbcji próbek na membranie PVDF. Jest co prawda bardzo uŜyteczny do wykonywania sekwencji złoŜonych mieszanin róŜnych białek, które kolejno moŜna wycinać z repliki Ŝelu i analizować lecz jest niezbyt sensowny w przypadku potrzeby immobilizacji pojedynczego białka lub peptydu. Do alternatywnych metod transferu takich próbek na membranę PVDF moŜna zaliczyć uŜycie miniaturowych urządzeń w formie probówek z osadzonym na dnie krąŜkiem takiej membrany. Próbkę roztworu białka lub peptydu dozuje się do takiej probówki i pod wpływem siły odśrodkowej powstającej podczas wirowania bądź teŜ pod wpływem uŜycia sorbentu przesącza się ten roztwór przez membranę. Membrana PVDF zaabsorbuje wówczas białko lub peptyd i poniewaŜ zarazem nie zatrzyma soli to uboczną zaletą tego rozwiązania jest moŜliwość równoczesnego odsolenia próbki. Ostatnim sposobem wykorzystania membran PVDF przy sekwencjonowaniu jest zastosowanie ich jako swoistego rodzaju kolektora frakcji uzyskanych po rozdziałach RP HPLC wykonywanych techniką mikro-LC. Technika ta polega na tym, Ŝe na mikrokolumnie z odwróconymi fazami rozdziela się mieszaninę peptydów znakowaną znacznikami fluorescencyjnymi zaś wypływający z niej eluat trafia na umieszczoną w specjalnym urządzeniu (ang. micro-blotter) przesuwającą się taśmę wykonaną z membrany PVDF i jest tam suszony. Otrzymuje się wówczas taśmę z widocznym pod lampą ultrafioletową ciągiem kropek pochodzących od znakowanych peptydów, które moŜna wyciąć i poddać sekwencjonowaniu. Technika ta jest bardzo czuła, unika się bowiem strat związanych za zbieraniem frakcji do probówek, ich liofilizowaniem, ponownym suszeniem itp. Membrany PVDF są bardzo wygodnym medium immobilizującym próbki podczas sekwencjonowania lecz niestety wiąŜą je nieco słabiej od polibrenu i w związku z tym sekwenconowanie z nich daje nieco gorsze rezultaty. Obecnie poszukuje się więc sposobów ich modyfikacji w kierunku zwiększenia zarówno siły wiązania jak i podwyŜszenia ilości białka lub peptydu absorbowanego na jednostce powierzchni. Przykładem takiej zoptymalizowanej membrany PVDF jest dostępna od niedawna membrana Immobilon PSQ firmy Millipore posiadająca zminimalizowaną średnicę porów oraz zwiększoną grubość. Stosunkowo rzadko stosuje się inne metody immobilizacji próbek do sekwencjonowania lecz warto je pokrótce wymienić. Alternatywą membran PVDF jest stosowanie do absorbcji próbek mikroporowatych błon teflonowych (np. Zitex firmy Millipore), membran z silikonowanej hydrofobowej włókniny szklanej (np. Glassybond firmy Biometra) lub teŜ membran z włókniny szklanej niekowalencyjnie pokrytej polikationowymi polimerami podobnymi do polibrenu (np. PGCM1 formy Life Science Products). Dla białek i peptydów trudno absorbujących się na tradycyjnych matrycach stosuje się membrany PVDF modyfikowane kowalencyjnie resztami aminoarylowymi lub difenyloizotiocyjanowymi (DITC). Do membran tych kowalencyjnie wiąŜe się białka lub peptydy poprzez ich grupy karboksylowe (w przypadku membran aminoarylowych) lub poprzez ich grupy aminowe (w przypadku membran DITC). Oczywiście ten drugi przypadek ma zastosowanie dla probek sekwencjonowanych od C-końca. Zupełnie odmienne rozwiązanie immobilizacji próbek stosowała w swych sekwenatorach firma Hewlett-Packard, która wprowadziła absorbcję białek i peptydów na miniaturowych kolumienkach z tworzywa sztucznego. Wypełnienie tej kolumienki składa się z dwóch części i dlatego teŜ nazwano je bimodalnymi. Górna warstwa składa się z wypełnienia z odwróconymi fazami typu C-18 zaś dolna z silnego jonowymieniacza anionitowego. Próbki absorbują się więc zarówno poprzez oddziaływanie hydrofobowe jak i jonowe. 9.4. Sekwencjonowanie białek lub peptydów z zablokowanym N-końcem Sekwencjonowanie białek lub peptydów za pomocą klasycznej tzw. chemii „edmanowskiej” jest oczywiście moŜliwe tylko w przypadkach, gdy badana próbka posiada wolną N-koncową grupę aminową. Jednak jak się okazuje nawet około 80% rozpuszczalnych cytozolowych białek eukariotycznych posiada jakiś typ chemicznej modyfikacji N-końca, który uniemoŜliwia reakcje z PITC. Najczęściej spotykanym typem modyfikacji jest acetylacja grup aminowych seryny, treoniny, alaniny oraz metioniny. Rzadziej obserwuje się natomiast utworzenie na N-końcu kwasu piroglutaminowego lub formylację metioniny, przy czym formylacja jest raczej blokadą specyficzną dla białek prokariotycznych (Rys. 9-3). Ponadto trzeba pamiętać, Ŝe czasami do zablokowania grup aminowych moŜna nieuwaŜnie doprowadzić in vitro, podczas samej preparatyki białka, uŜywając na przykład stęŜonych roztworów mocznika, kwasu mrówkowego czy teŜ prowadząc rozdziały elektroforetyczne w świeŜo spolimeryzowanych Ŝelach poliakrylamidowych. O R O O CH2CH2SCH3 O CH3 C N CH C N-acetylowany aminokwas (R - ugrupowanie boczne Ser, Thr, Ala, Met lub Gly) CH N C CH O C N H O Kwas piroglutaminowy N-formylo metionina Rysunek 9-3: Struktura chemiczna najczęściej spotykanych blokad N-końca białka. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe oprócz moŜliwie wysokiej wydajności najbardziej poŜądaną cechą metod odblokowywania białek i peptydów jest moŜliwość przeprowadzenia reakcji na immobilizowanej juŜ do sekwencjonowania próbce. Po prostu w razie stwierdzenia, Ŝe nie dochodzi do odszczepiania reszt aminokwasowych pomimo ewidentnej obecności białka, to immobilizowaną na filtrze z polibrenem lub membranie PVDF próbkę moŜna wyjąć z sekwenatora, poddać operacji odblokowywania i następnie ponownie nastawić sekwencjonowanie. Sposobem uzyskania sekwencji zablokowanego białka jest albo selektywne usunięcie blokady, albo teŜ fragmentacja białka i sekwencjonowanie uzyskanych fragmentów w celu otrzymania sekwencji wewnętrznych. W pierwszym przypadku zadanie jest o tyle trudne, Ŝe nigdy nie wiadomo, jaki konkretnie typ blokady znajduje się na N-końcu badanego białka zaś kaŜdy z typów wymaga innego sposobu działania, a dodatkowo reakcje odblokowywania mają zazwyczaj bardzo małą wydajność. Kolejność czynności mających na celu odblokowanie próbki musi być więc dobrze przemyślana, powinna zaczynać się od metod najprostszych i najszybszych i najsłabiej destrukcyjnych, a przede wszystkim powinna bazować na przewidywaniu jaki typ blokady jest najbardziej prawdopodobny. W przypadku białek prokariotycznych najlepiej zacząć od próby usunięcia często spotykanej formylacji metioniny, tym bardziej, Ŝe metoda deformylacji jest stosunkowo prosta i polega na inkubacji białka w pokojowej temperaturze w 0,6 M HCl przez 24 godziny. Niestety wydajność tego procesu jest niska, średnio by uzyskać sekwencję na poziomie około 30 pikomoli naleŜy uŜyć do odblokowania aŜ 1 nanomol białka. W przypadku, gdy zablokowane białko pochodzi z organizmu eukariotycznego naleŜy zastosować jako pierwsze techniki odblokowania najczęściej spotykanej N-acetylo-seryny oraz N-acetylo-treoniny. Generalnie uŜywa się do tego celu krótkiego działania silnych kwasów w podwyŜszonej temperaturze (kilkadziesiąt minut w temperaturze rzędu 60°C). Wadą tej metody jest moŜliwość częściowej hydrolizy łańcucha polipeptydowego próbki i dlatego teŜ ostatnio wprowadzono metodę ulepszoną, polegającą na poddaniu zablokowanego białka działaniu mieszaniny kwasu trifluorooctowego z metanolem przez kilka dni w temperaturze około 50°C. Wydajność tego ulepszonego procesu dochodzi nawet 50%. Trzeba zdawać sobie sprawę z faktu Ŝe obie powyŜej przedstawione metody powodują teŜ hydrolizę nietrwałego wiązania -Asp-Pro- co moŜe prowadzić do artefaktów (patrz rozdział 8). W przypadku, gdy próba deacetylacji nie powiedzie się kolejnym według prawdopodobieństwa typem blokady moŜe być kwas piroglutaminowy na N-końcu białka. W tym przypadku jedyną moŜliwa metodą jest zastosowanie aminopeptydazy piroglutaminianowej (np. z Pyrococcus furiosus), enzymu, który selektywnie odcina od N-końca łańcucha polipeptydowego kwas piroglutaminowy. W przypadku gdy i ten proces zakończy się niepowodzeniem ostatnią moŜliwością jest blokada w postaci acetylacji aminokwasów innych niŜ seryna czy treonina. PrzewaŜnie chodzi o alaninę, glicynę oraz metioninę, ale niestety deacetylacja tych aminokwasów jest stosunkowo trudna. Właściwie jedyna efektywna metoda polega na zastosowaniu enzymu AARE (ang. acetyl amino-acid releasing enzyme), o aktywności aminopeptydazy selektywnej wobec acetylowanych aminokwasów lecz enzym ten jest trudno dostępny komercyjnie. Zupełnie inną strategią uzyskania sekwencji z zablokowanego na grupie alfa-aminowej białka jest jego fragmentacja chemiczna lub enzymatyczna, przygotowanie mapy peptydowej oraz indywidulane sekwencjonowanie otrzymanych peptydów. Oczywiście pozwala to tylko na uzyskanie danych o kolejności reszt aminokwasowych wewnątrz cząsteczki białka, a Nkonicobna sekwencja nadal pozostanie nieznana. Jeśli jednak uŜyty do fragmentacji czynnik pozwala teŜ na odtrawienie niewielkiego peptydu od zablokowanego N-końca to poprzez zastosowanie spektrometrii masowej oraz oznaczenie składu aminokwasowego tego wyizolowanego peptydu moŜna przewidzieć nie tylko jego sekwencje ale i typ modyfikacji grupy alfa aminowej pierwszego aminokwasu. 9.5. Automatyczne sekwencjonowanie białek lub peptydów od C-końca W badaniach nad ekspresją białek oraz nad procesami ich potranslacyjnej obróbki często dochodzi do konieczności oznaczenia sekwencji C-końcowej badanej próbki. Szczególnie przydatne jest jednak określenie sekwencji na C-końcu w przypadku produkcji białek lub peptydów rekombinantowych, bowiem wynik pozwala określić czy uzyskano łańcuch polipeptydowy o właściwej długości i sekwencji. Niestety do chwili obecnej nie udało się opracować wydajnej i efektywnej procedury automatycznego sekwencjonowania od C-końca. Istniejące techniki pozwalają na oznaczenie najwyŜej kilku C-końcowych aminokwasów i dodatkowo mają pewne ograniczenia związane z niemoŜnością oznaczenia określonych reszt. W chwili obecnej istnieją dwa najlepiej opracowane oraz najskuteczniejsze protokoły chemiczne moŜliwe do realizacji w sekwenatorach automatycznych. Protokoły te w zasadniczej swej części są zbliŜone jakkolwiek bazując na innych odczynnikach dają często dość róŜne wyniki. Pierwszy z nich realizowany jest przez sekwenatory firmy Applied Biosystems i bazuje na reakcji C-końcowej grupy karboksylowej białka z tiocyjanianem tetrabutyloamonowym. W pierwszym etapie reakcji dochodzi do aktywacji ugrupowania karboksylowego za pomocą bezwodnika octowego, reakcji tego ugrupowania z tiocyjanianem tetrabutyloamonowym i do utworzenia najpierw karboksy-izotiocyjanianu peptydu, a następnie C-końcowej cyklicznej tiohydantoinowej pochodnej łańcucha polipeptydowego. W drugim etapie łańcuch ten poddawany jest alkilacji za pomocą bromometylonaftalenu, a utworzona aminokwasu wówczas zostaje C-końcowa odszczepiona metylonaftylotiohydantoinowa pod działaniem kolejnej (MNTH) porcji pochodna tiocyjanianu tetrabutyloamonowego. MNTH-pochodna jest następnie identyfikowana chromatograficznie, zaś pozostała część białka poddawana jest kolejnym cyklom odszczepiania. Czułość tej metody wynosi około 500 pikomoli, innymi słowy tyle potrzeba białka lub peptydu aby określić jego C-końcową sekwencję. Ograniczenia zaś są dość szerokie: maksymalnie udaje się otrzymać sekwencję około 12 aminokwasów, wystąpienie reszty proliny blokuje całkowicie sekwencjonowanie, a przy rozpoczynaniu sekwencjonowania kwas asparaginowy i glutaminowy częściowo ulegając cyklizacji obniŜa drastycznie wydajność odszczepiania reszt do poziomu około 5%. NiemoŜliwe jest ponadto określenie występowania wewnętrznych reszt histydyny (moŜna ją zidentyfikować tylko wtedy, gdy ta reszta znajduje się jako ostatnia na C-końcu), zaś oznaczenie tyrozyny, argininy, seryny oraz treoniny moŜe być skomplikowane ze względu na moŜliwość utworzenia się róŜnych produktów końcowych tych aminokwasów. Alternatywny protokół stosowany w sekwenatorach firmy Hewlett-Packard nie posiada tak szerokich ograniczeń i jest efektywny wobec wszystkich reszt aminokwasowych. Bazuje on na aktywacji grupy karboksylowej za pomocą kwasu trifluorooctowego i reakcji tego ugrupowania z difenylofosfoizotiocyjanianem (DPP-ITC). W obecności pirydyny dochodzi wówczas podobnie jak poprzednio do utworzenia najpierw karboksy-izotiocyjanianu peptydu a potem, równieŜ jak w poprzednim protokole do utworzenia C-końcowej tiohydantoinowej pochodnej łańcucha polipeptydowego. Pod działaniem trimetylokrzemianu potasu odszczepia się tiohydantoinowa pochodna reszty C-końcowej i zostaje ona oznaczona chromatograficznie zaś pozostały skrócony łańcuch polipeptydowy poddawany jest kolejnym cyklom. Sekwencjonowanie tą metodą jest czulsze niŜ w metodzie opisanej poprzednio, potrzeba bowiem tylko około 50 pikomoli próbki. Ograniczeniem tej metody jest to, Ŝe niestety nie moŜna stosować próbek przeniesionych na membranę PVDF, poniewaŜ membrana tego typu jest niestabilna w uŜywanych odczynnikach chemicznych.. Najczęściej jako alternatywę membrany PVDF stosuje się więc membrany teflonowe Zitex. Drugim powaŜnym ograniczeniem tej metody jest moŜliwośc określenia jedynie kolejności trzech pierwszych reszt aminokwasowych C-końca ze względu na drastyczny spadek wydajności kolejnych reszt.. 9.6. Ręczna identyfikacja aminokwasu N- lub C-końcowego Sekwencjonowanie białek i peptydów wymaga posiadania kosztownej aparatury lub teŜ skorzystania z usług komercyjnego laboratorium, które pobiera stosunkowo wysokie opłaty za samo rozpoczęcie sekwencjonowania. W przypadkach gdy potrzebna jest znajomość rodzaju tylko jednej reszty N- lub C-końcowej badanego białka lub peptydu ponoszenie wysokich kosztów jest mało uzasadnione poniewaŜ istnieje wiele stosunkowo prostych oraz czułych metod identyfikacji terminalnego aminokwasu. Oczywiście moŜliwa jest tzw. ręczna sekwencja według protokołów stosowanych w degradacji Edmana lub sekwencjonowania Ckońcowego, lecz ze względu na duŜą pracochłonność wykonywania tych reakcji w probówkach (konieczność zapewnienia atmosfery gazu obojętnego, trujące i agresywne odczynniki, kłopoty z ekstrakcja odszczepionych reszt) jest to praktycznie rzadko stosowane w laboratoriach. Najprostszą z zarazem bardzo czułą metodą identyfikacji aminokwasu N-końcowego jest metoda z wykorzystaniem omówionego w rozdziale 7.2 chlorku dansylu. Badany łańcuch polipeptydowy poddaje się działaniu roztworu tego odczynnika, który przyłącza się do Nkońcowej grupy aminowej. Następnie, białko poddaje się kwaśnej hydrolizie i powstałą fluorescencyjną pochodna identyfikuje na drodze chromatografii cienkowarstwowej lub teŜ RP-HPLC. Oczywiście podczas hydrolizy uwolnią się wszystkie aminokwasy lecz tylko reszta N-końcowa znakowana reszta będzie wykryta poprzez fluorescencję. Alternatywną metodą jest uŜycie aminopeptydazy, czyli enzymu kolejno odszczepiającego od łańcucha polipeptydowego aminokwasy począwszy od N-końca. Do próbki badanego białka czy peptydu dodaje się małą porcję takiego enzymu i co jakiś czas w okresie inkubacji pobiera się próbki mieszaniny reakcyjnej, które poddaje się reakcji z dowolnym odczynnikiem detekcyjnym stosowanym przy oznaczaniu aminokwasów (np. chlorek dansylu lub PITC) i potem identyfikuje metodami chromatograficznymi. Aminopeptydaza odszczepia co prawda kolejno wszystkie aminokwasy lecz N-końcowa reszta pojawi się chromatogramach kolejnych pobranych próbej jako pierwsza i to pozwoli na jej identyfikację. Analogiczne uŜycie karboksypeptydazy, czyli enzymu odcinającego kolejno aminokwasy od C-końca, jest najprostszym sposobem identyfikacji aminokwasu C-końcowego. Identyfikacja metodami chemicznymi tak odszczepionych reszt wymaga albo zastosowania technik radioizotopowych, albo teŜ jest dość skomplikowana chemicznie. Metoda najprostsza i historycznie najstarsza wymagająca stosowania radioizotopów i polega na stosunkowo prostej chemicznie wymianie wodoru przy węglu α-aminowym na radioaktywny tryt. Badane białko traktuje się bezwodnikiem octowym powodując cyklizację C-końcowego aminokwasu i następującej w procesie decyklizacji znakowane w obecności wody trytowej. Następnie wyznakowane białko jest standardowo hydrolizowane i radioaktywny aminokwas C-końcowy rozdzielany chromatograficznie na kolumnie jonowymiennej i identyfikowany poprzez pomiar radioaktywności trytu w cieczowym liczniku scyntylacyjnym. Metody nie stosujące radioizotopów są dość skomplikowane. Najczęściej stosowaną metodą jest modyfikacja reakcji stosowanej przy sekwencjonowaniu od C-końca. Białko lub peptyd kowalencyjnie sprzęga się za pomocą ich grup aminowych do ziaren szklanych modyfikowanych resztami karbonylodiimadazolowymi (CDI) lub difenyloizotiocynianowymi (DITC). Następnie grupy karboksylowe aktywuje się bezwodnikiem octowym i poddaje działaniu kwasu tiocyjanowego w celu utworzenia znanej juŜ nam tiohydantoinowej pochodnej na C-końcu. Pochodną tą odszczepia się pod działaniem roztworu wodorotlenku potasu i analizuje za pomocą chromatografii. DuŜą zaletą tej metody jest to, Ŝe operacje moŜna powtórzyć i oznaczyć kolejny aminokwas od C-końca, lecz niestety największym ograniczeniem jest nieskuteczność w identyfikacji Asp, Glu, Ser, Thr i Ser, co wynika z reaktywności ich bocznych ugrupowań w stosowanej chemii. Problem odzysku odtrawianych aminokwasów oraz wysoki stopień komplikacji metody jest charakterystyczny teŜ dla innych technik identyfikacji C-końcowego aminokwasu, takich jak hydrazynoliza, utworzenie i odszczepienie pochodnej aldehydowej czy teŜ alkoholiza pochodnej oksazolinowej. 9.6. Literatura 9.6.1. Literatura źródłowa 1. Protein sequencing protocols. Red.: B.J. Smith. Humana Press, Totowa 1997. 2. The protein protocols handbook. Red.: J.M. Walker. Humana Press, Totowa 1996. 3. Practical protein chemistry – A handbook. Red.: A. Darbre. Wiley & Sons, Chichester 1988.
