MATERIAŁ I METODY
advertisement
Mgr Anna Selera PRACA DOKTORSKA UZYSKANIE I CHARAKTERYSTYKA REKOMBINOWANEGO BIAŁKA Hsp60 SALMONELLA ENTERITIDIS Promotor Prof. dr hab. Alina Wieliczko Katedra Epizootiologii z Kliniką Ptaków i Zwierząt Egzotycznych Wydział Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 1 Szczególnie pragnę podziękować: Prof. dr hab. Alinie Wieliczko za wsparcie merytoryczne oraz nieodzowną pomoc, zwłaszcza w trakcie pisania pracy doktorskiej. Koleżankom i kolegom z Zakładu Chorób Ptaków oraz Katedry Immunologii za pomoc w realizacji doświadczeń. 2 Niniejsza rozprawa doktorska została zrealizowana w ramach grantu promotorskiego finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego (Nr N N308 600139). 3 SPIS TREŚCI Wykaz stosowanych skrótów 1. WSTĘP 10-20 1.1 Salmonellozy 10-17 1.1.1. Problem ekonomiczny 12 1.1.2. Problem epidemiologiczny 12-13 1.1.3. Zwalczanie salmonelloz u drobiu 13-17 1.2. Białko Hsp60 17-20 2. CEL PRACY 21 2.1. Cele szczegółowe 21 3. MATERIAŁ I METODY 22-32 3.1.Materiał 22 3.1.1. Szczep bakterii Salmonella enterica subs. enterica serovar Enteritidis 22 3.1.2. Ptaki 22 3.1.3. Linia komórkowa Con A – C1 – VICK 22 22-32 3.2. Metody 3.2.1. Produkcja rekombinowanego białka Hsp60 Salmonella Enteritidis 22-25 3.2.1.1.Izolacja genomowego DNA 22-23 3.2.1.2. Reakcja PCR 23 3.2.1.3. Analiza restrykcyjna uzyskanego DNA 24 3.2.1.4. Ligacja 24 3.2.1.5. Transformacja 24-25 3.2.1.6. Autoindukcja 25 3.2.1.7. Chromatografia powinowactwa 25 3.2.2. Ocena jakościowa oraz ilościowa uzyskanego białka 26-27 3.2.2.1. Elektroforeza białka 26-27 3.2.2.2. Western Blot 27 4 3.2.3. Doświadczenia na zwierzętach 27-32 3.2.3.1. Eksperyment 1. Optymalizacja dawki immunizacyjnej 27 3.2.3.2. Eksperyment 2. Immunizacja kurcząt wybraną dawką rekombinowanego białka Hsp60 S. Enteritidis oraz określenie immunogenności antygenu dla ptaków 28-31 3.2.3.2.1. Badanie serologiczne (test ELISA) 28-29 3.2.3.2.2. Badanie immunocytochemiczne (cytometria 29-30 przepływowa) 3.2.3.2.3. Test proliferacji komórkowej (MTT) z użyciem linii 30-31 komórkowej Con A – C1 – VICK 3.2.3.3. Eksperyment 3. Określenie protekcyjnej roli 31-32 białka Hsp60 S. Enteritidis 3.2.3.3.1. Eksperymentalne zakażenie kurcząt zjadliwym szczepem 31 Salmonella Enteritidis 3.2.3.3.2. Badania mikrobiologiczne -32 3.2.3.3.3. Badania serologiczne – typizacja wyizolowanych bakterii 32 4. WYNIKI 33-63 4.1. Produkcja rekombinowanego białka Hsp60 Salmonella Enteritidis 33 4.2. Ocena jakościowa oraz ilościowa uzyskanego białka 34 4.3. Określenie wpływu zastosowanego antygenu na komórki układu immunologicznego kurcząt 34-61 4.3.1. Wyniki optymalizacji dawki immunizacyjnej 34-44 4.3.2. Wyniki testu immunoenzymatycznego (cytometria przepływowa) 45-55 4.3.3. Wyniki testu transformacji blastycznej (MTT) 56-62 4.4. Protekcyjna rola białka Hsp60 Salmonella Enteritidis 62-63 4.4.1. Wyniki zakażenia eksperymentalnego kurcząt szczepem Salmonella 62-63 Enteritidis 64-72 5. DYSKUSJA 5 6. WNIOSKI 73 7. STRESZCZENIE 74-76 8. PIŚMIENNICTWO 77-83 9. CYTOWANE W PRACY ROZPORZĄDZENIA ORAZ DYREKTYWY 84-85 6 WYKAZ ZASTOSOWANYCH SKRÓTÓW: AA/AB – akrylamid N,N-metyleno-bisakrylamid Amp - ampicylina APS – nadsiarczan amonu ATP – adenozynotrójfosforan Bu-1 – limfocyty B BWP – zbuforowana woda peptonowa CC – chemokiny CC CD3 – antygen zróżnicowania komórkowego dla limfocytów T CD4 - antygen zróżnicowania komórkowego dla limfocytów T CD8 - antygen zróżnicowania komórkowego dla limfocytów T CFA – kompletny adjuwant Freunda cfu – jednostka tworząca kolonię cm2 – jednostka powierzchni (centymetr kwadratowy) CO2 – dwutlenek węgla ConA – konkanawalina A C41 – komórki kompetentne DE3 – szczep bakterii Escherichia coli DNA – kwas dezoksyrybonukleinowy d. p. i. – dzień po immunizacji d. p. z. – dzień po zakażeniu ELISA – test immunoenzymatyczny EU/ml – jednostka endotoksyn ERK 1/2 – kinaza regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym EtBr – bromek etydyny FCS – płodowa surowica cielęca EFSA – European Food Safety Authority for – primer forward g – prędkość obrotowa GALT – tkanka limfatyczna układu pokarmowego H2S - siarkowodór H2SO4 – kwas siarkowy HisTag – łańcuch białkowy zbudowany z histydyny hrHsp60 – ludzkie rekombinowane białka szoku cieplnego o masie 60 kDa HRP – peroksydaza chrzanowa hHsp60 – ludzkie białko szoku cieplnego o masie 60kDa Hsp10 – białko szoku cieplnego o masie 10kDa 7 HSP60 – rodzina białek szoku cieplnego o masie 60kDa Hsp60 – białko szoku cieplnego o masie 60kDa HSP70 – rodzina białek szoku cieplnego o masie 70kDa Hsp70 – białko szoku cieplnego o masie 70kDa HSP90 – rodzina białek szoku cieplnego o masie 90kDa Hsp90 – białko szoku cieplnego o masie 90kDa hsp60pET22b+ - konstrukt białka szoku cieplnego z wektorem pET22b+ IgG – immunoglobulina G IL-2 – interleukina 2 IL-6 – interleukina 6 IL-12 – interleukina 12 IL-15 – interleukina 15 JNK1/2 – c-Jun N-terminalna kinaza LB – bulion odżywczy LPS – lipopolisacharyd M – mol mA – miliamper MIP2 – białko zapalne makrofagów 2 mitC – mitomycyna C mitHSP60 – rodzina mitochondrialnych białek szoku cieplnego o masie 60kDa mg – miligram ml – mililitr mM –milimol MRSV – podłoże selektywno namnażające MTT – test proliferacji blastycznej µg – mikrogram µl – mikrolitr NaCl – chlorek sodu NcoI – enzym restrykcyjny tworzący miejsce restrykcyjne (CCATGG) ng - nanogram NiNTA – złoże agarozy z niklem, umożliwia wiązanie się białek bogatych w reszty histydynowe NIZP- PZH - Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny nm - nanometr OD600 – gęstość optyczna mierzona przy długości fali 600nm OMP – białka błony zewnętrznej p38 – białko p38 8 PABA – kwas para-aminobenzoesowy PBS – sól fizjologiczna buforowana fosforanami PCR – reakcja amplifikacji DNA pET22b+ - wektor pH – ilościowa skala oceniająca zasadowość bądź kwasowość roztworów wodnych ppm - pipimol PT4 – typ fagowy 4 pz. – para zasad RANTES – chemokina β syntetyzowana przez limfocyty T rew – primer rewers RPMI-1640 – medium do hodowli komórkowych SDS-PAGE - elektroforeza w żelu poliakrylamidowym sHSP – rodzina białek szoku cieplnego o małej masie cząsteczkowej T4 – ligaza bakteriofaga T4 T7 – promotor genu polimerazy RNA faga T7 TAE – bufor Tris-HCl TCRαβ – receptor limfocytów T TCRγδ – receptor limfocytów T TEMED – N,N,N’,N’-tetrametylenodiamina Th1 – limfocyty pomocnicze TLR2 – receptor toll-like 2, rozpoznający lipopolisacharyd bakterii Gram-ujemnych TLR4 – receptor błonowy rozpoznający lipopolisacharydy bakterii Gram-ujemnych TMB - 3,3′,5,5′-czterometylobenzydyna TNFα – czynnik martwicy nowotworów Tween 20 – polyethylene glycol sorbitan monolaurate V – volt XhoI – enzym restrykcyjny z miejscami cięcia C'TCGA'G; XLD – podłoże selektywnie różnicujące 9 1. WSTĘP 1.1. Salmonellozy Salmonella spp. jest istotnym czynnikiem chorobotwórczym zarówno dla ludzi jak i zwierząt. Salmonellozy są wywoływane przez Gram-ujemne pałeczki Salmonella należące do rodziny Enterobacteriaceae, nietworzące zarodników. Metabolizm glukozy przebiega z wytworzeniem gazu (H2S), często posiadają zdolność do ruchu (obecność rzęsek). Za odkrywcę pałeczek Salmonella uznaje się amerykańskiego lekarza weterynarii Daniela E. Salmona, to on jako pierwszy w 1885 roku stwierdził ich obecność w jelitach świń. Wraz z rozwojem nauki systematyka pałeczek Salmonella ulega zmianie. Współczesna klasyfikacja bakterii została stworzona w oparciu o analizę takich cech jak: morfologia, fizjologia, biochemia, jak i genetyka. Obecnie wyróżnia się dwa gatunki: Salmonella enterica i Salmonella bongori. Pierwszy z nich został podzielony na sześć podgatunków (S. enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. indica), natomiast w drugim gatunku można wyróżnić 20 rzadko spotykanych serowarów. Większość pałeczek z Salmonella to pałeczki orzęsione (Popoff i Le Minor, 1985; Popoff, 2001). Dla ptaków patogennych jest wiele serowarów pałeczek Salmonella, przy czym, z krajowych rejestrów salmonelloz wynika, że od kur i kurcząt rzeźnych najczęściej izolowana jest S. Enteritidis, od indyków S. Saint-Paul i S. Enteritidis, zaś od drobiu wodnego (kaczki, gęsi) S. Typhimurium. Ze względu na predylekcję oraz inwazyjność poszczególnych serowarów Salmonella, można wyróżnić pałeczki Salmonella typowo patogenne i inwazyjne dla drobiu (Salmonella enterica subsp. enterica serowar Gallinarum z dwoma biowarami S. Gallinarum i S. Pullorum), wywołujacych pullorozę kurcząt i tyfus kur. Drugą grupę stanowią serowary niespecyficzne dla ptaków, lecz inwazyjne, takie jak np.: S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Infantis, S. Montevideo, S. Hadar. Wywołują one choroby ptaków i innych gatunków zwierząt (salmonellozy) oraz są czynnikiem etiologicznym zakażeń i zatruć pokarmowych wśród ludzi. Najczęściej izolowaną pałeczką Salmonella od ludzi jest Salmonella Enteritidis. To ona jest odpowiedzialna za większość zatruć pokarmowych po spożyciu produktów, które wcześniej zostały zasiedlone przez bakterie. Zatrucia pokarmowe u ludzi manifestują się biegunkami, podwyższoną temperaturą ciała, bólami brzucha oraz odwodnieniem. Bakterie, po 10 przedostaniu się do organizmu wraz z zakażonym pokarmem, w jelicie cienkim ulegają adhezji do komórek tkanki limfoidalnej związanej z układem pokarmowym (GALT): enterocytów kosmków jelitowych i komórek M występujących w nabłonku pokrywającym kępki Peyera. Do adhezji dochodzi dzięki obecności na powierzchni bakterii fimbrii, które zakotwiczają ją w nabłonku ułatwiając namnażanie i kolonizację. W wyniku adhezji bakterie przenikają do wnętrza tych komórek, proces ten odbywa się na drodze fagocytozy lub makropinocytozy. Moment przejścia antygenu bakteryjnego przez komórki M jest zasadniczym etapem w indukcji odpowiedzi immunologicznej lub tolerancji organizmu. To komórki M przekazują dalej antygen do komórek dendrytycznych, makrofagów lub neutrofili, co rozpoczyna proces prezentacji antygenu (Jensen i Harty, 1998; Grűtzkau i wsp., 1990). Głównym rezerwuarem pałeczek Salmonella są zwierzęta gospodarskie, dzikie oraz gryzonie. Wśród nich grupą najbardziej narażoną na zachorowalność są osobniki młode, dorosłe natomiast rzadko chorują, zazwyczaj choroba przebiega bezobjawowo i stają się one nosicielami. Bezobjawowe nosicielstwo jest głównym zagrożeniem dla ludzi i środowiska. Zachorowalność jak i obraz zmian klinicznych i sekcyjnych zależy między innymi od dawki zakaźnej (cfu), zjadliwości bakterii, drogi zakażenia, wieku ptaków i ich stanu zdrowia oraz od warunków środowiskowych. Na ogół choroba ma przebieg bezobjawowy jednak u młodych ptaków, u których doszło do zakażenia transowarialnego, może wystąpić postać ostra choroby, posocznica oraz zwiększona śmiertelność. Często obserwuje się biegunki, osłabienie oraz zaburzenia na tle nerwowym. W przypadku niosek zakażenie z przewodu pokarmowego może rozprzestrzenić się na narządy wewnętrzne, ze szczególnym uwzględnieniem narządów rozrodczych (zapalenie jajnika, jajowodu oraz otrzewnej). S. Enteritidis posiada większe powinowactwo do jajowodu niż do jajnika stąd częściej obserwuje się zakażenie w obrębie białka i zewnętrznej błony żółtkowej. Salmonella kontaminuje jaja jeszcze przed utworzeniem skorupy w jajowodzie, co sprzyja pionowej transmisji patogenu i zakażeniu piskląt. Taka sytuacja prowadzi do zakażenia stad towarowych i jaj konsumpcyjnych, spadku nieśności i obniżenia wskaźników wylęgowych w stadach reprodukcyjnych. Dodatkowy problem stanowi okresowe składanie zakażonych jaj przez nioski, co utrudnia wykrycie stad zakażonych. 11 Salmonellozy stanowią istotny problem zarówno pod względem ekonomicznym jak i epidemiologicznym. 1.1.1. Problem ekonomiczny Powszechność zakażeń pokarmowych u ludzi na tle S. Enteritidis zwraca szczególną uwagę na ten patogen. Jest on głównym czynnikiem etiologicznym zatruć i zakażeń u ludzi. W Unii Europejskiej notuje się corocznie około 100,000 przypadków salmonellozy, a straty ekonomiczne z tym związane, wg raportu EFSA za rok 2009, szacuje się na 3 biliony Euro rocznie (www.efsa.europa.eu/en/topics/topic/salmonella.html). 1.1.2. Problem epidemiologiczny W Polsce zakażenia pokarmowe u ludzi na tle pałeczek Salmonella są bardzo powszechne i sięgają ok. 70% wszystkich zakażeń pokarmowych, w tym większość z nich jest powodowana przez S. Enteritidis, choć często dochodzi do zakażeń na tle S. Typhimurium. Podobnie sytuacja kształtuje się na świecie. Głównym źródłem zakażenia jest mięso drobiowe, jaja i ich przetwory (S. Enteritidis) oraz mięso wieprzowe, drobiowe, wołowe i produkty mleczne (S. Typhimurium). Z danych przedstawionych w corocznym raporcie EFSA wynika, że w 2009 roku odnotowano łącznie 111 209 potwierdzonych przypadków salmonellozy u ludzi, w tym 108 614 w 27 krajach UE (wg raportów EFSA za lata 2004 – 2009), natomiast w 2004 roku zanotowano 194 270 przypadków. Tendencję spadkową przedstawia tab. 1. Tab. 1. Występowanie salmonelloz u ludzi w krajach Unii Europejskiej w latach 2004 – 2009 wg raportu EFSA Liczba potwierdzonych przypadków w latach (w Polsce) Zoonoza Salmonelloza 2009 2008 2007 2006 2005 2004 111 209 133 258 151 955 172 670 176 963 194 270 (8521) (9609) (11 155) (13 362) (16 006) (15 958) Z analiz zakażeń ludzi na tle pałeczek Salmonella, przeprowadzonych przez Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu Higieny wraz z 12 wojewódzkimi stacjami sanitarno – epidemiologicznymi, powstał w 2010 roku roczny biuletyn przedstawiający sytuację epidemiologiczną salmonelloz w Polsce. Najczęstszym czynnikiem etiologicznym była S. Enteritidis. Należy jednak podkreślić tendencję spadkową w stosunku do roku 2008 (odnotowano o 644 przypadków mniej). W 2009 roku w ramach nadzoru nad chorobami przenoszonymi drogą pokarmową ogłoszono 162 ogniska wywołane przez pałeczki Salmonella. Aż w 150 z nich (ponad 92%) czynnikiem etiologicznym była S. Enteritidis, tylko w 4 przypadkach S. Typhimurium, w pozostałych 7 ogniskach nie udało się określić przynależności do grupy serologicznej (Sadkowska-Todys i Czarkowski, 2011). 1.1.3. Zwalczanie salmonelloz u drobiu W ramach ograniczenia zapadalności ptaków na salmonellozy powszechne stały się szczepienia ochronne oraz monitoring mikrobiologiczny stad oraz mięsa i jaj. W celu ujednolicenia wytycznych, mających za zadanie ograniczenie występowania pałeczek Salmonella w produkcji drobiarskiej, wprowadzono ściśle określone przepisy. Najważniejszy z nich stanowi Dyrektywa 2003/99/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 17 listopada 2003 r. w sprawie monitorowania chorób odzwierzęcych i odzwierzęcych czynników chorobotwórczych. Kolejne to Rozporządzenie (WE) nr 2160/2003 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 17 listopada 2003 r. w sprawie zwalczania salmonelli i innych określonych odzwierzęcych czynników chorobotwórczych przenoszonych przez żywność. Cel wspólnotowy w odniesieniu do gatunku Gallus gallus został określony w Rozporządzeniu Komisji nr 1003/2005 z dnia 30 czerwca 2005 r. W ślad za tymi przepisami, utworzono w kraju programy monitoringowe stad hodowlanych kur („Krajowy program zwalczania niektórych serotypów Salmonelli w stadach hodowlanych gatunku kura (Gallus gallus)” na lata 2007 – 2009; Rozporządzenie Rady Ministrów z dnia 28 marca 2007 r.). W stadach tych monitorowane są następujące serotypy Salmonella: S. Enteritidis, S. Hadar, S. Infantis, S. Typhimurium oraz S. Virchow. Kolejne rozporządzenie Komisji (WE) nr 1168/2006 z dnia 31 lipca 2006 r. w sprawie wykonania rozporządzenia (WE) nr 2160/2003 oraz zmieniającego rozporządzenie (WE) nr 1003/2005, reguluje monitorowanie stad niosek gatunku Gallus gallus w kierunki serotypów S. Enteritidis oraz S. Typhimurium. Krajowym programem zwalczania Salmonelli jest 13 Rozporządzenie Rady Ministra z dnia 12 maja 2009 r. w sprawie „Krajowego programu zwalczania niektórych serotypów Salmonelli w stadach niosek gatunku kura (Gallus gallus) na 2009 r.” W stadach tych monitorowane są serotypy S. Enteritidis oraz S. Typhimurium. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 646/2007 z dnia 12 czerwca 2007 r. oraz Rozporządzenie Rady Ministrów z dnia 12 maja 2009 r. w sprawie wprowadzenia „Krajowego programu zwalczania niektórych serotypów Salmonelli w stadach brojlerów gatunku (Gallus gallus) na 2009 reguluje monitoring stad brojlerów gatunku kura (Gallus gallus). W stadach tych monitorowane są serotypy S. Enteritidis oraz S. Typhimurium. Wszystkie programy monitoringowe, dotyczące gatunku kura (Gallus gallus) zostały przedłużone – są kontynuowane do chwili obecnej (luty 2012 r.). W zakresie monitorowania stad indyków obowiązuje Rozporządzenie Komisji (WE) nr 584/2008 z dnia 20 czerwca 2008 r. Zarówno w stadach reprodukcyjnych indyków jak też indyków rzeźnych monitorowane są serotypy S. Enteritidis i S. Typhimurium. Należy podkreślić, że zadaniem tych programów zwalczania chorób odzwierzęcych i odzwierzęcego czynnika chorobotwórczego jest osiągnięcie odpowiedniego celu, uwzględniającego ograniczenie rozprzestrzeniania chorób odzwierzęcych i odzwierzęcych czynników chorobotwórczych. Stanowi to najważniejszy cel, bowiem, uwzględniając zdrowie publiczne, zgodnie z rozp. Nr 2160/2003 Parlamentu Europejskiego z Rady z dnia 17 list. 2003 r Świeże mięso drobiowe pozyskane z drobiu (kury, indyki) nie może być wprowadzone do obrotu w celu spożycia przez ludzi, jeżeli nie zostanie spełnione kryterium „brak pałeczek Salmonella w 25 g”. Ponadto, „jaja nie mogą być przeznaczone do bezpośredniego spożycia przez ludzi jako jaja konsumpcyjne, jeżeli pochodzą ze stada kur niosek nie objętego krajowym programem zwalczania, ze stada o nieznanym statusie, do którego istnieje podejrzenie lub potwierdzono zakażenie S. Enteritidis lub S. Typhimurium.” Reasumując, powszechnie stosowane badania monitoringowe polegają na badaniu mikrobiologicznych prób pobranych ze środowiska ptaków (poprzez badanie kału, wymazów kałowych/prób podeszwowych pobranych z kurnika), badania paszy oraz ostatnio wprowadzone badania mięsa drobiowego (próby pobierane w uboju ptaków). Badania mikrobiologiczne w laboratorium wykonywane są zgodnie z normą PN-EN ISO 6579:2003+A1:2007 „Wykrywanie pałeczek 14 Salmonella w kale i próbkach środowiskowych”. Natomiast w celu wykrywania Salmonella w żywności i paszach, stosuje się normę PN-EN ISO 6579:2003 „Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda wykrywania pałeczek Salmonella spp.”. Kolejnym krokiem, który ma na celu zapobieganie rozszerzaniu się S. Enteritidis jest bioasekuracja. Jest to działanie mające na celu uniemożliwienie przedostania się na fermę dzikim zwierzętom (w tym gryzonie, ptaki dzikie), które mogą być wektorami S. Enteritidis. Do działań bioasekuracyjnych należy również zaliczyć dezynfekcję pomieszczeń, w których przebywają zwierzęta oraz kontrolę jakości paszy i wody. Profilaktyczne stosowanie „preparatów zasiedlających” przewód pokarmowy przeciwko salmonellozie, oparte jest na ustabilizowaniu mikroflory jelitowej u młodych ptaków poprzez dostarczenie kultur saprofitycznych bakterii. Po dostaniu się do przewodu pokarmowego piskląt, bakterie te tworzą na powierzchni błony śluzowej barierę uniemożliwiającą jej kolonizację poprzez enteropatogenne drobnoustroje (Grela i Semeniuk, 1999). Mechanizm „kompetycyjnego wykluczenia” tłumaczy się nie tylko blokowaniem możliwych miejsc do kolonizacji w śluzówce jelit. Mikroflora ta skutecznie konkuruje z enteropatogennymi bakteriami w wykorzystaniu puli substancji pokarmowych w jelitach, a także produkuje czynniki przeciwbakteryjne, takie jak: bakteriocyny i lotne kwasy tłuszczowe (Schneitz i wsp., 1992). Wydaje się, że stosowanie szczepień ochronnych jako dodatkowego elementu walki z salmonellozami, może przyczynić się w znacznym stopniu do redukcji zakażeń drobiu pałeczkami Salmonella. Może również ograniczyć lub całkowicie wyeliminować, w niedalekiej przyszłości, chemioterapeutyki. Narastająca w bardzo szybkim tempie oporność drobnoustrojów, w tym i pałeczek Salmonella, na stosowane chemioterapeutyki oraz zagrożenie pozostałościami leków w tkankach (mięso, jaja) a także w środowisku, wskazują na szczepienia ochronne drobiu jako efektywny czynnik kontroli zakażeń (Błaszczak i wsp., 1996; Threlfall i wsp., 1998; Turczyński i Hoszowski, 1991). W praktyce drobiarskiej stosowane są zarówno szczepionki żywe (atenuowane), jak też inaktywowane. Immunizacja niepatogennymi, atenuowanymi szczepami Salmonella stymuluje humoralną i komórkową odpowiedź immunologiczną, dając 15 długotrwałą ochronę. Ponadto po podaniu szczepionki per os, dochodzi do wzrostu miejscowej odporności błon śluzowych przewodu pokarmowego (GALT), co wydaje się istotne w aspekcie ochrony przed zasiedlaniem jelit przez pałeczki Salmonella (Cooper i wsp., 1994). Szczepionki inaktywowane to biopreparaty, w których inaktywację mikroorganizmu osiąga się na drodze chemicznej lub fizycznej. Inaktywację szczepu można uzyskać poprzez poddanie zawiesiny bakterii działaniu formaliny, acetonu, aldehydu glutarowego lub wysokiej temperatury. Najwięcej badań przeprowadzono na szczepionce inaktywowanej opartej na szczepie S. Enteritidis (PT4) z adiuwantem olejowym (Gast i Beard, 1990; Gast i wsp. 1992; Timms i wsp., 1994; Voss i Vielitz, 1996). Immunizacja inaktywowaną szczepionką opartą o pełną komórkę bakteryjną lub tylko antygenami bakteryjnymi, np. OMP prowadzi do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego, jednak słabszej niż ma to miejsce po podaniu szczepionki żywej. Związane jest to z możliwością zmian w strukturze antygenów w czasie przygotowywania szczepionek lub z faktem, że żywe komórki bakteryjne ze względu na ich podziały, prezentują antygen układowi immunologicznemu w przedłużony sposób. Błona zewnętrzna tych bakterii składa się z LPSu, białek i fosfolipidów. Białka błony zewnętrznej są silnie immunogenne i zdolne do wytwarzania specyficznych przeciwciał oraz stymulacji limfocytów T. Natomiast LPS, jako składnik OMP, uważany jest za mało efektywny w stymulacji odpowiedzi immunologicznej w porównaniu z innymi inaktywowanymi szczepionkami, choć indukuje powstanie specyficznych przeciwciał. Inaktywowane szczepionki muszą być podane co najmniej 2-krotnie w formie iniekcji domięśniowej lub podskórnej, co w przypadku produkcji drobiu jest zabiegiem pracochłonnym. Stosowanie tych szczepionek jest jednak bezpieczne, ponieważ brak jest siewstwa do środowiska szczepu szczepionkowego i możliwości jego rewersji do formy „dzikiej” (Barrow i wsp., 1990; Jagusztyn–Krynicka, 1995). Inną grupę szczepionek przeciwko salmonellozie u drobiu stanowią szczepionki oparte o szczepy z mutacją genu aroA. Gen aroA jest odpowiedzialny za syntezę jednego z kluczowych enzymów procesu biosyntezy związków aromatycznych u bakterii. U pałeczek Salmonella jest to jedyna droga do biosyntezy kilku ważnych metabolitów, np. PABA. Ponieważ związki te są niezbędne dla wzrostu bakterii, dlatego mutanty aroA są niezdolne do namnażania w tkankach kręgowców i tym tłumaczy się ich brak patogenności (Griffin, 1991). 16 Kolejnymi szczepionkami żywymi, nad którymi prowadzono badania są biopreparaty oparte o szczepy, które pozbawiono „plazmidu zjadliwości”. Plazmidowe DNA zawiera geny (aro) warunkujące zjadliwość pałeczek Salmonella. Niestety szczepionki oparte o szczepy pozbawione plazmidu, podane per os, słabiej indukują odpowiedź immunologiczną – prawdopodobnie ze względu na pozbawienie wraz z plazmidem zdolności migracji bakterii ze światła jelita do enterocytów (Barrow i wsp., 1990). Nowe techniki biologii molekularnej dały możliwości opracowania szczepionek podjednostkowych, zawierających w swoim składzie swoiste immunogenne białka produkowane w oparciu o techniki rekombinacji DNA. Nie zawierają one balastu antygenów niepotrzebnych do indukcji odporności, a mogących wywołać objawy toksyczne, alergię lub wstrząs anafilaktyczny. Szczepionki podjednostkowe stosuje się u ludzi w przypadku wirusowego zapalenia wątroby typu B oraz stwardnienia rozsianego (Stuve i wsp. 2007). Najnowsze szczepionki są tworzone z myślą o zapewnieniu najlepszej protekcji, przy jednoczesnym ograniczeniu ryzyka wystąpienia skutków ubocznych podczas ich stosowania. Zaprojektowanie oraz uzyskanie takiego preparatu było jednym z celów niniejszej pracy doktorskiej. Na podstawie wcześniej przeprowadzonych doświadczeń, uznano, że białko szoku cieplnego o masie 60kDa wykazuje wysoką immunogenność. 1.2. Białko Hsp60 Białka szoku cieplnego (Heat Shock Proteins, HSPs) są silnie konserwatywne pod względem filogenetycznym, występują zarówno u procaryota jak i eucaryota (Fink, 1999; Hartl i Hayer-Hartl, 2002). Białka z rodziny HSP60 są produkowane przez różnorodne mikroorganizmy wliczając bakterie Gram-ujemne, Gram-dodatnie, drożdżaki i archaebakterie. Produkowanie przez nie białka Hsp60 postrzegane są jako potencjalny czynnik immunogenny podczas infekcji, białka umożliwiające przetrwanie bakterii w organizmie gospodarza oraz czynniki patogeniczne i indukujące choroby autoimmunologiczne (Benkirane i wsp., 1997). Na szczególną uwagę zasługuje fakt konserwatywności białek szoku cieplnego, a w dużej mierze homologia w sekwencji aminokwasowej pomiędzy poszczególnymi organizmami, np. białka z rodziny HSP pochodzenia bakteryjnego wykazują ponad 97% homologii w sekwencji aminokwasowej, a w przypadku HSP60 17 procariotycznego i ludzkiego (hHSP60) zgodność ta przekracza 70% (Zugel i wsp., 1999a). Okazuje się, że białka szoku cieplnego pochodzenia bakteryjnego, głównie Hsp60 i Hsp70, są silnie immunogenne, indukują produkcję przeciwciał oraz aktywację limfocytów T (Zugel i Kaufmann, 1999b). Przeciwciała i limfocyty T skierowane przeciwko bakteryjnym Hsp60 i Hsp70 rozpoznają dodatkowo Hsp60 i Hsp70 ssaków na zasadzie reakcji krzyżowych (Kissling i wsp., 1991). Powstałe przeciwciała anty-Hsp60 i anty-Hsp70 oraz aktywowane limfocyty T mogą prowadzić do uszkodzenia tkanek i do ujawnienia się reakcji zapalnych. Hsp60 mogą dodatkowo przyczynić się do pojawienia się stanów patologicznych (choroby zapalne takie jak cukrzyca typu 1, choroba Crohna, arterioskleroza) (Perschinka i wsp., 2003). Okazuje się, że białka HSP60 mogą występować nie tylko w mitochondrium lub cytozolu, ale w przypadku komórek eukariotycznych poddanych działaniu warunków stresowych białko pojawia się również na powierzchni komórek (Xu i wsp., 1994; Soltys i Gupta 1997). Te informację stały się inspiracją do badań nad właściwościami immunogennymi białka Hsp60, a powszechny problem salmonelloz u drobiu i ludzi wpłynął istotnie na temat prowadzonych przeze mnie badań. Klasyfikacja białek HSP została oparta o pełnione przez nie funkcje oraz ich masę cząsteczkową. Nazwy rodzin białek szoku cieplnego pisane są dużymi literami, np. HSP60, podczas gdy proteiny należące do poszczególnych rodzin w sposób konwencjonalny, np. Hsp60. Nomenklatura taka została przyjęta podczas Cold Spring Harbor Meeting w 1996 roku (Hightower i Hendershot, 1997). Ze względu na masę cząsteczkową dzielimy je na 4 główne rodziny: HSP60, 70, 90 oraz niskocząsteczkowe sHSP. Białka szoku cieplnego wytwarzane są w komórce w sposób konstytutywny (stały), bądź w wyniku indukcji warunkami stresowymi (Pivovarova i wsp., 2005; Garrido i wsp., 2001) takimi jak: stres termiczny, oksydacyjny, zatrucie metalami ciężkimi czy też alkoholem. W komórkach ssaków, białka z rodziny HSP60 zastały zlokalizowane w mitochondrium (mt-HSP60) oraz w cytoplazmie (Fink, 1999; Hartl, 2002). MtHSP60 występuje w mitochondrium w dynamicznej równowadze przyjmując formę monomeryczną, heptameryczną oraz tetradekameryczną (Fink, 1999). Postać cytozolowa HSP60 to heterooligomeryczna struktura pierścieniowa, której zadaniem jest prawidłowe fałdowanie białek cytoszkieletu, np. aktyny czy tubuliny (Llorca i wsp., 2000). 18 Białka szoku cieplnego to molekularne chaperony, czyli cząsteczki opiekuńcze. Ich zasadnicza funkcja polega na rozpoznawaniu oraz wiązaniu się tych białek do nowo syntetyzowanych polipeptydów, pełniąc w ten sposób rolę molekularnych chaperonów. Białka szoku cieplnego katalizują procesy rozkładu nieodwracalnie zniszczonych białek lub ułatwiają (w sposób pośredni lub bezpośredni) poprawne fałdowanie białek o nieprawidłowej konformacji przestrzennej (Cymerys i Niemiałtowski, 2004; Parcellier i wsp., 2003), zapobiegając jednocześnie ich agregacji (Fink, 1999; Hartl i Hayer-Hartl, 2002; Pivovarova i wsp., 2005). Przez lata twierdzono, że za właściwe fałdowanie białek oraz łączenie się w oligomery odpowiada pierwszorzędowa struktura polipeptydów. Dopiero odkrycie białek pomocniczych, które biorą udział w tych procesach rzuciło nowe światło na ową kwestię (Cheng i wsp., 1989; Ellis, 1990; Rothman, 1989). W przypadku białka Hsp60-oligomeru zbudowanego z monomerów, które tworzą kompleks dwóch stosów pierścieni (Cheng i wsp., 1990), niesfałdowane białka przechodząc przez owe pierścienie zaczynają się skręcać i opuszczają oligomer w formie sfałdowanej. Cały proces fałdowania białek odbywa się w następujący sposób: przez środek pierścieni biegnie duży centralny kanał, w którym niesfałdowane białka są wiązane a pomocą oddziaływań hydrofobowych (Fenton, 1994). Każda z podjednostek Hsp60 zbudowana jest z trzech domen: szczytowej, równikowej i środkowej. Domena równikowa posiada miejsce wiążące dla cząsteczki ATP i dla kolejnego heptamerycznego pierścienia. Domena środkowa natomiast odpowiedzialna jest za utrzymanie pozostałych dwóch domen razem, zmienia ona swoją strukturę podczas wiązania cząsteczki ATP, powodując przemiany pomiędzy hydrofobowymi i hydrofilowymi substratami w miejscach wiążących. W takiej nieaktywnej formie białka są w stanie hydrofobowym. Podczas aktywowania za pomocą ATP, domena środkowa zmienia swoją konformację i eksponuje regiony hydrofilne. Ten proces zapewnia dokładność w fałdowaniu białek. Hsp10 pomaga białku Hsp60 w procesie fałdowania, działa ono opłaszczająco na miejsce wiązania ATP aktywując Hsp60. W wyniku takiego działania centralny kanał ulega powiększeniu, co sprzyja fałdowaniu białek (Ranford i wsp., 2000). Badania przeprowadzone przez zespół naukowy pod kierownictwem prof. Tadeusza Stefaniaka wykazały, że przeciwciała z surowicy zwierząt hiperimmunizowanych pełnymi komórkami bakteryjnymi, łączą się specyficznie z 19 niektórymi antygenami (białkami bakteryjnymi). Na szczególną uwagę zasługuje tutaj antygen o masie cząsteczkowej 60kDa. Wyniki immunoblotingu, przeprowadzone przez wyżej wymieniony zespół, dowodzą, że w przypadku hiperimmunizacji zwierząt takich jak buhaj, królik czy koza, dochodzi do wzmożonej produkcji przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi o masie 60kDa (Galli, 2010). Ponadto, z danych literaturowych wynika, że białka szoku cieplnego mogą pełnić rolę aktywatorów układu immunologicznego, poprzez indukcję produkcji cytokin prozapalnych przez monocyty i makrofagi, jak również poprzez aktywację i dojrzewanie komórek dendrytycznych (Chen i wsp., 1999; Flohe i wsp., 2003; Kol i wsp., 1998). W przypadku komórek dendrytycznych inkubowanych w obecności Hsp60 zaobserwowano wzrost produkcji TNFα, IL-6 oraz CC chemokin takich jak RANTES oraz MIP2. Zauważono również, że białka Hsp60 stymulują produkcję komórki Th1 do produkcji IL-2 i IL-15, prowadząc jednocześnie do dojrzewania komórek dendrytycznych. Białko Hsp60 może również prowadzić do aktywacji kinaz, takich jak JNK1/2, p38 (aktywowana w warunkach stresowych) oraz ERK 1/2 (Habich i Burkart, 2007; Vabulas i wsp., 2001). Oddziaływanie białek szoku cieplnego z komórkami układu immunologicznego jest możliwe dzięki obecności na powierzchni komórek odpowiednich receptorów, do których należy TLR2 oraz TLR4 (Habich i wsp., 2002; Habich i Burkart, 2007). Powyższe informacje stały się inspiracją do dalszych badań nad wpływem białka Hsp60 na komórki układu immunologicznego. Na podstawie danych literaturowych oraz wyników z immunizacji pełnymi komórkami bakteryjnymi, postanowiono zbadać w jakim stopniu antygen o masie 60kDa S. Enteritidis może brać udział w wzbudzaniu reakcji immunologicznej kurcząt. 20 2. CEL PRACY Celem pracy było uzyskanie rekombinowanego białka Hsp60 z Salmonella Enteritidis oraz jego charakterystyka w badaniach in vitro oraz in vivo. 2.1. Cele szczegółowe 1. Produkcja rekombinowanego białka Hsp60 S. Enteritidis oraz jego ocena ilościowa i jakościowa (SDS-PAGE, Western Blot). 2. Określenie immunogenności białka Hsp60 S. Enteritidis: a) wpływ na komórki układu immunologicznego kurcząt immunizowanych (optymalizacja dawki immunizacyjnej, badania serologiczne, badania immunocytochemiczne); b) wpływ na linię komórkową ConA-C1-VICK. 3. Określenie protekcyjnej roli białka Hsp60 S. Enteritidis (eksperymentalne zakażenie kurcząt immunizowanych). 21 3. MATERIAŁ I METODY 3.1. MATERIAŁ 3.1.1. Szczep bakterii Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis pochodzący z kolekcji szczepów z Katedry Epizootiologii z Kliniką Ptaków i Zwierząt Egzotycznych Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Szczep ten posłużył do uzyskania materiału genetycznego do dalszych badań, a w fazie eksperymentalnej do zakażenia kontrolnego kurcząt. 3.1.2. Ptaki Do badań określających wpływ białka Hsp60 na układ immunologiczny wykorzystano kurczęta (samce Lohmann Brown) (n= 194). Ptaki zostały zakupione w Zakładzie Wylęgu Drobiu zlokalizowanym na terenie Dolnego Śląska. Do momentu rozpoczęcia doświadczenia ptaki otrzymywały paszę i wodę ad libitum oraz były przetrzymywane w wiwarium Katedry Epizootiologii z Kliniką Ptaków i Zwierząt Egzotycznych. Wszystkie doświadczenia wykonano w warunkach zgodnie z Ustawą z dnia 21 sierpnia 1997 o ochronie zwierząt (dz. ust. z 2003, nr 106,poz. 1002), za zgodą II Lokalnej Komisji Etycznej do Spraw Doświadczeń na Zwierzętach (uchwała nr 53/2008). 3.1.3. Linia komórkowa Con A - C1 – VICK (ATCC) Do testów komórkowych została wykorzystana linia komórkowa pochodząca od kurcząt wcześniej immunizowanych S. Enteritidis. Frakcję komórek stanowią komórki T wyizolowane ze śledziony, a następnie hodowane w obecności ConA. Linię komórkową zakupiono w firmie ATCC – LGC Standards (Wielka Brytania). 3.2. METODY 3.2.1. Produkcja rekombinowanego białka Hsp60 Salmonella Enteritidis 3.2.1.1. Izolacja genomowego DNA W celu uzyskanie materiału genetycznego, który następnie posłużył do stworzenia rekombinowanego białka Hsp60, namnożono szczep Salmonella enterica 22 subsp. enterica serovar Enteritidis (określany dalej jako Salmonella Enteritidis) w płynnym podłożu LB przez 24 godz. w temp. 37˚C z wytrząsaniem. Z uzyskanej hodowli bakteryjnej, ezą o oczku 100µl, przesiano hodowlę na stałe podłoże LB i inkubowano przez 24 godz. w temp. 37˚C. Izolację DNA przeprowadzono za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA Genomic Mini (A&A Biotechnology Gdańsk, Polska), postępując zgodnie z procedurą podaną przez producenta. Uzyskany materiał był przechowywany do momentu dalszych badań w temperaturze -20˚C. 3.2.1.2. Reakcja PCR W celu amplifikacji fragmentu genu kodującego białko Hsp60, przeprowadzono reakcję PCR (termocykler BioRad Mini MJ). Mieszanina reakcyjna w objętości 25µl składała się z: 15 µl Polimerazy Platinum PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen, Niemcy) 1µl primeru for o stężeniu 100 pmol/µl (Oligo, Gdańsk) 1µl primeru rev o stężeniu 100 pmol/µl (Oligo, Gdańsk) 2µl matrycy DNA 6µl wody Milli-Q, natomiast warunki reakcji ustalono na: 94˚C przez 1 min. 35 cykli: 94˚C przez 30 s. 55˚C przez 30 s. 68˚C przez 2 min. 4˚C Produkty amplifikacji zostały rozdzielone w 1,5% żelu agarozowym z dodatkiem EtBr (Sigma – Aldrich, Niemcy). Jako marker mas posłużył Gen Ruller 1000bp DNA Ladder Plus (Fermentas, Litwa), a cała reakcja elektroforezy przebiegała 30 min. pod napięciem 120V w obecności buforu TAE (Fermentas, Litwa). Uzyskany produkt wycięto z żelu i oczyszczono za pomocą zestawu do izolacji DNA z żeli agarozowych Gel-Out, (A&A Biotechnology Gdynia, Polska). Ekstrakcja z żelu została przeprowadzona wg. zaleceń producenta. 23 3.2.1.3. Analiza restrykcyjna uzyskanego DNA Kolejnym etapem było uzyskanie lepkich końców zarówno w genomie jak i w wektorze. Do badań został wybrany wektor pET22b+(5493 pz.) z firmy Novagen (Niemcy). Jest on skonstruowany w oparciu o system promotora T7, a ekspresja znajduje się pod kontrolą operonu laktozowego. Białka powstałe w trakcie ekspresji są łączone z oligopeptydem histydynowym (HisTag), co zostało później wykorzystane w procesie oczyszczania białka za pomocą chromatografii powinowactwa. W celu przygotowania próbki wybrano dwa enzymy restrykcyjne (NcoI oraz XhoI – Fermentas, Litwa), których zadaniem było rozcięcie dwuniciowego DNA i utworzenie „lepkich końców”. Reakcja przebiegała przez 12 godzin w temp. 37˚C w buforze kompatybilnym w stosunku do obu enzymów (Bufor Tango – Fermentas, Litwa). Uzyskany produkt oczyszczono za pomocą metody chloroform-fenol i rozdzielono przy użyciu 1,5% żelu agarozowego. 3.2.1.4. Ligacja W celu uzyskania konstruktu hsp60pET22b+, który później posłużył do wtransformowania w komórki kompetentne, przeprowadzono proces ligacji. Polegał on na utworzeniu z wcześniej pociętych, w wyniku działania enzymów restrykcyjnych, fragmentów DNA długiego łańcucha (połączenia się „lepkich końców”). Reakcję przeprowadzono wg protokołu producenta, z użyciem ligazy T4 (Sigma – Aldrich, Niemcy). Jako kontrola posłużyła próbka, w której zamiast fragmentu DNA kodującego białko Hsp60, znajdowała się woda (autoligacja). Próbki wysłano do sekwencjonowania w celu weryfikacji poprawności procesu klonowania. 3.2.1.5. Transformacja Transformacja to proces polegający na wprowadzeniu do komórki obcego, nagiego DNA. W tym celu posłużono się komórkami kompetentnymi C41 pochodzącymi z Escherichia coli BL21(DE3) [E. coli F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)] (dzięki uprzejmości Katedry Higieny Żywności i Ochrony Zdrowia Konsumenta, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu). Są to mutanty szczepu DE3 przeznaczone do ekspresji błonowych białek, które w innych szczepach tworzą ciała inkluzyjne. Do transformacji użyto 5µl uzyskanego w wyniku ligacji konstruktu oraz 24 mieszaniny z autoindukcji (w celu zweryfikowania poprawności reakcji ligacji), które przeniesiono do rozmrożonych komórek kompetentnych i inkubowano przez 15 minut w temp. 4˚C. W celu zamknięcia błon, co jest warunkiem przyjęcia obcego plazmidu, inkubowano je przez 2,5 min. w temp. 37˚C. Po tym czasie do komórek dodano 500µl sterylnego bulionu LB i inkubowano przez 1 godz. w temp. 37˚C. Próbki zostały zwirowane (3 min. 2500 x g), supernatant zlany, a pozostała zawartość wysiana na stałe podłoże LB z dodatkiem ampicyliny (1mg/ml). Następnie inkubowano płytki w temp. 37˚C przez noc. Po inkubacji komórki zamrożono w Cryobankach (Graso Biotech, Polska) i przechowywano do dalszych badań w temp. -80˚C. 3.2.1.6. Autoindukcja Etap ekspresji białka został przeprowadzony w oparciu o system autoindukcji wg protokołu Novagen (Studier i wsp., 1990). Wykorzystuje on właściwości wektora, czyli ekspresję opartą na systemie T7 jak i obecność operonu laktozowego. Autoindukcja pozwala na ekspresję białka bez sprawdzania gęstości optycznej hodowli bakteryjnej. Metoda ta opiera się na wykorzystaniu poszczególnych komponentów medium, które są metabolizowane przez bakterie by osiągnąć wysokie OD600 i automatycznie aktywują operon laktozowy. Po całonocnej hodowli w temp. 37˚C, bakterie zostały zwirowane przez 30 min. przy 3 000 x g, supernatant zlany a pellet zamrożony do dalszych badań w temp. -20˚C. 3.2.1.7. Chromatografia powinowactwa W celu oczyszczenia białka z zamrożonego pelletu bakteryjnego wykorzystano właściwości, które zostały mu nadane dzięki ligacji z wektorem pET22b+ (przyłączenie ogona HisTag). Złożem do oczyszczania było NiNTA (Sigma-Aldrich, Niemcy), złoże niklu z agarozą, które posiada właściwości przyłączania cząsteczek z ogonem polihistydynowym. Posłużono się metodą oczyszczania w warunkach denaturacyjnych wg protokołu Invitrogen (Ni-NTA Purification System). Ocenę ilościową białka sprawdzano na bieżąco za pomocą odczynnika Bradford (Sigma-Aldrich, Niemcy) (100µl odczynnika i 10µl frakcji z kolumny). 25 3.2.2. Ocena jakościowa oraz ilościowa uzyskanego białka 3.2.2.1. Elektroforeza białka W celu rozdziału frakcji białek, uzyskanych w wyniku chromatografii powinowactwa wykorzystano reakcję SDS-PAGE przeprowadzoną przy natężeniu 40 mA. Skład żelu był następujący: 4% żel zagęszczający (AA/AB -29%/1%) 0,67 ml, bufor do żelu zagęszczającego 1,25 ml, woda destylowana 3,04 ml, APS 30 µl, TEMED 7µl oraz 12% żel rozdzielający (AA/AB 6 ml, bufor do żelu rozdzielającego 3,75 ml, woda destylowana 5,18 µl, APS 60 µl oraz TEMED 15 µl). Na ścieżkę dawano 17 µl próbki i 3 µl barwnika oraz 5µl markera mas (PageRuler™ Unstained Protein Ladder, Fermentas, Litwa). Do tej metody wykorzystano dwa żele z jednakowym układem próbek, pierwszy żel został wybarwiony za pomocą Coomassie Brilliant Blue (Sigma – Aldrich, Niemcy) (zabarwiony żel został zeskanowany w celu analizy), natomiast drugi posłużył jako matryca w technice Western Blot. 3.2.2.2. Western Blot Transfer z żelu poliakrylowego na nitrocelulozę przeprowadzono metodą półsuchą w komorze von Keutz. Żel po elektroforezie został przełożony na nasączone buforem do transferu (25 mM Tris, 192 mM glicyna, 20% metanol, pH 8,3) bibuły Whatman (Sigma – Aldrich, Niemcy) wg schematu: góra (-) 3 bibuły Whatman 4, 1 bibuła Whatman 1, żel, błona nitrocelulozowa, 1 bibuła Whatman 1, 3 bibuły Whatman 4 (+) dół. Transfer przebiegał przy natężeniu prądu 1-1,5 mA/cm2 membrany przez 50 min. Po zakończeniu transferu nitrocelulozę blokowano roztworem PBS+2% kazeina przez 15 min. Na membranę naniesiono kozie anty mysie przeciwciała pierwszorzędowe (IgG Anty-His-Tag 1:2000, ClonTech) i inkubowano przez noc w temperaturze 4˚C. Po całonocnej inkubacji membrana została trzykrotnie przepłukana roztworem PBS+0,02% Tween 20, a następnie naniesiono koniugat w stężeniu 1:2000 (Anty kozie IgG, ClonTech, USA) skoniugowany z HRP i inkubowano 1 godz. na kołysce laboratoryjnej w temp. pokojowej. Kolejnym etapem było trzykrotne przepłukanie membrany roztworem PBS+0,02% Tween 20 i wywołanie nitrocelulozy (15 mg chloronaftol rozpuszczony w minimalnej ilości 96% alkoholu etylowego, uzupełniony do 50 ml buforem Tris- 26 HCl następnie przesączony przez papierowy sączek). Wywołaną membranę, podobnie jak żel po SDS-PAGE zeskanowano i przeanalizowano. Próbki białka po chromatografii zostały zakonserwowane w roztworze 20% glicerolu i zamrożone w temp. -20˚C. Następnie próbki zostały połączone i dializowane w buforze PBS (membrana MWCO 8000-10000, Roth, Niemcy). W trakcie dializy (6 godz.) trzykrotnie zmieniano bufor dializujący. Po zakończeniu dializy ustalono spektrofotometrycznie (λ=280) ilość uzyskanego białka, jako wzorów używając określonych stężeń albuminy (0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml oraz 1 mg/ml). Uzyskane białko posłużyło do immunizacji kogutków. 3.2.3. Doświadczenia na zwierzętach 3.2.3.1. Eksperyment 1. Optymalizacja dawki immunizacyjnej Doświadczenie wykonano na 4. tyg. kurczętach podzielonych na 4 liczebnie równe grupy (8 osobników każda): immunizowane białkiem Hsp60 S. Enteritidis w dawce 50 µg/osobnika immunizowane białkiem Hsp60 S. Enteritidis w dawce 30 µg/osobnika immunizowane białkiem Hsp60 S. Enteritidis w dawce 10 µg/osobnika nieimmunizowane Ptaki immunizowano 2-krotnie w 4-tym i 6-tym tyg. życia rekombinowanym białkiem Hsp60 S. Enteritidis w połączeniu z niekompletnym adiuwantem Freunda (Sigma – Aldrich, Niemcy). Antygen w objętości 200 µl/osobnika podano podskórnie w fałd szyjny. Od kurcząt z każdej grupy pobrano do badania krew w celu wykrycia przeciwciał anty-Hsp60 S. Enteritidis. Materiał pobrano w 3., 6., 8., 10 oraz 13 dniu po każdej z immunizacji, do probówki typu eppendorf w objętości 1 ml, a następnie odwirowano w 3 000 x g przez 20 min. Surowicę kolekcjonowano i zamrożono w temp. -80˚C. Zamrożony materiał posłużył do dalszych badań w teście ELISA. 27 3.2.3.2. Eksperyment 2. Immunizacja kurcząt wybraną dawką rekombinowanego białka Hsp60 S. Enteritidis oraz określenie immunogenności antygenu na komórki układu odpornościowego ptaków. Doświadczenie wykonano na 4. tyg. kurczętach podzielonych na 3 liczebnie równe grupy (po 54 osobniki w grupie): immunizowane białkiem Hsp60 S. Enteritidis w dawce 50 µg/osobnika przyjmujące placebo (iniekcja 0,9% NaCl) nieimmunizowane Pierwsza immunizacja miała miejsce w 4. tyg. życia kurcząt, natomiast druga w 6. tyg. Antygen w objętości 200 µl/osobnika podawano podskórnie w fałd szyjny. Krew od ptaków wszystkich grup pobierano w 3, 6, 8, 10 oraz 13 dniu po każdej z immunizacji i kolekcjonowano w 1,5 ml probówkach typu eppendorf, a następnie odwirowano w 3 000 x g przez 20 min. Uzyskana w ten sposób surowica została zamrożona w -80˚C i wykorzystana do określenia miana przeciwciał w teście ELISA. 3.2.3.2.1. Badanie serologiczne (test ELISA) Płytki do testu (MaxiSorp, Nunc, Niemcy) opłaszczono białkiem Hsp60 w stężeniu 3 µg/dołek w objętości 50 µl w buforze węglanowym (Pracowania buforów PAN, Wrocław) i inkubowano w wilgotnej komorze w temp. 4˚C przez noc. Po całonocnej inkubacji płytki przepłukano 3 krotnie roztworem PBS (Pracowania buforów PAN, Wrocław) + 0,05% Tween 20 (Sigma – Aldrich, Niemcy) w objętości 100 µl na dołek. W celu zablokowania wolnych grup mogących niespecyficznie związać przeciwciała płytkę zablokowano roztworem PBS + 2% Tween 20 w objętości 50 µl na dołek i inkubowano przez 1 godz. w temp. 37˚C, przepłukano (tak jak w poprzednim etapie) i nałożono materiał badany (surowice) w rozcieńczeniu 1:2000 w objętości 50 µl na dołek. Inkubacja płytki trwała 1,5 godz. w temp. pokojowej, następnie odpłukano nadmiar niezwiązanych przeciwciał (3 x PBS + 0,05% Tween 20) i dodano koniugat [Anty-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in rabbit, Sigma – Aldrich, Niemcy] połączony z HRP w rozcieńczeniu 1:20 000 w objętości 50 µl na dołek i inkubowano 1,5 godz. w temp. pokojowej. Dodanie substratu TMB (Sigma – Aldrich, Niemcy) poprzedzono płukaniem. Substrat dodawano w ciemni w objętości 50 µl na dołek i czas reakcji 28 ustalono na 15 minut. Po tym czasie reakcję enzymatyczną zastopowano przy użyciu 2M H2SO4 (Sigma – Aldrich, Niemcy) w objętości 25 µl na dołek. Płytki czytano w skali referencyjnej (450nm/540nm) na czytniku firmy BioTech. 3.2.3.2.2. Badanie immunocytochemiczne (cytometria przepływowa) Badania cytometryczne limfocytów wykonano na kurczętach immunizowanych wybraną dawką rekombinowanego białka Hsp60 S. Enteritidis. Materiałem do badań była krew obwodowa pobrana od 6 losowo wybranych ptaków z każdej badanej grupy w 3, 6, 8, 10 i 13 oraz grudki chłonne jelit ślepych, również od 6 losowo wybranych osobników, pobierane w 2, 3, 6 i 13 dniu po każdej immunizacji. Krew pobierano do 2,5 ml probówek z heparyną Na (Medlab, Polska). Grudki chłonne jelit ślepych rozcierano na sitkach do izolacji komórek o oczkach 40 µm (Beton Dickinson, USA) w celu uzyskania 2 ml homogenizatu. Buforem do zawieszania był PBS pH 7,4 bez jonów Mg2+ i Ca2+ (Sigma – Aldrich, Niemcy). Komórki zostały wyizolowane w gradiencie stężeń z wykorzystaniem Ficoll 400 z uropoliną (Sigma-Aldrich, Niemcy) w 10 ml probówkach. 2 ml krwi lub homogenizatu nawarstwiono na 4 ml Ficoll z uropoliną i wirowano przez 30 min. z prędkością 720 x g. Do dalszej izolacji zebrano kożuszek leukocytarny, który znajdował się na granicy faz i zawieszono w 5 ml PBS pH 7,4 bez jonów Mg2+ i Ca2+. Zawiesinę wirowano przez 7 min. 720 x g. Pellet zawieszono w 3 ml PBS pH 7,4 bez jonów Mg2+ i Ca2+ i ponownie wirowano w takich samych warunkach. Pellet zawieszono w 1 ml PBS pH 7,4 bez jonów Mg2+ i Ca2+. Komórki policzono za pomocą komory Thoma. Komórki zostały znakowane monoklonalnymi przeciwciałami (100 µl zawiesiny, co stanowiło 1 mln komórek, 900 µl PBS pH 7,4 bez jonów Mg2+ i Ca2+ oraz 10 µl przeciwciał). W celu immunofluorescencyjnej analizy, limfocyty inkubowano z odpowiednimi parami przeciwciał sprzężonymi z barwnikiem. Wykorzystano następujące połączenia przeciwciał: CD4/CD8, CD3/Bu1, TCRαβ oraz TCRγδ. Wszystkie przeciwciała zostały zakupione w firmie Serotec (USA). Komórki wraz z przeciwciałami inkubowano w temp. 4˚C przez 30 min., następnie zwirowano przez 7 min. 720 x g. Pellet zawieszono w 200 µl PBS pH 7,4 bez jonów Mg2+ i Ca2+ i ponownie zwirowano. Komórki zawieszono ponownie w takiej samej objętości buforu i przeniesiono całą zawartość do probówek do cytometru przepływowego. Oznaczenie obecności markerów powierzchniowych 29 wykazano w cytometrze przepływowym FacsCalibur (BD, USA) i oprogramowaniem CellQuest (BD, USA). 3.2.3.2.3. Test proliferacji komórkowej (MTT) z użyciem linii komórkowej ConA-C1-VICK Linia komórkowa ConA-C1-VICK (ATCC Catalog No. CRL-12135, Wielka Brytania) została rozmrożona i rozchodowana wg procedury zalecanej przez producenta (ATCC). Do hodowli komórkowych zostało wykorzystane medium komórkowe RPMI-1640 (ATCC) z dodatkiem 5% FBS (fetal bovine serum) (SigmaAldrich, Niemcy) oraz 1% antybiotyku (penicylina 1%) (Sigma-Aldrich, Niemcy) oraz 1% glutaminy (Sigma-Aldrich, Niemcy). Przeprowadzony test transformacji blastycznej komórek (MTT) ma na celu określenie wpływu białka Hsp60 na linię komórkową ConA-C1-VICK. Dla porównania użyto znanych mitotoksyn: ConA (Sigma-Aldrich, Niemcy), LPS (Sigma-Aldrich, Niemcy) oraz mitC (Sigma-Aldrich, Niemcy). W celu przygotowania komórek do właściwego testu, należało najpierw je namnożyć. Zamrożone komórki wstawiono do łaźni wodnej o temp. 37˚C na ok 2 min., a następnie przeniesiono zawartość do 15 ml falkonu z 9 ml pełnego medium i wirowano przez 7 min. z prędkością 125 x g w temp. 4˚C. Supernatant zlano, dodano 2 ml świeżego medium i zawartość przeniesiono na płytki do hodowli komórkowych (Nunc, Niemcy) z 5 ml kompletnego medium. Żywotność komórek oraz ich ilość oceniono przy użyciu komory Thoma (90 µl medium + 1 µl błękitu trypanu (SigmaAldrich, Niemcy) + 10 µl zawiesiny komórek). Szalki z komórkami inkubowano przez 2 dni w temp. 37˚C w atmosferze wzbogaconej w 5% CO2. Płytkę 96. dołkową (Nunc, Niemcy) opłaszczono komórkami w stężeniu 50 tys. kom/ml w objętości 100 µl na dołek, następnie inkubowano przez 2 godz. w temp. 37˚C w inkubatorze z dodatkiem 5% CO2. Po zakończonej inkubacji do komórek dodano antygen (Hsp60 S. Enteritidis) w trzech doświadczalnych stężeniach: 10 µg/ml, 30 µg/ml oraz 50 µg/ml w ilości 50 µl/dołek. Komórki wraz z antygenem inkubowano przez 6 godz. Po zakończonej inkubacji dodano następujące mitogeny (50 µl/dołek): LPS w stężeniu 100 ng/ml, 1 µg/ml, 10 µg/ml,; ConA w stężeniu 7,5 µg/ml, 5 µg/ml, 2,5 µg/ml oraz 30 mitC w stężeniu 1 µg/ml. Każde ze stężeń zostało powtórzone 3 krotnie. Powstały następujące warianty doświadczalne: LPS 100 ng/ml+Hsp60 10 µg/ml, ConA 2,5 µg/ml+Hsp60 10 µg/ml, LPS 100 ng/ml+Hsp60 30 µg/ml ConA 2,5 µg/ml+Hsp60 30 µg/ml LPS 100 ng/ml+Hsp60 50 µg/ml ConA 2,5 µg/ml+Hsp60 50 µg/ml LPS 10 µg/ml+Hsp60 10 µg/ml, ConA 5 µg/ml+Hsp60 10 µg/ml, LPS 10 µg/ml+Hsp60 30 µg/ml ConA 5 µg/ml +Hsp60 30 µg/ml LPS 10 µg/ml+Hsp60 50 µg/ml ConA 5 µg/ml+Hsp60 50 µg/ml LPS 1 µg/ml+Hsp60 10 µg/ml ConA 7,5 µg/ml+Hsp60 10 µg/ml, LPS 1 µg/ml+Hsp60 30 µg/ml ConA 7,5 µg/ml+Hsp60 30 µg/ml LPS 1 µg/ml+Hsp60 50 µg/ml. ConA 7,5 µg/ml+Hsp60 50 µg/ml Mitogen mitC inkubowano bez dodatku antygenu Hsp60. Kontrolę stanowiły komórki bez dodatku mitogenów (kk – kontrola komórek) oraz samo medium (km – kontrola medium). Płytkę inkubowano przez 72 godz. w inkubatorze, w atmosferze wzbogaconej w 5% CO2, a następnie dodano 20 µl MTT i ponownie inkubowano (2 godz.). Następnie komórki poddano lizie za pomocą buforu lizującego w ilości 80 µl/dołek (końcowa objętość 300 µl/dołek) i inkubowano przez 4 godz. (37˚C, 5% CO2). Płytkę odczytano za pomocą czytnika firmy BioTech wykorzystując fale o długości 550 nm. Wyniki testu przeanalizowano i opracowano statystycznie za pomocą testu Kruskalla-Wallisa. 3.2.3.3. Eksperyment 3. Określenie protekcyjnej roli białka Hsp60 S. Enteritidis. 3.2.3.3.1. Eksperymentalne zakażenie kurcząt zjadliwym szczepem Salmonella Enteritidis. Dwa tygodnie po drugiej immunizacji ptaki z grupy immunizowanej oraz przyjmującej placebo, zostały zakażone eksperymentalnie szczepem Salmonella Enteritidis w dawce 106 cfu/ptaka, zawieszonej w 1 ml jałowej soli fizjologicznej. Zawiesinę bakterii podano za pomocą jałowej sondy do wola. 31 3.2.3.3.2. Badania mikrobiologiczne. W celu wykazania, że nie doszło do wcześniejszego zakażenia pałeczką S. Enteritidis przed zakażeniem eksperymentalnym od wszystkich osobników (9 osobników z każdej grupy) pobrano wymazy z kloaki i przebadano w kierunku S. Enteritidis. Następnie 1, 2, 3, 7, 14, 21 i 28 dniu po zakażeniu eksperymentalnym, pobrano wymazy z kloaki w celu wykazania obecności szczepu S. Enteritidis. Ponadto w ostatnim dniu doświadczenia (28 dzień) ptaki zostały skrwawione a wątroba, śledziona i wycinek z jelita cienkiego posłużyły jako materiał do badań bakteriologicznych. Wszystkie procedury badań mikrobiologicznych zostały wykonane w oparciu o normę PN-EN ISO 6579:2003+A1:2007 „Wykrywanie pałeczek Salmonella w kale i próbkach środowiskowych”. Kurczęta były poddawane dekapitacji poprzez przerwanie rdzenia kręgowego. Zarówno wymazy jak i narządy poddano inkubacji w BWP (Biocorp, Polska) w proporcji 1:10 w temp. 37˚C przez 18 godz. (+/- 2 godz.), przednamnażanie nieselektywne. Następnie 1 ml hodowli z wody peptonowej przeniesiono punktowo na selektywnie namnażające podłoże MRSV (Biocorp, Polska) i inkubowano w temp. 41,5˚C przez min 24 godz. (+/- 3 godz.). Powstałe na podłożu obszary granicy halo, za pomocą jałowej ezy posiano w sposób redukcyjny na stałe podłoża różnicujące (podłoże XLD (Biocorp, Polska) oraz wybiórczo-różnicujące MacConkey (Biocorp, Polska)) i inkubowano 24 godziny (+/- 3 godz.) w temp. 37˚C. Po 24 godz. kolonie podejrzane o przynależność do Salmonella wyizolowano na Agar Odżywczy i identyfikowano (Biocorp, Polska). 3.2.3.3.2. Badania serologiczne – typizacja wyizolowanych bakterii. Typizację – przynależność do serowaru S. Enteritidis wyizolowanych szczepów bakterii potwierdzono za pomocą aglutynacji szkiełkowej. Do identyfikacji użyto surowic swoistych dla antygenów somatycznych i rzęskowych I i II fazy (Biomed, Polska). 32 4. WYNIKI 4.1 Produkcja rekombinowanego białka Hsp60 Salmonella Enteritidis. W wyniku reakcji amplifikacji genu hsp60 Salmonella Enteritidis przy użyciu zaprojektowanych primerów: For–5’GCGAATATGGCTGCCAAGGATATTCGTTTCGGTG3’, Rev–5’CGGAAGCTTGAAATCCATGCCGCCCATGC3’ (Oligo, Polska) uzyskano pojedynczy prążek (amplikon) na wysokości ok 1700 pz., co przedstawia ryc. 1. Amplikon na wysokości 1700 pz. Ryc. 1. Wizualizacja uzyskanego produktu reakcji PCR – genomowe DNA Salmonella Enteritidis w 1,5% żelu agarozowego z dodatkiem EtBr Oczyszczony fragment poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi (NcoI i XhoI), dzięki czemu uzyskano konstrukt hsp60pET22b+. Po wtransformowaniu otrzymanego konstruktu do komórek kompetentnych prowadzono hodowle bakteryjne, których celem była nadekspresja genu kodującego gen hsp60 w warunkach autoindukcji. W wyniku procesu autoindukcji komórki bakteryjne produkowały białko, które zostało oczyszczone w procesie chromatografii powinowactwa. 33 4.2 Ocena jakościowa oraz ilościowa uzyskanego białka. Uzyskanie w poprzednim etapie rekombinowane białko Hsp60 S. Enteritidis sprawdzono pod względem czystości oraz ilości. W wyniku metody rozdziału białka SDS-PAGE w żelu poliakrylamidowym wyraźnie widać, że uzyskane białko osiągnęło swój punkt izoelektryczny na wysokości 60kDa. Brak dodatkowych prążków na innych wysokościach świadczy o wysokim stopniu oczyszczenia białka. W wyniku transferu białka na błonę nitrocelulozową (Western blot) potwierdzono, że uzyskane białko jest białkiem Hsp60 (ryc. 2). Stężenie białka zmierzone spektrofotometrycznie ustalone zostało na 0,47 µg/ml. 130kDa 95kDa 72kDa 55kDa 36kDa 28kDa SDS - PAGE Western Blot Ryc. 2. Analiza wyekspresjonowanego białka za pomocą SDS-PAGE i Western Blot 4.3. Określenie wpływu zastosowanego antygenu na komórki układu immunologicznego kurcząt. 4.3.1. Wyniki optymalizacji dawki immunizacyjnej Wyniki badań przedstawiające wpływ zastosowanego antygenu na komórki układu immunologicznego kurcząt (komórki plazmatyczne) przedstawiono w tab. 2 i na ryc.3. 34 Tab. 2. Ocena względnego stężenia przeciwciał anty-Hsp60 S. Enteritidis mierzona wielkością absorbancji w teście ELISA po pierwszej i po drugiej immunizacji (wyrażona w postaci średniej arytmetycznej oraz SD) (* różnice istotne statystycznie p<0,001) I immunizacja Dzień trwania doświadczenia Dzień po immunizacji II immunizacja 31 34 36 38 41 45 48 50 52 55 3 6 8 10 13 3 6 8 10 13 50 μg/osobnika 1,15* (0,23) 1,08 (0,64) 1,23 (0,65) 1,11* (0,07) 1,14 (0,38) 1,56* (0,16) 1,41 (0,66) 0,36 (0,54) 1,55 (0,45) 1,65* (0,54) 30 μg/osobnika 0,32 (0,02) 1,01 (0,74) 0,36 (0,29) 0,71 (1,05) 0,27 (0,88) 0,90 (0,02) 0,28 (0,46) 0,21 (0,04) 1,80 (0,40) 1,78 (0,34) 10 μg/osobnika 0,39 (0,09) 0,42 (0,29) 0,58 (1,15) 0,86 (0,82) 0,62 (0,59) 0,28 (0,04) 0,17 (0,08) 0,15 (0,17) 0,63 (0,47) 0,78 (0,24) 35 37 Optymalizacja dawki immunizacyjnej Absorbancja λ=450/540 nm 2,00 1,50 50 µg/osob. 30 µg/osob. 1,00 10 µg/osob. 0,50 0,00 3dpIi 3 d p II i 50 µg/osob. 1,15 1,56 30 µg/osob. 0,32 0,90 10 µg/osob. 0,39 0,28 Ryc.3. Ocena względnego stężenia przeciwciał anty-Hsp60 S. Enteritidis mierzona wielkością absorbancji w teście ELISA w 3 dniu po pierwszej i po drugiej immunizacji u kurcząt immunizowanych różnymi dawkami antygenu 36 38 Wyniki optymalizacji testu ELISA wskazują, że dawka 50 µg/osobnika daje największą odpowiedź ze strony limfocytów B, stymulując je do produkcji specyficznych przeciwciał anty-Hsp60 S. Enteritidis. Wyniki z etapu optymalizacji dawki, pozwoliły na przeprowadzenie kolejnego doświadczenia. W tym teście porównywano względne stężenie przeciwciał antyHsp60 S. Enteritidis dla trzech grup w trakcie pierwszej i drugiej immunizacji. Materiałem badawczym była surowica uzyskana od kurcząt: 2-krotnie immunizowanych rekombinowanym białkiem Hsp60 S. Enteritidis, 2-krotnie poddanych działaniu placebo (0,9% NaCl) oraz nieimmunizowanych. Poziom przeciwciał anty-Hsp60 (absorbancja wyrażona w średnich arytmetycznych oraz odchyleniach standardowych) w surowicy przedstawiono w tab. 3, 4, 5 i na ryc. 4 i 5. 37 Tab. 3. Ocena względnego stężenia przeciwciał anty-Hsp60 mierzona wielkością absorbancji w teście ELISAw grupie immunizowanej białkiem Hsp60 w dawce 50 µg/ml (* różnice istotne statystycznie p<0,001) Immunizacja N (liczba osobników) Dzień trwania doświadczenia Dzień po immunizacji Średnia I immunizacja II immunizacja 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 31 34 36 38 41 45 48 50 52 55 3 6 8 10 13 3 6 8 10 13 0,34* 0,65 0,48* 0,45 0,58 0,63 0,72* 0,64 0,78 0,77* 0,20 0,25 0,25 0,32 0,33 0,28 0,20 0,14 0,22 0,14 arytmetyczna SD 38 38 Tab. 4. Ocena względnego stężenia przeciwciał anty-Hsp60 mierzona wielkością absorbancji w grupie poddanej działaniu placebo (0,9% NaCl) Immunizacja N (liczba osobników) Dzień trwania doświadczenia Dzień po immunizacji Średnia I immunizacja II immunizacja 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 31 34 36 38 41 45 48 50 52 55 3 6 8 10 13 3 6 8 10 13 0,22 0,22 0,26 0,29 0,23 0,19 0,26 0,22 0,78 0,21 0,20 0,10 0,16 0,30 0,23 0,08 0,22 0,11 0,14 0,08 arytmetyczna SD 39 39 Tab. 5. Ocena względnego stężenia przeciwciał anty-Hsp60 mierzona wielkością absorbancji w grupie nieimmunizowanej Immunizacja N (liczba osobników) Dzień trwania doświadczenia Dzień po immunizacji Średnia I immunizacja II immunizacja 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 31 34 36 38 41 45 48 50 52 55 3 6 8 10 13 3 6 8 10 13 0,21 0,14 0,12 0,10 0,22 0,20 0,15 0,15 0,10 0,17 0,28 0,07 0,04 0,05 0,25 0,18 0,14 0,15 0,09 0,14 arytmetyczna SD 40 40 Ocena względnego stężenia przeciwciał surowicypo kurcząt po pierwszej Poziom przeciwciał anty-Hsp60 wanty-Hsp60 surowicy w kurcząt pierwszej immunizacji immunizacji Absorbancja 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 3 6 8 10 K NaCl Hsp60 K NaCl Hsp60 K NaCl Hsp60 K NaCl Hsp60 K NaCl Hsp60 0,10 0,00 13 d.p.i. Ryc. 4. Ocena względnego stężenia przeciwciał anty-Hsp60 w grupach badanych (immunizowna dawką 50 µg/ml, iniekcyjna 0,9% NaCl oraz grupa kontrolna) w 3, 6, 8, 10 oraz 13 dniu po pierwszej immunizacji (d.p.i.) 41 41 3 6 8 10 K NaCl Hsp60 K NaCl Hsp60 K NaCl Hsp60 K NaCl Hsp60 K NaCl 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 Hsp60 Absorbancja Poziom przeciwciał anty-Hsp60 w surowicy kurcząt po drugiej Ocena względnego stężenia przeciwciał anty-Hsp60 w surowicy kurcząt po immunizacji drugiej immunizacji 13 d.p.i. Ryc. 5. Ocena względnego stężenia przeciwciał anty-Hsp60 w grupach badanych (immunizowna dawką 50 µg/ml, iniekcyjna 0,9% NaCl oraz grupa kontrolna) w 3, 6, 8, 10 oraz 13 dniu po drugiej immunizacji (d.p.i.) 42 42 Interpretacja wyników polegała na analizie różnic w cechach. Na podstawie testu U Manna-Whitneya stwierdzono, że istotnie statystycznie różnice (p=0,009) w grupie immunizowanej rekombinowanym białkiem Hsp60 występują pomiędzy wartościami w 3 dniu po pierwszej immunizacji a 6, 10 i 13 dniem po drugiej immunizacji (odpowiednio 0,34, 0,72, 0,78 i 0,77). Na podstawie analizy wieloczynnikowej, z wykorzystaniem testu Friedmana wykazano, że grupa immunizowana różni się istotnie statystycznie od pozostałych grup (p<0,001). Wyniki przedstawione powyżej wskazują na istotność drugiej immunizacji preparatem białkowym. Mimo wzrostu stężenia przeciwciał już w pierwszych dniach po pierwszej immunizacji (z 0,34 do 0,65), dopiero po powtórnym podaniu antygenu ich poziom utrzymuje się na wyrównanym poziomie w 3, 6, 8, i 13 dniu po drugiej immunizacji (odpowiednio 0,63, 0,72, 0,64 oraz 0,77). Drugi sposób analizy danych przedstawia statystykę opisową i skupia się na porównaniu cech w dwóch przedziałach czasowych (po pierwszej i po drugiej immunizacji). Na jej podstawie można stwierdzić, że w wyniku immunizacji doszło do wzbudzenia intensywności przeciwciał anty-rHsp60 S. Enteritidis (notuje się istotnie statystyczny wzrost poziomu przeciwciał w wyniku drugiej immunizacji p<0,001). Wyniki wyrażone w postaci średniej arytmetycznej wskazują na wzrost absorbancji z 0,51 po pierwszej, do 0,71 po drugiej immunizacji [odpowiednio dla grupy, której podano placebo (0,26 oraz 0,22) i dla grupy nieimmunizowanej (0,16 oraz 0,15)], co przedstawia tab. 6. 43 Tab. 6. Ocena względnego stężenia przeciwciał anty-Hsp60w 13 dniu po pierwszej i po drugiej immunizacji (* różnicie istotne statystycznie p<0,001) 50 µg/ml Grupa Immunizacja Średnia 0,9% NaCl K I II I II I II 0,51* 0,71* 0,26 0,22 0,16 0,15 0,28 0,20 0,21 0,13 0,17 0,14 arytmetyczna SD 44 44 4.3.2. Wyniki testu immunocytochemicznego (cytometria przepływowa). Wyniki analizowano przy użyciu 2-testu ANOVA. Uzyskane rezultaty z badań nad kształtowaniem się odsetka subpopulacji limfocytów T i B w grudkach chłonny jelit ślepych przedstawiono w tab. 7, 8 i 9 oraz na ryc. 6 i 7, natomiast w tab.10, 11 i 12 oraz na ryc. 8 i 9 przedstawiono wyniki badań nad kształtowaniem się odsetka subpopulacji limfocytów T i B w krwi obwodowej. Szczegółowa analiza danych pozwoliła na określenie, w których dniach po kolejnych immunizacjach doszło do wahań udziału poszczególnych badanych subpopulacji limfocytów. Wszystkie wartości z grupy immunizowanej białkiem były porównywane z wartościami z grupy kontrolnej K, gdyż wraz z wiekiem kurcząt dochodzi do wahań udziału subpopulacji limfocytów. W przypadku grudek chłonnych jelit ślepych wykazano, że: w grupie immunizowanej białkiem Hsp60 zaobserwowano wyższy odsetek subpopulacji limfocytów CD3+ w 3 oraz 6 dniu po pierwszej immunizacji (odpowiednio 47,33 i 38,47) oraz w 3 dniu po drugiej immunizacji (23,57). Spadek odsetka subpopulacji występuje w 13 dniu po pierwszej immunizacji (22,33) i poziom ten utrzymuje się do 3 dnia po drugiej immunizacji włącznie. W przypadku subpopulacji CD4+ nie zaobserwowano istotnych różnic pomiędzy grupą immunizowaną białkiem, a grupami kontrolnymi. Wyniki dla subpopulacji limfocytów CD8+ w grupie immunizowanej białkiem Hsp60 wskazują na największy wzrost odsetka w 3 dniu po pierwszej (19,62), a spadek w 3 dniu po drugiej immunizacji (7,63). Do wzrostu odsetka subpopulacji Bu1+ w grupie immunizowanej dochodzi w 3 dniu po drugiej immunizacji (60,53. Nie zaobserwowano spadku odsetka subpopulacji we wszystkich terminach pobierania prób w trakcie trwania doświadczenia. W przypadku subpopulacji TCRαβ+ w grupie immunizowanej doszło do wzrostu odsetka w 3 dniu po pierwszej i 6 dniu po drugiej immunizacji (równe wartości na poziomie 12,09), spadek natomiast zaobserwowano w 13 dniu po drugiej immunizacji i zanotowano go na poziomie 4,97. Ostatnią badaną subpopulacją były limfocyty TCRγδ+. W grupie immunizowanej największy wzrost notuje się na 3 dzień po pierwszej immunizacji (9,21), a spadek na 3 dzień po drugiej immunizacji (3,42). W wyniku przeprowadzonych badań cytometrycznych na komórkach krwi obwodowej zaobserwowano następujące zależności. W grupie immunizowanej rekombinowanym białkiem Hsp60 zanotowano wzrost subpopulacji CD3+, CD4+ oraz CD8+ w 8 dniu po drugiej immunizacji (odpowiednio 39,90, 21,35 10,80) 45 natomiast ich spadek w 13 dniu po pierwszej immunizacji (odpowiednio 11,03, 6,93, 2,80). Również w tym samym dnu zaobserwowano spadek liczebności subpopulacji TCRαβ+ a także TCRγδ+ (2,05 i 2,06). Ich wzrost przypada odpowiednio na 6 i 10 dzień po drugiej immunizacji (odpowiednio 8,87 i 6,23). Największy wzrost subpopulacji Bu1+ zauważono w 10 dniu po drugiej immunizacji (17,32), a jej spadek w 10 dniu po pierwszej immunizacji (6,78). 46 Tab. 7. Kształtowanie się odsetka subpopulacji limfocytów CD3+ oraz CD4+ w grudkach chłonnych jelit ślepych (* różnice istotne statystycznie p<0,001) CD3+ Dni po pierwszej immunizacji 2 3 6 13 47,33* (2,94)a Dni po drugiej immunizacji 2 3 6 13 CD4+ Dni po pierwszej immunizacji Dni po drugiej immunizacji 2 3 6 13 2 3 6 13 Hsp60 28,67* (4,31)a 38,47 (12,74) 22,33 (13,31) 26,32 (8,66) 23,57* (3,12)a 43,57 (5,19) 39,12 (8,96) 20,63* (5,36)a 24,45* (1,69)a 29,38 (6,02) 18,80 (4,43) 19,02* (7,28)a 23,70 (4,07) 24,60 (3,86) NaCl 30,95 36,67 43,68 (3,59)b1 (12,13)b1 (12,72) 20,02 (4,74) 27,48 (5,34) 25,78 (3,04)b1 38,30 (3,06) 43,07 (3,30) 20,03 18,83 (2,92)b1 (4,79)b1 30,22 (4,42) 28,67 (6,50) 21,68 15,63 23,20 (6,59)b1 (1,28)b1 (3,66) 25,68 (3,57) K 31,10 39,37 (2,83)b2 (8,24)b2 18,18 (7,79) 34,45 25,38 (11,85) (4,56)b2 43,68 (5,27) 42,75 (6,35) 27,37 21,25 (4,31)b2 (4,95)b2 32,37 (4,18) 22,77 (6,96) 19,55 13,95 25,45 (4,43)b2 (1,15)b2 (3,71) 24,68 (3,80) 37,35 (7,40) 14,15 * (2,82)a Tab. 8. Kształtowanie się odsetka subpopulacji limfocytów CD8+ oraz Bu1+ w grudkach chłonnych jelit ślepych (* różnice istotne statystycznie p<0,001) CD8+ Dni po pierwszej immunizacji Dni po drugiej immunizacji 2 3 6 13 2 3 6 13 19,62* 14,68 (1,94)a (4,88) 10,15* (2,53)a 8,12 7,63 17,43 17,22 (2,65) (1,30) (3,95) (3,85) Bu1+ Dni po pierwszej immunizacji 2 3 6 13 37,83* (4,33)a Dni po drugiej immunizacji 2 3 6 13 Hsp60 10,68 (2,66) 46,32 (1,89) 50,47 (7,48) 44,93 55,07 (25,39) (5,48) 60,53 (4,61) 47,88 55,23 (6,36) (7,26) NaCl 7,57 16,50 18,58 5,83 10,97 10,07 18,08 18,75 28,43 53,25 (2,07) (5,63)b1 (6,23) (2,99)b1 (4,02) (1,24) (2,86) (4,32) (4,26)b1 (10,66) 45,13 (7,65) 64,37 (1,48) 57,07 (3,25) 58,93 (2,99) 53,52 50,42 (3,59) (4,03) 11,78 14,10 15,78 5,60 15,25 9,82 17.23 19,48 17,82 (2,86) (2,27)b2 (5,83) (2,08)b2 (7,76) (3,10) (3,76) (4,21) (9,74)b2 51,25 (5,65) 62,65 (5,54) 55,32 (2,00) 57,48 (8,51) 48,13 49,28 (4,00) (3,46) K 48,02 (6,08) 47 47 Tab. 9. Kształtowanie się odsetka subpopulacji limfocytów TCRαβ+ oraz TCRγδ+ w grudkach chłonnych jelit ślepych TCRαβ Dni po pierwszej immunizacji 2 3 6 13 2 Dni po drugiej immunizacji 3 6 13 TCRγδ Dni po pierwszej immunizacji Dni po drugiej immunizacji 2 3 6 13 2 3 6 13 Hsp60 8,84 (3,90) 12,09 (3,02) 10,80 (4,03) 6,80 (4,08) 5,09 (2,84) 4,97 (2,21) 12,09 (5,68) 8,98 (3,74) 6,41 (2,31) 9,21 7,28 4,68 6,06 3,42 7,96 8,09 (7,59) (6,66) (3,59) (4,76) (2,32) (6,01) (5,67) NaCl 10,41 (5,16) 10,32 (4,09) 12,11 (4,13) 5,07 (3,16) 7,88 (3,82) 6,51 (2,35) 11,59 (4,08) 11,22 (4,30) 5,87 (1,55) 7,99 8,21 4,24 6,27 4,35 7,27 8,21 (7,59) (7,93) (3,33) (5,50) (2,32) (6,15) (6,72) K 11,62 (5,87) 10,67 (4,43) 10,97 (3,97) 5,45 (3,98) 10,79 (4,53) 6,49 (2,83) 13.11 (5,46) 10,67 (4,06) 8,84 (2,89) 7,17 7,25 4,31 6,96 4,71 8,03 8,19 (6,45) (6,90) (4,44) (7,57) (3,40) (6,64) (6,22) 48 48 Tab. 10. Kształtowanie się odsetka subpopulacji limfocytów CD3+ oraz CD4+ w krwi obwodowej (* różnice istotne statystycznie p<0,001) CD3+ 3 Dni po pierwszej immunizacji 6 8 10 13 CD4+ 3 Dni po drugiej immunizacji 6 8 10 13 3 Dni po pierwszej immunizacji 6 8 10 13 3 Dni po drugiej immunizacji 6 8 10 13 Hsp60 20,78 (3,53) 21,12* (3,81) a 19,15 (6,16) 14,43 (2,14) 11,03 (3,83) 25,35 (13,5) 36,65 (17,4) 39,90 (2,79) 38,85 (9,04) 35,60 (18,0) 11,78 (1,45) 12,05 (3,25) 11,43 (2,52) 8,63 (1,48) 6,93 (1,81) 14,87 (8,75) 21,00* 21,32* (9,40) (3,06) a a 20,00 (3,85) 18,00 (8,75) NaCl 17,27 (3,64) 16,18 (4,47) b1 16,70 (3,07) 15,98 (0,48) 13,32 (4,49) 32,42 (18,3) 27,20 (9,61) 37,00 (15,0) 32,48 (7,21) 35,33 (23,8) 10,33 (1,88) 8,37 (1,80) 8,85 (2,76) 8,52 (0,74) 6,47 (1,29) 16,35 (9,03) 14,78 (4,75) b1 19,13 (5,09) b1 18,82 (4,98) 17,71 (13,11) K 19,27 (5,02) 15,60 (3,73) b2 18,75 (5,33) 22,97 (19,1) 9,95 (0,45) 36,53 (10,6) 26,75 (6,72) 35,60 (4,20) 38,47 (14,5) 22,10 (5,23) 12,00 (2,84) 9,83 (2,24) 9,68 (2,07) 13,30 (12,4) 5,83 (1,32) 19,18 (5,40) 12,62 (3,43) b2 16,97 (2,14) b2 19,75 (7,12) 10,53 (2,37) 49 49 Tab. 11. Kształtowanie się odsetka subpopulacji limfocytów CD8+ oraz Bu1+ w krwi obwodowej (* różnice istotne statystycznie p<0,001) CD8+ 3 Dni po pierwszej immunizacji 6 8 10 13 Bu1+ 3 Dni po drugiej immunizacji 6 8 10 13 3 Dni po pierwszej immunizacji 6 8 10 13 3 Dni po drugiej immunizacji 6 8 10 13 Hsp60 10,4* 9,93* 5,30 5,38 5,80 3,37 2,80 5,03 10,80 8,12 9,00 12,03 8,07 7,58 6,78 7,48 16,02 16,63 17,32 16,15 (7,26) (2,71) (1,59) (2,25) (3,40) (0,80) (1,14) (4,19) (3,08) (3,88) (7,03) (0,50) (2,66) (4,11) (2,53) (3,26) (5,38) (5,09) (1,70) (7,48) a a NaCl 7,70 13,07 4,42 3,03 4,52 4,72 2,73 8,65 9.92 8,77 9,03 13,17 9,23 7,87 8,90 7,87 13,92 16,77 16,53 12,87 (3,29) (2,85) (1,15) (1,63) (2,33) (0,54) (2,02) (7,37) (5,56) (3,11) (8,55) (2,04) (3,26) (2,09) (1,00) (1,76) (2,29) (3,97) (3,75) (4,42) b1 b1 K 5,32 19,68 4,27 3,42 4,32 7,12 2,42 11,55 9,13 9,00 4,97 9,20 8,28 8,10 11,00 6,83 10,58 21,28 13,90 9,68 (2,41) (5,57) (1,84) (1,45) (2,02) (7,17) (0,42) (3,83) (1,92) (6,06) (1,02) (1,55) (2,37) (1,07) (5,86) (0,70) (2,35) (18,6) (6,40) (1,53) b2 b2 50 50 Tab. 12. Kształtowanie odsetka subpopulacji limfocytów TCRαβ+ oraz TCRγδ+ w krwi obwodowej (* różnice istotne statystycznie p<0,001) TCRαβ+ Dni po pierwszej immunizacji Dni po drugiej immunizacji 3 6 8 10 13 3 6 8 10 13 TCRγδ+ Dni po pierwszej immunizacji Dni po drugiej immunizacji 3 6 8 10 13 3 6 8 10 13 Hsp60 5,33* 3,41* 3,59* 6,02* 4,60 4,89 3,50 2,05 4,20 8,87 8,38 8,11 6,66 3,16 3,22 2,07 2,06 6,06 6,23 5,25 (3,84) (2,25) (2,96) (5,09) (2,81) (3,31) (2,19) (1,57) (2,62) (6,48) (4,54) (5,03) (5,16) (2,24) (2,35) (1,45) (1,33) (3,48) (4,11) (4,22) a a a a NaCl 4,29 2,29 4,91 4,46 3,91 3,52 3,45 2,78 5,79 6,42 8,24 6,52 7,12 3,21 2,49 2,54 2,09 6,16 5,34 5,80 (3,07) (1,77) (5,33) (3,19) (2,58) (2,67) (1,80) (2,13) (4,46) (3,84) (5,33) (4,72) (6,41) (1,94) (1,98) (1,79) (1,52) (4,75) (3,77) (5,64) b1 b1 b1 b1 K 4,50 2,81 6,34 3,73 4,48 3,51 6,01 1,88 7,44 4,66 6,65 7,43 4,49 2,63 2,58 3,85 2,04 5,07 6,87 4,07 (3,36) (2,89) (4,31) (2,65) (3,22) (2,51) (6,16) (1,22) (4,11) (3,74) (3,15) (5,33) (2,62) (1,95) (1,86) (4,87) (1,41) (2,88) (5,58) (2,39) b2 b2 b2 b2 51 51 Udział subpopulacji limfocytów w grudkach chłonnych jelit ślepych w 3 dniu po pierwszej immunizacji 70 Procentowy udział komórek 60 50 40 30 20 10 0 Hsp60 NaCl CD3+ K Hsp60 NaCl CD4+ K Hsp60 NaCl CD8+ K Hsp60 NaCl K Hsp60 NaCl TCRαβ+ Bu1+ K Hsp60 NaCl K TCRγδ+ Ryc. 6. Kształtowanie się odsetka subpopulacji limfocytów T i B w grudkach chłonnych jelit ślepych w 3 dniu po pierwszej immunizacji 52 52 Udział subpopulacji limfocytów w grudkach chłonnych jelit ślepych w 3 dniu po drugiej immunizacji 70 Procentowy udział komórek 60 50 40 30 20 10 0 Hsp60 NaCl CD3+ K Hsp60 NaCl CD4+ K Hsp60 NaCl CD8+ K Hsp60 NaCl K Hsp60 NaCl TCRαβ+ Bu1+ K Hsp60 NaCl K TCRγδ+ Ryc. 7. Kształtowanie się odsetka subpopulacji limfocytów T i B w grudkach chłonnych jelit ślepych w 3 dniu po drugiej immunizacji 53 53 Udział subpopulacji limfocytów we krwi w 3 dni po pierwszej immunizacji 70 60 Procentowy udział komórek 50 40 30 20 10 0 Hsp60 NaCl CD3+ K Hsp60 NaCl CD4+ K Hsp60 NaCl CD8+ K Hsp60 NaCl K Hsp60 NaCl TCRαβ+ Bu1+ Ryc. 8. Udział subpopulacji limfocytów T i B w krwi obwodowej w 3 dniu po pierwszej immunizacji 54 54 K Hsp60 NaCl TCRγδ+ K Udział subpopulacji liomfocytów we krwi w 3 dniu po drugiej immunizacji 70 60 Procentowy udział komórek 50 40 30 20 10 0 Hsp60 NaCl CD3+ K Hsp60 NaCl CD4+ K Hsp60 NaCl CD8+ K Hsp60 NaCl K Hsp60 NaCl K TCRαβ+ Bu1+ Ryc. 9. Kształtowanie się odsetka subpopulacji limfocytów T i B w krwi obwodowej w 3 dniu po drugiej immunizacji 55 55 Hsp60 NaCl TCRγδ+ K 4.3.3. Wyniki testu transformacji blastycznej (MTT) Test MTT miał na celu określenie wpływu antygenu Hsp60 na komórki układu odpornościowego kurcząt (Con A - C1 – VICK (ATCC). Analizę statystyczną wykonano za pomocą testu Kruskalla-Wallisa, a wyniki (wartości absorbancji) przedstawiono w postaci średniej i odchylenia standardowego (p<0,001) na ryc.10, 11, i 12 oraz w tab. 13, 14 i 15. ConA w stężeniu 2,5 µg/ml powoduje zahamowanie proliferacji w stosunku do kontroli bez mitogenu (0,16 w stosunku do 0,4), natomiast dodanie białka Hsp60 S. Enteritidis w dawkach 10 µg/ml, 30 µg/ml oraz 50 µg/ml dodatkowo obniża wartości odczytu (odpowiednio 0,13, 0,10, 0,09) – tab. 13 oraz ryc. 10. Podobnie sytuacja się przedstawia w pozostałych stężeniach mitogenu (5 µg/ml i 7,5 µg/ml). W każdym przypadku zanotowano najniższe wartości absorbancji dla każdej dawki białka (odpowiednio 0,1, 0,07, 0,07 oraz 0,11, 0,08, 0,08) – tab. 14 i tab. 15 oraz ryc. 11 i ryc. 12. Wszystkie wyniki wykazują istotność statystyczną różnicę w odniesieniu do kontroli i pozostają na poziomie p<0,001. LPS w stężeniu 100 ng/ml w sposób nieistotny statystycznie zmniejsza absorbancję w stosunku do kontroli bez mitogenu (0,38 w stosunku do 0,4), natomiast dodanie białka Hsp60 w dawkach 10 µg/ml, 30 µg/ml oraz 50 µg/ml dodatkowo obniża wartość odczytu (odpowiednio 0,40, 0,33, 0,33) – tab. 13 oraz ryc. 10. Podobnie sytuacja przedstawia się w przypadku pozostałych stężeń LPSu (1 µg/ml i 10 µg/ml). W każdym z przypadków zanotowano mniejsze wartości w każdej z dawek białka (odpowiednio 0,35, 0,32, 0,34 oraz 0,37, 0,35, 0,37). – tab. 14 i tab. 15 oraz ryc. 11 i ryc. 12. Wynik jednak nie jest istotny statystycznie w stosunku do kontroli. 56 Wpływ mitogenów (ConA 2,5 μg/ml, LPS 100 ng/ml) oraz białka Hsp60 na proliferację linii komórkowej ConA-C1-VICK Ryc. 10. Wpływ wybranych stężeń mitogenów oraz białka Hsp60 na proliferację linii komórkowej Con A - C1 – VICK kurcząt 57 57 Wpływ mitogenów (ConA 5 μg/ml, LPS 10 μg/ml) oraz białka Hsp60 na proliferację linii komórkowej ConA-C1-VICK Ryc. 11. Wpływ wybranych stężeń mitogenów oraz białka Hsp60 na proliferację linii komórkowej Con A - C1 – VICK kurcząt 58 58 Wpływ mitogenów (ConA 7,5 μg/ml, LPS 1 μg/ml) oraz białka Hsp60 na proliferację linii komórkowej ConA-C1-VICK Ryc. 12. Wpływ wybranych stężeń mitogenów oraz białka Hsp60 na proliferację linii komórkowej Con A - C1 – VICK kurcząt 59 59 Tab. 13. Wpływ wybranych stężeń mitogenów (ConA 2,5 µg/ml; LPS 100 ng/ml) oraz białka Hsp60 na proliferację linii komórkowej Con A C1 – VICK kurcząt Grupa Średnia SD ConA (2,5 µg/ml) ConA (2,5 µg/ml ) + Hsp60 10 µg/ml 0,16 0,04 0,13 0,03 ConA ConA (2,5 µg/ml ) (2,5 µg/ml ) + Hsp60 + Hsp60 30 µg/ml 50 µg/ml 0,10 0,02 0,09* 0,02 Kontrola LPS (100 ng/ml) LPS (100 ng/ml) + Hsp60 10 µg/ml LPS (100 ng/ml) + Hsp60 30 µg/ml LPS (100 ng/ml) + Hsp60 50 µg/ml 0,40 0,06 0,38 0,11 0,40 0,06 0,33 0,06 0,33 0,06 Tab. 14. Wpływ wybranych stężeń mitogenów (ConA 5 µg/ml; LPS 1 µg/ml) oraz białka Hsp60 na proliferację linii komórkowej Con A - C1 – VICK kurcząt Grupa Średnia SD ConA (5 µg/ml) ConA (5 µg/ml) + Hsp60 10 µg/ml ConA (5 µg/ml) + Hsp60 30 µg/ml ConA (5 µg/ml) + Hsp60 50 µg/ml 0,12 0,03 0,10 0,02 0,07* 0,01 0,07* 0,02 Kontrola LPS (1 µg/ml) LPS (1 µg/ml) + Hsp60 10 µg/ml 0,40 0,06 0,40 0,13 0,37 0,06 60 60 LPS (1 µg/ml) + Hsp60 30 µg/ml LPS (1 µg/ml) + Hsp60 50 µg/ml 0,35 0,07 0,37 0,04 Tab. 15. Wpływ wybranych stężeń mitogenów (ConA 7,5 µg/ml; LPS 10 µg/ml) oraz białka Hsp60 na proliferację linii komórkowej Con A - C1 – VICK kurcząt . Grupa Średnia SD ConA (7,5 µg/ml) ConA (7,5 µg/ml) + Hsp60 10 µg/ml ConA (7,5 µg/ml) + Hsp60 30 µg/ml ConA (7,5 µg/ml) + Hsp60 50 µg/ml 0,14 0,03 0,11 0,02 0,08* 0,01 0,08* 0,02 Kontrola LPS (10 µg/ml) LPS (10 µg/ml) + Hsp60 10 µg/ml LPS (10 µg/ml) + Hsp60 30 µg/ml LPS (10 µg/ml) + Hsp60 50 µg/ml 0,40 0,06 0,37 0,14 0,35 0,08 0,32 0,06 0,34 0,08 61 61 4.4. Protekcyjna rola białka Hsp60 S. Enteritidis 4.4.1. Wyniki zakażenia eksperymentalnego kurcząt szczepem Salmonella Enteritidis We wszystkich przypadkach w analizie statystycznej (test Chi^2 oraz test Fishera) stwierdzono istotną różnicę pomiędzy grupą zakażoną, a grupami kontrolnymi (p<0,0001), co przedstawiono w tab. 16 i 17. Tab. 16. Częstotliwość izolacji pałeczek Salmonella Enteritidis z wymazów z kloaki (* wyniki istotne statystycznie p<0,0001) d.p.z 1 2 3 7 14 21 28 Hsp60 0/9* 2/9* 2/9* 2/9* 2/9* 1/9* 1/9* NaCl 2/9 9/9 9/9 9/9 9/9 9/9 9/9 K 0/9 0/9 0/9 0/9 0/9 0/9 0/9 Tab. 17. Częstotliwość izolacji pałeczek Salmonella Enteritidis z narządów wewnętrznych w 28 d.p.z. (* wyniki istotne statystycznie p<0,0001) Narządy wycinek z jelita wątroba śledziona Hsp60 1/9* 1/9* 1/9* NaCl 9/9 9/9 9/9 K 0/9 0/9 0/9 cienkiego Po zakażeniu doświadczalnym u kurcząt immunizowanych 2. krotnie preparatem białkowym Hsp60 S. Enteritidis w dawce 50 µg/ml w pierwszym dniu po zakażeniu nie izolowano pałeczek Salmonella z wymazów kałowych. Pałeczki Salmonella stwierdzono w kolejnych pobraniach prób (od 2 do 13 dnia po zakażeniu) tylko w 2 (na 9) wymazach, zaś w 21 i 28 dniu tylko w 1 wymazie. Podobnie z narządów wewnętrznych (wątroba, śledziona, wycinek z jelita cienkiego) 1 ptaka wyizolowano 62 pałeczkę Salmonella. W omawianych terminach w grupie zakażonej i nieimmunizowanej zarówno próby pobrane z wymazów kałowych, jak też wycinki narządów wewnętrznych były pozytywne pod względem obecności pałeczek Salmonella. Od ptaków z grupy kontrolnej (K) nie były izolowane pałeczki Salmonella w trakcie trwania doświadczenia. 63 5. DYSKUSJA Jedną z częstszych przyczyn zakażeń bakteryjnych u ludzi są pałeczki z rodzaju Salmonella, w tym Salmonella Enteritidis. Patogeneza oraz źródła zakażeń zostały opisane w rozdziale 1. U drobiu w wyniku zakażenia na tle S. Enteritidis dochodzi do dużych strat ekonomicznych, dlatego wprowadzono programy monitoringowe, mające na celu ograniczenie/wyeliminowanie zakażeń i/lub choroby w stadach. Poznanie mechanizmu patogenezy pałeczek z rodzaju Salmonella, w tym wnikanie pałeczek do nabłonka jelit, stało się przyczynkiem do wielu badań eksperymentalnych. Wśród istotnych czynników wirulentnych pałeczek Salmonella wyróżnia się fimbrie. Badania przeprowadzone przez Tanaka i wsp. (1981) zwracają szczególną uwagę na fimbrie typu 1. To one odpowiadają za adhezję pałeczek do nabłonka jelita gospodarza, co ułatwia im zasiedlanie się oraz utrudnia gospodarzowi ich usunięcie w wyniku ruchów perystaltycznych jelit. Fimbrie składają się z białek takich jak fimbryny i adhezyny. Głównym czynnikiem biorącym udział w przyleganiu S. Enteritidis do enterocytów jest adhezyna FimH. W wyniku badań przeprowadzonych przez Kisiela i wsp. (2005) wykazano, że adhezyna ta znajduje się na szczycie fimbrii typu 1 i w przypadku kurzych enterocytów wiąże się ona z glikoproteiną o masie zbliżonej do 120 kDa (Kisiela i wsp. 2006). Istotne znaczenie w procesie adhezji pałeczek S. Enteritidis do komórek błony ziarnistej pęcherzyków jajnikowych mają fimbrie SEF14 zbudowane głównie z fimbryny SefA. Kuczkowski (2003) w przeprowadzonych badaniach wykazał, że immunizacja kurcząt rekombinowanym białkiem SefA wywołuje reakcję ze strony odpowiedzi humoralnej u immunizowanych kur niosek oraz powoduje wzrost odsetka populacji limfocytów CD4+, a także przyczynia się do szybszej eliminacji szczepu S. Enteritidis z narządów wewnętrznych. W celu wyeliminowania przypadków zachorowalności/nosicielstwa pałeczek Salmonella stały się powszechne szczepienia ochronne drobiu przeciwko salmonellozie. Początkowo stosowane szczepionki były oparte o pełne komórki bakteryjne (szczepy żywe/atenuowane), co prowadziło do licznych efektów ubocznych, a te z kolei mogły prowadzić do alergii lub objawów toksycznych, ponadto do rewersji szczepu szczepionkowego do szczepu dzikiego. Wraz z rozwojem badań zaczęto zwracać uwagę na fragmenty komórek bakteryjnych, które zawierały specyficzny dla nich antygen. Przykładami takich antygenów mogą być 64 białka znajdujące się w błonie komórkowej bakterii (LPS, OMP) oraz białka wewnątrzkomórkowe, takie jak białka szoku cieplnego (HSP). To właśnie białka szoku cieplnego zwróciły szczególną uwagę, nie tylko ze względu na dużą konserwatywność w budowie lecz również ze względu na ich wysoką immunogenność. Możliwość stosowania białek szoku cieplnego w celu wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej oraz ich potencjalnie protekcyjnej roli w stosunku do zakażeń bakteriami Gram-ujemnymi, stały się inspiracją do przeprowadzonych w niniejszej rozprawie badań. W pracy doktorskiej wykorzystano metodę produkcji rekombinowanego białka Hsp60 opracowaną w wyniku wcześniejszych badań własnych. Dodatkowo wyniki badań optymalizacji produkcji rekombinowanego białka Hsp60 S. Enteritidis zostały potwierdzone przez Rainczak i wsp. (2010). Badania własne, których celem było wyprodukowanie rekombinowanego białka Hsp60 S. Enteritidis pozwoliły ustalić, że enzymami restrykcyjnymi umożliwiającymi uzyskanie produktu o wielkości 1700 pz są NcoI oraz XhoI. W procesie klonowania zastosowano wektor pET22b+, a uzyskany konstrukt wklonowano do komórek kompetentnych E. coli BL21 (C41). Są to komórki kompetentne, w których dochodzi do efektywnej ekspresji białek zarówno błonowych jak i wewnątrzkomórkowych w przypadku wszystkich organizmów. Dodatkowo komórki te wykazują wysoką efektywność w procesie autoindukcji, co zostało opisane przez Studier (2005) ponadto cały proces autoindukcji, który posłużył do ekspresji białka. Białko zostało oczyszczone za pomocą złożą Ni 2+NTA w warunkach denaturacyjnych, a następnie poddano dializie w PBSie z dodatkiem 10% glukozy. W wyniku optymalizacji warunków produkcji rekombinowanego białka, efektywność zastosowanej metody pozwoliła na uzyskanie 0,47 µg/ml czystego białka. Dostępne dane literaturowe prezentowane przez Sinha i Bhatnagar (2010) przedstawiają proces produkcji rekombinowanego białka Hsp60 pochodzącego z Bacillus anthracis (szczep 34F2). Do amplifikacji genu odpowiedzialnego za kodowanie białka Hsp60 użyto primerów, a w wyniku ich działania uzyskano produkt o wielkości 1635 pz, który został poddany analizie restrykcyjnej enzymami BamHI/HindIII. Wektorem zastosowanym w procesie klonowania był wektor pET28a. Uzyskany konstrukt wklonowano do komórek kompetentnych E. coli DH5α. Proces ekspresji białka polegał na klasycznej metodzie z zastosowaniem IPTG (syntetyczna laktoza). Białko zostało oczyszczone za pomocą złoża NiNTA w 65 warunkach natywnych, a następnie dializowane w PBS z dodatkiem 10% glicerolu. Inną metodę uzyskania rekombinowanego białka Hsp60 przedstawia Plant i wsp. (2009), mianowicie uzyskany gen kodujący białko został wyizolowany z Flavobacterium psychrophilum i bez analizy restrykcyjnej wklonowany do wektora pET102/D/TOPO, który umożliwia bezpośrednie klonowanie, z pominięciem etapu trawienia enzymami. Komórkami kompetentnymi użytymi w doświadczeniu były komórki E. coli BL21 Star (DE3). Zarówno proces ekspresji jak i oczyszczania białka był taki sam jak w przypadku Sinha i Bhatnagar (2010). Z kolei w celu uzyskania rekombinowanego białka Hsp60 z Salmonella enterica serowar Typhi (szczep MTCC 733) Paliwal i wsp. (2008) zastosowali taką samą parę enzymów jak Sinha i Bhatnagar (2010) uzyskując produkt o wielkości 1646 pz. Produkt wklonowano do wektora pQE30, a następnie wtransformowano do komórek E. coli BL21 DH5α. Ekspresja białka i sposób oczyszczania nie różnił się od przedstawionego powyżej. Uzyskane białko poddano działaniu filtracji na kolumnach amicon. W przypadku produkcji rekombinowanego białka Hsp60 z Salmonella typhi (szczepTy2) Bansal i wsp. (2009) wykorzystali wektor pQE 30 oraz komórki kompetentne E. coli BL21 (DE3), brak jest natomiast informacji odnośnie warunków analizy restrykcyjnej. Metoda ekspresji i oczyszczania białka była taka sama jak w badaniach wyżej wymienionych autorów. Produkcję rHsp60 z Paracoccidioides brasiliensis przedstawia de Bastos Ascenco Soares i wsp. (2008). Uzyskany gen poddano trawieniu enzymami NdcI oraz BglII, a uzyskany produkt wklonowano do wektora pET19b. Konstrukt został wtransformowany do komórek kompetentnych E. coli BL21 (DE3). W celu ekspresji białka zastosowano metodę autoindukcji, natomiast białko oczyszczono w warunkach denaturacyjnych (z zastosowaniem 4M mocznika) na złożu Ni 2+Sepharosa. Dializę przeprowadzono w buforze Tris-NaCl z dodatkiem mocznika. Badania nad pozyskiwaniem antygenu o masie cząsteczkowej 60kDa bez zastosowań technik biologii molekularnej przeprowadziła Dera–Tomaszewska i wsp. (2002). Metoda ta opierało się na szokowaniu kultur bakteryjnych S. Enteritidis za pomocą podwyższonej temperatury (24 h w temp. 37˚C, następnie 30 min w temp. 50˚C). Kolejnym krokiem było zwirowanie hodowli, a uzyskany pellet poddano lizie i rozbito ultradźwiękami/zsonikowano. Uzyskany, w wyniku wirowania, pellet dializowano w wodzie destylowanej i odwirowano. Osad oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa na złożu 4B Sepharose. Powstały w ten sposób 66 antygen posłużył do określenia obecności swoistych przeciwciał anty-Hsp60 w żółtku jaja kur zakażonych S. Enteritidis. Wykazane miana przeciwciał były wyższe w porównaniu do grupy kontrolnej. Badania własne nad proliferacją blastyczną limfocytów T linii komórkowej ConA-C1-VICK wykazały toksyczny wpływ białka Hsp60 na wzrost komórek. Linia komórkowa wykorzystana do doświadczenia to limfocyty T wyizolowane ze śledziony kurcząt, wcześniej zakażonych pałeczką S. Enteritidis, które były hodowane w obecności ConA. Jest to jedyna dostępna na rynku linia komórkowa pochodząca od gatunku Gallus gallus, która została wyizolowana od ptaków wcześniej zakażonych pałeczką S. Enteritidis. Test proliferacji blastycznej, wykonany na tej linii komórkowej, był testem wysoce pionierskim, a brak danych literaturowych na temat podobnych badań nie pozwala na porównanie wyników. Jednakże uzyskane rezultaty świadczą o hamującym wpływie ConA na proliferację limfocytów, a sygnał hamowania dodatkowo został wzmocniony w wyniku dodania rekombinowanego białka Hsp60. Również w wyniku działania na linię komórkową użytym mitogenem (LPS) doszło do zahamowania proliferacji komórek, jednak sygnał ten był znacznie słabszy niż w poprzednim przykładzie. Dodatkowo inkubacja komórek z antygenem Hsp60 wzmocniła sygnał hamowania proliferacji blastycznej. Prawdopodobnie wcześniejsza inkubacja linii komórkowej z mitogenem jakim jest ConA spowodowała brak reakcji na zastosowane w doświadczeniu substancje. Zarówno ConA i LPS są wysoce stymulującymi czynnikami proliferacji limfocytów T, co było głównym założeniem przeprowadzonego eksperymentu Istnieją udokumentowane cytowania, które dowodzą, że za wzrost aktywności przeciwciał, w wyniku podania rHsp60, może odpowiadać LPS. Kol i wsp (1998) uzyskali rHsp60 pochodzące z Chlamydia pneumoniae oraz ludzkie rekombinowane białko Hsp60 (hrHsp60) metodą nadekspresji w komórkach E. coli. W wyniku takiej produkcji białek, dochodzi często do powstania zanieczyszczeń LPSem pochodzącym z komórek kompetentnych. LPS jest silnym mitogenem i aktywuje komórki wykorzystując ten sam receptor co białko Hsp60. Badania przeprowadzone przez Kol i wsp. (1998) miały na celu potwierdzenie udziału LPSu w produkcji przeciwciał, zarówno białka Hsp60 jak i LPS, poddano działaniu wysokiej temperatury (lipopolisacharyd jest termostabilny, natomiast większość białek ulega denaturacji w wyniku działania wyższą temperaturą). W wyniku przeprowadzonego doświadczenia potwierdzono, że LPS nie odgrywa istotnej roli we zbudzaniu 67 komórek plazmatycznych. Rola zanieczyszczenia rekombinowanego białka Hsp60, pochodzącym z komórek kompetentnych lipopolisacharydem, do tej pory niesie ze sobą wiele kontrowersji oraz sprzecznych doniesień. Wyniki badań przeprowadzonych przez Gao i Tsan (2003) na liniach komórkowych makrofagów dowidzą, że za produkcję TNF-α odpowiada LPS. W tym celu, uzyskane rekombinowane ludzkie białko Hsp60 (o początkowym zanieczyszczeniu LPSem wynoszącym 22 EU/mg), oczyszczono z LPSu, w wyniku czego ograniczono zanieczyszczenie LPSem do 1,6 EU/mg. Inkubacja makrofagów linii RAW 264.7 w obecności LPSu i białka o wysokim stopniu zanieczyszczenia LPSem, wykazały indukcję uwalniania TNF-α, podczas, gdy w przypadku białka o małym stopniu zanieczyszczenia nie dochodziło do wzbudzenia TNF-α. Natomiast autorzy nie zaobserwowali różnicy w stopniu wzbudzenia aktywacji INF-γ pomiędzy hrHsp60 o wysokim i niskim stopniu zanieczyszczenia lipopolisacharydem. Zarówno w przypadku zastosowania zanieczyszczonego białka jak i wcześniej oczyszczonego z LPSu dochodziło do takiego samego pobudzenia produkcji INF-γ przez makrofagi. Dla porównania zastosowanie samego LPSu nie wzbudzało tej reakcji. Należy zwrócić uwagę, iż większość badań mających na celu wyjaśnienie immunogennej oraz protekcyjnej roli białka Hsp60 zostało przeprowadzonych na myszach. Bansal i wsp. (2009) do swoich badań użyli myszy szczepu BALB/c, które były immunizowane rekombinowanym białkiem Hsp60 S. typhi w 0., 7. i 28. dniu doświadczenia. Do immunizacji użyto białka w połączeniu z adjuwantem Freunda (CFA), z aluminium oraz samego białka. W 7 dniu po ostatniej immunizacji wykazano wzrost aktywności przeciwciał w surowicy we wszystkich immunizowanych grupach w stosunku do grupy kontrolnej. Najwyższy wzrost aktywności przeciwciał zanotowano w grupie immunizowanej białkiem Hsp60+CFA (wykazano istotność statystyczną). Badania proliferacji limfocytów wskazały, że podany antygen stymuluje komórki do wzrostu, co odnotowano jako istotny statystycznie wzrost proliferacji limfocytów. Najwyższy wzrost wykazano w przypadku grupy immunizowanej samym białkiem jak i białkiem z CFA. Okazało się również, że grupa immunizowana białkiem wykazuje wzrost produkcji takich interleukin jak IFN-γ oraz IL-2 i IL-4. W grupie immunizowanej samym białkiem oraz białkiem w połączeniu z CFA, autorzy odnotowali wyższy poziom produkcji interleukin IFN-γ oraz IL-2 w porównaniu do grupy immunizowanej białkiem w połączeniu z aluminium. Natomiast grupa myszy immunizowana samym rHsp60 68 wykazała wyższy poziom interleukiny IL-4 w stosunku do pozostałych grup. Eksperymentalne zakażenie myszy szczepem S. Typhi wykazało największą przeżywalność (80%) w grupie myszy immunizowanych białkiem Hsp60 +CFA, nieco niższy (70%) w grupie myszy immunizowanych samym białkiem Hsp60, i na poziomie (50%) w grupie myszy immunizowanych białkiem Hsp60 + aluminium. Z kolei badania przeprowadzone przez de Bastos Ascenco Soares i wsp. (2008) na takim samym modelu (myszy szczepu BALB/c) wykazały, że u zwierząt immunizowanych rekombinowanym białkiem Hsp60 P. brasiliensis dochodzi do wzrostu produkcji IL-12 oraz IFN-γ. Największy wzrost IFN-γ oraz IL-12 zanotowano w 7 dniu po drugiej immunizacji. Natomiast Lehnardt i wsp. (2008) badali wpływ białka Hsp60 na komórki centralnego układu nerwowego myszy szczepu BALB/c. W swoich badaniach wykazali, że białko stymuluje komórki neuronalne, wykorzystując do tego receptory TLR4, przyczyniając się nawet do pięciokrotnego ich wzrostu w stosunku do grupy kontrolnej. Z kolei Sinha i Bhatnagar (2010) wykazali, że myszy BLAB/c immunizowane 3-krotnie rekombinowanym białkiem Hsp60 B. anthracis, wykazują wzrost miana przeciwciał IgG w wyniku eksperymentalnego zakażenia myszy. Do zakażenia dochodziło w 2 tyg. po ostatniej immunizacji, która przypadała w 4 tyg. życia myszy. Dodatkowo wykazano istotny wzrost interleukin IL-2 oraz IFN-γ u myszy immunizowanych białkiem. Zanotowano również wzrost interleukiny IL-4. Badania wykonane na myszach szczepy C57BL/6J przeprowadzili Peetermans i wsp. (1995). Wykazali oni, że makrofagi inkubowane w obecności rekombinowanego białka Hsp60 produkują TNF-α, czego nie potwierdzono w grupie kontrolnej inkubowanej z ovoalbuminą oraz wzrost interleukin INF-γ w wyniku stymulacji komórek białkiem szoku cieplnego. Vabulas i wsp. (2001) w badaniach na myszach szczepu BMDDC i wykazali, że hrHsp60 stymuluje makrofagi linii RAW264.7 i uwalnia klasyczną kaskadę sygnału poprzez aktywację TLR2 i TLR4. Wszystkie przedstawione powyżej wyniki badań innych autorów opisują mechanizm działania rekombinowanego białka Hsp60 zarówno na linie komórkowe mysie jak i na ich organizm. Natomiast do tej pory wpływ białka Hsp60 na komórki układu odpornościowego zwierząt z gatunku Gallus gallus nie został jeszcze dokładnie opisany. Wiele uwagi natomiast poświęca się badaniom, których celem jest poznanie odpowiedzi ze strony komórek układu immunologicznego w następstwie zakażeń 69 pałeczką S. Enteritidis. Uzyskane wyniki badań własnych w zakresie oceny wartości protekcyjnej białka Hsp60 S. Enteritidis, u kurcząt immunizowanych a następnie zakażonych eksperymentalnie, wskazują na możliwość jego zastosowania w przyszłości do konstrukcji np. szczepionek podjednostkowych przeciwko salmonellozie ptaków. Badania własne wykazały, że w wyniku 2-krotenj immunizacji kurcząt rHsp60 S. Enteritidis dochodzi do zwiększonej aktywności przeciwciał. Istotny wzrost aktywności zaobserwowano już w 3 dniu po pierwszej immunizacji jak i w jej 8. dniu. Natomiast w wyniku drugiej immunizacji, która miała miejsce 2 tyg. po pierwszej, odnotowano zwiększoną intensywność przeciwciał w 6. i 13 dniu. Wartą uwagi jest sytuacja zaobserwowana w grupie, której podano placebo (0,9% NaCl). Tam również dochodzi do niewielkiego wzrostu aktywności przeciwciał, o czym może świadczyć fakt, że sam czynnik iniekcji w słabym stopniu pobudza plazmocyty do produkcji przeciwciał. W wyniku przeprowadzonych badań własnych wykazano, że 2 krotna immunizacja białkiem Hsp60 S. Enteritidis, u kurcząt powoduje istotny statystycznie wzrost odsetka subpopulacji limfocytów w grudkach chłonnych jelit ślepych: CD3+ i CD4+ w 2 i 3 dniu po pierwszej immunizacji oraz odpowiednio w 3 oraz w 2 i 3 dniu po drugiej immunizacji, CD8+ w 3 i 13 dniu po pierwszej immunizacji, a Bu1+ w 2 dniu po pierwszej immunizacji w stosunku do obu grup kontrolnych. W badaniach przeprowadzonych przez Berndt i wsp. (2007) wykazano wzrost granulocytów i makrofagów w pierwszym dniu po zakażeniu, komórek TCRαβ+, TCRγδ+, CD8+ oraz CD4+ w 2 dniu po zakażeniu. We krwi natomiast wzrost subpopulacji limfocytów TCRαβ+ oraz TCRγδ+ zanotowano w 4 dniu po zakażeniu. Natomiast Carvajal i wsp. (2008) wskazują na zasiedlenie pałeczek S. Enteritidis, w wyniku zakażenia 56 dniowych kurcząt, w 2 dniu po zakażeniu w przypadku wątroby oraz już w 6 godzinie po zakażeniu w przypadku jelit. Natomiast w 4 i 9 dniu po zakażeniu zaobserwowano wzrost subpopulacji komórek CD8+TCRαβ+ a w 1 dniu po zakażeniu CD4+. Interakcja pomiędzy patogenem S. Enteritidis, a mechanizmem obronnym gospodarza polega na stymulacji układu immunologicznego. Pierwotna odpowiedź mająca na celu mobilizację pierwszej linii obrony (m.in. makrofagów) ma za zadanie eliminację pałeczek Salmonella z organizmu, co zostało wykazane na podstawie badań przeprowadzonych przez Arnold i wsp. (1993), Lee i wsp. (1981), Lillehoy i wsp. (1991) oraz Shat (1994). Natomiast w wyniku badań, w których modelem były 70 makrofagi mysie, Berndt i wsp. (2007) zaobserwowali, że główną rolę w tym etapie odgrywają limfocyty TCRαβ+CD4+. W badaniach własnych przeprowadzonych na subpopulacji limfocytów TCRαβ+ we krwi obwodowej u kurcząt eksperymentalnie immunizowanych białkiem Hsp60 S. Enteritidis, wykazały ich istotny statystycznie wzrost w 8 dniu po pierwszej immunizacji. W badaniach przeprowadzony na ludzkich liniach komórkowych nabłonka, mięśni gładkich oraz linii komórkowej makrofagów, Kol i wsp. (1998) wykazali, że stymulacja zarówno ludzkim Hsp60 jak i białkiem pochodzącym z Ch. pneumoniae prowadzi do indukcji pozapalnej interleukiny IL-6 we wszystkich użytych do badań komórkach. Natomiast białko hrHsp60 stymuluje makrofagi (ludzka linia komórkowa RAW264.7) i aktywuje kinazę białkową JNK1/2, co jest równorzędne z produkcją TNF-α. Dodatkowo, Aderem i Ulevitch (2000) oraz Hemmi (2000) udowodnili, że zarówno ludzkie i pochodzące od Ch. pneumoniae rekombinowane białko Hsp60 aktywuje I-ĸb kinazę (IKK) oraz ERK1/2 w taki sam sposób jak LPS oraz CpG-DNA. Pozwoliło to ustalić, że białko Hsp60 jest rozpoznawane przez receptory TLR (Toll-like receptors) 4, 2 i 9. W badaniach własnych w wyniku 2-krotnej immunizacji (w 2 tyg. i w 6 tyg. życia kurcząt) rekombinowanym białkiem Hsp60 wykazano ochronne działanie zastosowanego antygenu (zarówno w wątrobie, śledzionie jak i w wycinku z jelita ślepego wyizolowano pałeczkę S. Enteritidis tylko od jednego ptaka na 9 badanych). Także wyniki mikrobiologiczne, uzyskane poprzez wymazy z kloaki, wskazują na redukcję pałeczek S. Enteritidis w treści jelit (w trakcie trwania doświadczenia wyizolowano pałeczki tylko od 2 osobników, co stanowi 22,2%) w stosunku do grupy kontrolnej, gdzie Salmonella była izolowana od wszystkich osobników (100,0%). Dane te wskazują na redukcję stopnia zakażenia w wyniku challengu, a co za tym idzie na protekcyjną wartość zastosowanego rekombinowanego białka Hsp60. Wcześniej przytoczone badania przeprowadzone przez Bansal i wsp. (2009) pokazały, że największą protekcję poprzez eksperymentalne zakażenie myszy wykazało rHsp60 + CFA. Analizując powyższe doniesienia w badaniach własnych również zastosowano taki sam adjuwant. Podobne rezultaty w zakresie efektywności ochronnej wykazał Kuczkowski (2003) stosując do immunizacji kurcząt białko SefA pochodzące z S. Enteritidis. Autor wykazał, że u kur immunizowanych w 7. i 13. tyg. życia białkiem SefA, zarówno z 71 wątroby, śledziony i jelita ślepego, izolowano pałeczki Salmonella w trakcie trwania doświadczenia (14 dzień po zakażeniu). Wyniki przedstawione w niniejszej pracy doktorskiej, wskazują na interakcję pomiędzy rekombinowanym białkiem Hsp60 S. Enteritidis, a odpowiedzią humoralną i komórkową ze strony organizmu kurcząt. Poprzez immunizację dochodzi do wzrostu poziomu specyficznych przeciwciał anty-Hsp60, co w wyniku eksperymentalnego zakażenia zapewniało statystycznie istotną protekcyjność w stosunku do pałeczek S. Enteritidis. Również wzrost odsetka subpopulacji limfocytów T oraz B zarówno we krwi obwodowej jak i w grudkach chłonnych jelit ślepych kurcząt, wskazuje na mobilizację odpowiedzi komórkowej. Dodatkowo, potwierdzone przez innych autorów właściwości rekombinowanego białka Hsp60 pozwalają sugerować, że może ono stanowić składnik szczepionek podjednostkowych stosowanych w przemyśle farmaceutycznym w celu zapewnienia protekcji w stosunku do zakażeń na tle S. Enteritidis. 72 6. WNIOSKI 1. W wyniku optymalizacji produkcji rekombinowanego białka Hsp60 S. Enteritidis uzyskano oczyszczony antygen. 2. Immunizacja kurcząt rekombinowanym białkiem Hsp60 S. Enteritidis prowadzi do wzbudzenia odpowiedzi humoralnej, co potwierdzono obecnością specyficznych przeciwciał anty-Hsp60 S. Enteritidis. 3. W wyniku immunizacji preparatem białkowym Hsp60 S. Enteritidis dochodzi do zwiększenia odsetka subpopulacji limfocytów CD3+, CD4+ CD8+ oraz Bu1+ zarówno we krwi jak i w grudkach chłonnych jelit ślepych. 4. Białko Hsp60 wykazuje toksyczny wpływ na komórki linii ConA-C1-VICK (Gallus galus). 5. Immunizacja kurcząt rekombinowanym białkiem Hsp60 powoduje szybszą eliminację szczepu S. Enteritidis z narządów wewnętrznych po zakażeniu eksperymentalnym w porównaniu do grupy nieimmunizowanej. 73 7. STRESZCZENIE Salmonellozy drobiu stanowią bardzo istotny problem zarówno ekonomiczny jak i epidemiologiczny. Obecnie w praktyce celem eliminacji stad drobiu zakażonych pałeczkami S. Enteritidis stosuje się programy monitoringowe (badania środowiskowe oraz badania po uboju) oraz wprowadzono szczepienia ochronne. Zasadniczym celem badań była ocena immunogenności rekombinowanego białka Hsp60 S. Enteritidis u kurcząt w aspekcie zabezpieczenia przed salmonellozą Wymienione zadanie realizowano poprzez: produkcję rekombinowanego białka Hsp60 S. Enteritidis, określenie wpływu białka Hsp60 S. Enteritidis na komórki układu immunologicznego kurcząt, określenie jego wpływu na linię komórkową ConA-C1-VICK oraz określenie protekcyjnej roli w wyniku eksperymentalnego zakażenia kurcząt. W wyniku badań własnych wykazano reakcję w zakresie odpowiedzi humoralnej w wyniku immunizacji rHsp60 S. Enteritidis. Immunogenność antygenu została wykazana na podstawie miana specyficznych przeciwciał anty-Hsp60 S. Enteritidis w surowicy immunizowanych kurcząt. W badaniach cytometrycznych określono odsetek subpopulacji limfocytów T i B zarówno w krwi obwodowej jak i w grudkach chłonnych jelit ślepych. W celu określenie protekcyjności antygenu w stosunku do zakażeń Salmonella przeprowadzono eksperymentalne zakażenie ptaków (challenge). Dodatkowo zbadano wpływ białka Hsp60 na limfocyty T ze śledziony kurcząt (Gallus gallus) za pomocą testu proliferacji blastycznej. Immunizacja kurcząt białkiem Hsp60 wykazała obecność w surowicy specyficznych przeciwciał anty-Hsp60 S. Enteritidis. W wyniku immunizacji kurcząt doszło również do wzrostu odsetka subpopulacji limfocytów CD3+, CD4+ CD8+ oraz Bu1+. Natomiast dane uzyskane w teście proliferacji blastycznej wskazują na hamujący/toksyczny wpływ białka Hsp60 na limfocyty T pochodzące ze śledziony. U kurcząt immunizowanych rHsp60 S. Enteritidis stwierdzono, w porównaniu do grupy nieimmunizowanej, szybszą eliminację z narządów wewnętrznych szczepu S. Enteritidis użytego do zakażenia kontrolnego. Badania podjęte w pracy doktorskiej pozwoliły ustalić optymalne warunki produkcji rekombinowanego białka Hsp60 i wskazać na jego immunogenny 74 charakter. Ponadto informacje pozwalają sugerować, że może ono stanowić składnik szczepionek podjednostkowych stosowanych w przemyśle farmaceutycznym w celu zapewnienia protekcji w stosunku do zakażeń na tle S. Enteritidis. 75 Summary Poultry salmonellosis is a very important economic and epidemiological problem. Currently, in practice, to eliminate poultry flocks infected with S. Enteritidis monitoring programs and vaccinations are used. The primary aim of the study was to assess the immunogenicity of the recombinant protein Hsp60 of S. Enteritidis in chickens to protect them against salmonellosis. Study included: the production of recombinant protein Hsp60 S. Enteritidis, determination of effect of Hsp60 protein of S. Enteritidis on chicken immune cells, determination of effect of Hsp60 protein on the ConA-C1-VICK cells line and improve its protective role by experimental infection of chickens. The immunogenicity of the antigen has been demonstrated by statistic significant titer of specific anti-Hsp60 S. Enteritidis antibodies in serum immunized chickens. The study determined the percentage of T and B lymphocytes subpopulations in peripheral blood and in ceacal lymph follicles. In order to determine the protective role of Hsp60 protein against Salmonella infections experimental challenge of birds were performed. In addition, to determinate the influence of Hsp60 protein on T cells from the spleen of chickens (Gallus gallus) the MTT test (blast proliferation) was established. Chickens immunization with Hsp60 protein showed the presence of specific anti-Hsp60 S. Enteritidis antibodies in serum. In addition, immunization of chickens has shown the increase percentage of lymphocytes CD3+, CD4+ and CD8+ Bu1+. However, the results obtained in blast proliferation test indicate inhibitory/toxic effect of Hsp60 protein on T cells derived from the spleen. Chickens immunized with Hsp60 protein showed, in compared to not immunized group, faster elimination of S. Enteritidis strain from organs. The study allowed to establish the optimal conditions for production of recombinant Hsp60 protein and demonstrate its immunogenic character. Additionally, the obtained results allow to suggest that Hsp60 protein could be a component of subunit vaccines to provide protection against S. Enteritidis infection. 76 8. PIŚMIENNICTWO 1. Aderem A., Ulevitch R.J. „Toll-like receptors in the induction of the innate immune response”, Nature, 782-787, 2000. 2. Arnold J.W., Nielsel D.W., Annable C.R. Hess C.B., Asuncion M., Cho Y.J., Peterson J.W., Kimpel G.R. “Tumor necrosis factor-alfa mediated the early pathology in Salmonella infection of the gastrointestinal tract”, Microb. Pathog. 217-227, 1993. 3. Bansal A., Paliwal P.K., Sagi S., Sairam M. „Effect of adjuvants on immune response and protective immunity elicited by recombinant Hsp60 (GroEL) of Salmonella typhi against S. typhi infection”, Mol. Cell Biochem., 213-221, 2009. 4. Barrow P.A., Hassan J.O., Berchieri A. “Reduction of faecal excretion of Salmonella typhimurium strain F98 in chickens vaccinated with live and killed S. typhimurium organism”, Epidemiol. Infect., 413-417, 1990. 5. Benkirane R., Gottschalk M.G., Dubreuil J.D. „Identification of a Streptococcus suis 60-kDa heat-shock protein using western blotting”, FEMS Microbiol. Lett., 579-585, 1997. 6. Berndt A., Wilhelm A., Jugert C., Pieper J., Sachse K., Methner U. “Chicken Cecum Immune Response to Salmonella enterica serovars of Different Levels of Invasiveness”, Infect. Immun., 5993-6007, 2007. 7. Błaszczak B., Rzewuska M., Binek M. „Częstość zakażeń drobiu i lekooporności pałeczek Salmonella”, Medycyna Wet., 392-397, 1996. 8. Carvajal B.G., Methner U., Pieper J., Berndt A. “Effects of Salmonella enterica serovar Enteritidis on cellular recruitment and cytokine gene expression in caecum of vaccinated chickens”, Vaccine, 5423-5433, 2008. 9. Chen W., Syldath U., Bellmann K., Burkart V., Kolb H. „Human 60-kDa Heat –Shock Protein: Danger Signal to the Innate Immune System”, The J. of Immunol., 3212-3219, 1999. 10. Cheng X.B., Chen T.M., Ma X.K., Huang C.F. „Cloning and expression of heat-labile enterotoxin operon of an enterotoxigenic human Escherichia coli strain”, Chin J Biotechnol., 11-17, 1989. 77 11. Cheng M.Y., Hartl F.U., Horwich A.L. „The mitochondrial chaperonin hsp60 is required for its own assembly”, Nature, 455-458, 1990. 12. Cooper G.L., Venables L.M., Woodward M.J., Hormaeche C.E. „Vaccination of chickens with strain CVL30, a genetically defined Salmonella enteritidis aroA live oral vaccine candidate”, Infect. Immun., 4747-4754, 1994. 13. Cymerys J., Niemiałtowski M. “Białka szoku cieplnego – molekularne perpetuum mobile”, Podstawy Biologii Komórki, 331-352, 2004. 14. de Bastos Ascenco Soares R., Gomez F.J., de Almeida Soares C.M., Deepe G.S.Jr. “Vaccination with Heat Shock Protein 60 Induces a Protective Immune Response against Experimental Paracoccidioides brasiliensis Pulmonary Infection”, Infect. Immun., 4214-4221, 2008. 15. Dera – Tomaszewska B., Wysocki J., Kuninowski D., Dziaduszko H., Głośnicka R. „Hsp60 specific antibodies in egg yolks from laying hens naturally infected with Salmonella enterica subspecies enterica serowar Enteritidis” Comperative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases, 37-45,. 2003. 16. Ellis R.J. „The molecular chaperone concept”, Semin. Cell Biol., 1-9, 1990. 17. Fenton W. „Residues in chaperonin GroEL required for polypeptide binding and release”, Nature, 614-619, 1994. 18. Fink A.L. „Chaperone-mediated protein folding”, Physiol. Rev., 425-449, 1999. 19. Flohé S.B., Brüggemann J., Lendemans S., Nikulina M., Meierhoff G., Flohé S., Kolb H.; „Human heat shock protein 60 induces maturation of dendritic cells versus a Th1-promoting phenotype”, J. Immunol., 2340-2348, 2003. 20. Galli J., “Charakterystyka reakcji krzyżowych między wybranymi bakteriami Gram-ujemnymi”. Praca doktorska, UP, Wrocław, 2010. 21. Gao B., Tsan M.F. „Endotoxin contamination in recombinant human heat shock protein 70 (Hsp70) preparation is responsible for the induction of tumor necrosis factor alpha release by murine macrophages”, J. Biol. Chem., 174-179, 2003. 22. Garrido C., Gurbuxani S., Ravagnan L., Kroemer G. „Heat shock proteins: endogenous modulators of apoptotic cell death”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 433-442, 2001. 78 23. Gast R.K., Beard C.W. “Production of Salmonella Enteritidis-contaminated eggs by experimentally infected hens”, Avian Dis., 438-446, 1990. 24. Gast R.K., Stone H.D., Holt P.S., Beard C.W. „Evaluation of the efficacy of an oil-emulsion bacterin for protecting chickens against Salmonella enteritidis”, Avian Dis., 992-999, 1992. 25. Grela E., Semeniuk W. “Probiotyki w produkcji zwierzęcej”, Medycyna Wet., 222-228, 1999. 26. Griffin H.G., Griffin A.M. “Cloning and DNA sequence analysis of the serCaroA operon from Salmonella gallinarum: evolutionary relationship between the prokaryotic and eukaryotic aro-A-encoded enzymes”, J. Gen. Microbiol., 113-121, 1991. 27. Grutzkau A., Hanski C., Hahn H., Riecken E.O. “Involvment of M cells in the bacterial invasion of Peyer’s patches: a common mechanism shared by Yersinia enterocolitica and other enteroinvasive bacteria”, Gut., 1011-1015, 1990. 28. Gűlden E., Märker T., Kriebel J., Kolb-Bachofen V. Burkart V., Habich C. “Heat shock protein 60: Evidence for receptor-mediated induction of proinflammatory mediators during adipocyte differentiation”, FEBS Letter, 2877-2881, 2009. 29. Habich C., Burkart V. “Heat shock protein 60: regulatory role on innate immune cells”, Cell Mol. Life Sci., 742-551, 2007. 30. Habich C., Baumgart K., Kolb H., Burkart V. “The receptor for heat shock protein 60 on macrophages is saturable, specific, and distinct from receptors for other heat shock proteins”, J. Immunol., 569-76, 2002. 31. Habich C, Kempe K., Gomez F.J., Lillicrap M., Gaston H., van der Zee R., Kolb H., Burkart V. „Heat Shock protein 60: Identification of specific epitopes for binding to primary macrophages”, FEBS Letters, 115-120, 2006. 32. Hartl F.U., Hayer-Hartl M. „Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein” Science, 1852-1858 ,2002. 33. Hemmi H., Takeuchi O., Kawai T., Kaisho T., Sato S., Sanjo H., Matsumoto M., Hoshino K., Wagner H., Takeda K., Akira S. „A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA”, Nature, 740-752, 2000. 34. Hightower L.E., Hendershot L.M. „Molecular chaperons and the heat Shock response at Cold Spring Harbor”, Cell Stress Chaperones, 1-11, 1997. 79 35. Jagusztyn – Krynicka E.K. „Nowe szczepionki przeciwko starym chorobom”, Mikrob. Medycyna, 3-15, 1995. 36. Jensen V.B., Harty J.T, Jones B.D. “Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer’s patches”, Infect. Immun., 3758-5766, 1998. 37. Kisiela D., Sapeta A., Kuczkowski M., Stefaniak T., Wieliczko A., Ugorski M. „Characterisation of the FimH adhesin Expression by Salmonella enterica serovar Gallinarum biovars Gallinarum and Pullorum: reconstruction of mannose-binding properties by single amino acid substitution”, Infect. Immunol., 6187-6190, 2005. 38. Kisiela D., Laskowska A., Sapeta A., Kuczkowski M., Wieliczko A., Ugorski M. „Functional characterisation of the FimH adhesin from Salmonella enterica serowar Enteritidis”, Microbiology SGM, 1337-1346, 2006. 39. Kissling R., Growburg A., Tvanyi J., Sonderstorm K., Ferm M., Kleinau S., Nisseon E., Klareskog L. “Role of hsp60 during autoimmune and bacterial inflammation”, Immunol. Rev., 91-111, 1991. 40. Kol A., Sukhova G.K., Lichtman A.H., Libby P. „Chlamydial Heat Shock Protein 60 Localizes in Human Atheroma and Regulates Macrophages Tumor Necrosis Factor-α and Matrix Metalloproteinase Expression”, Circulation., 300-307, 1998 41. Kol A., Bourcier T., Lichtman H., Libby P. “Chlamydial and human heat shock protein 60s activate human vascular endothelium, smooth muscle cells, and macrophages”, The Journal of Cilnical Investigation, 571-577, 1999. 42. Kuczkowski M. “Ocena immunogenności rekombinowanego białka fimbrialnego SefA Salmonella Enteritidis u drobiu”, Praca doktorska AR Wrocław, 2003. 43. Lee G.M., Jackson G.D.F., Cooper G.N. “The role of serum and biliary antibodies and cell-mediated immunity in the clearance of serotype S. typhimurium from chickens”, Vet. Immunol. Immunopathol., 233-252, 1981. 44. Lehnardt S., Schorr E., Trimbuch T., Laubisch D., Krueger C., Wulczyn G., Nitsch R., Weber J.R. „A Vicious Cycle Involving Release of Heat Shock Protein 60 from Injured Cells and Activation of Toll-Like Receptor 4 Mediates Neurodegeneration in the CNS”, The Journal of Neuroscience, 2320-2331, 2008. 80 45. Lillehoy H.S. „Cell-mediated immunity in parasitic and bacterial diseases”, Avian Cellular Immunology, J.M. Sharma ed. CRD press. Boca Raron, FL. 155-190, 1991. 46. Llorca O., Martin-Benito J., Ritco-Vinsovici M., Grantham J., Hynes G.M., Willson K.R., Carrascosa J.L., Valpuesta J.M. “Eucaryotic chaperon CCT stabilizes action and tubling folding intermediates in open quasi-native conformations”, EMBO J., 5971-5979, 2000. 47. Paliwal P.K., Bansal A., Sagi S.S.K., Mustoori S., Govindaswamy I. “Cloning, expression and characterization of heat shock protein 60 (groEL) of Salmonella enterica serovar Typhi and its role in protective immunity against lethal Salmonella infection in mice”, Clin. Immunol., 89-96, 2008. 48. Parcellier A., Gurbuxani S., Schmitt E., Solary E., Garrido C. “Heat shock protein. Cellular chaperones that modulate mitochondrial cell heat pathways”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 505-512, 2003. 49. Peetermans W., Ilse Raats C.J., van Furth R., Langermans J. A. “Mycobacterial 65 Kilodalton Heat Shock Protein Induces Tumor Necrosis Factor Alpha and Interleukin 6, Reactives Nitrogen Intermediates, and Toxoplasmatatic Activity in Murine Peritoneal Macrophages”, Infection and Immunity, 3454-3458. 1995. 50. Perschinka H., Mayr M., Millonig G., Mayerl C., van der Zee R., Morrison S.G., Morrison R.P., Xu Q., Wick G. “Cross-reactive B-Cell epitopes of microbial and human heat shock protein 60/65 in artheriosclerosis”, Artherioscler. Thtomb. Vasc. Biol., 1060-1065, 2003. 51. Pivovarova A.V., Mikhaliova V.V., Chernik I.S., Chebotareva N.A., Levitsky D.I., Gusev N.B. “Effects of small heat shock proteins on the thermal denaturation and aggregation of F-actine”, Biochem. Biophys. Res. Commun.,1548-1553, 2005. 52. Plant K.P., LaPatra S.E., Cain K.D. „Vaccination of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), with recombinant and DNA vaccines produced to Flavobacterium psychrophilum heat Shock proteins 60 and 70”, Journal of Fish Diseases, 521-534, 2009. 53. Popoff M.Y., Le Minor L. “Expression of antigenic factor O:54 is associated with the presence of a plasmid in Salmonella”, Ann. Inst. Pasteur Microbiol., 211-217, 1985. 81 54. Popoff M.Y., Blockemuhl J., Gheesling L.L. “Suplement 2001 (no 45) to the Kauffmann-White scheme”, Res. Microbiol., 173-174, 2001. 55. Rainczak K., Bajzert J., Galli J., Selera A., Wieliczko A., Stefaniak T. “Optimalization of Salmonella entritidis recombinant heat shock protein 60 production”, Pol. J. Vet. Sci., 145-146, 2010. 56. Ranford J., Coates A., Henderson B. “Chaperons are cell-signalling proteins:the unfolding biology of molecular chaperones”, Expert Reviews in Molecular Medicine, 1-17, 2000. 57. Rothman J.E. “Polypeptide chain binding proteins: catalasys of folding and related processes in cells”, Cell, 1-17, 1989. 58. Sadkowska-Todys M., Czarkowski M.P. “Salmonellosis in Poland in 2009”, Przegl. Epidemiol., 243-250, 2011. 59. Schneitz C., Nuotio L., Mead G., Nurmi E. “Competetitive exclusion in the young birds: challenge models, administration and reciprocal protection”, Int. J. Food Microbiol., 241-244, 1992.1992 60. Shat K.A. “Cell-mediated immune effector function in chicken”, Poult. Sci, 1077-1081, 1994. 61. Sinha K., Bhatnagar R. „GroEL provides protection against Bacillus anthracis infection in BALB/c mice”, Mol. Immunol., 264-271, 2010. 62. Soltys B.J., Gupta R.S. “Cell surface localization of the 60 kDa heat shock chaperonin protein (hsp60) in mammalian cells”, Cell Biol. Int., 315-320, 1997. 63. Studier F.W. “Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures”, Protein Expression and Purification, 207-234, 2005. 64. Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J.J., Dubendorf J.W. “Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes”, Methods Enzymol., 60-89, 1990. 65. Stuve O., Eagar T.N., Frohman M.E., Cravens P.D. “DNA plasmid vaccination for multiple sclerosis”, Arch. Neurol., 1385-1386, 2007. 66. Tanaka Y., Katsube Y., Mutoh T., Imaizumi K. „Fimbriae of Salmonella typhimurium and their role in mouse intestinal colonization of the organism”, Jpn J. Vet. Sci., 51-62, 1981. 67. Threlfall E.J., Angulo F.J., Wall P.G. „Coprofloxacin-resistent Salmonella Typhimurium DT104”, Vet. Rec., 142-255, 1998. 82 68. Timms I.M., Marshall R.N., Breslin M.F. „Laboratory and field trial assessment given by Salmonella Enteritidis PT4 inactivated, adjuvant vaccine”, Br. Vet. J., 93-102, 1994. 69. Turczyński M., Hoszowski A. “Zapobieganie kolonizacji przewodu pokarmowego kurcząt przez pałeczki Salmonella”, Post. Mikrobiol., 21-31, 1991. 70. www.efsa.europa.eu/en/topics/topic/salmonella.html 71. Vabulas R.M., Ahmad-Nejad P., da Costa C., Miethke T., Kirchning C., Häcker H., Wagner H. “Endocytosed HSP60s Use Toll-like Receptor 2 (TLR2) and (TLR4) to Activate the Toll/Interkeukin-1 Receptor Signaling Pathway in Innate Immune Cells” The Journal Of Biological Chemistry, 31332-32339, 2001. 72. Voss M., Vielitz E. „Strategia kontroli zakażeń drobiu pałeczkami Salmonella w krajach Unii Europejskiej”, Mat. Konf. Nt. Aktualne problemy w patologii prakó™. PRO ANIMALI’96, Wrocław, 17-24, 1996. 73. Xu Q,. Wick G. “Surface expression of heat shock protein 60 on endothelial cells”, Immunobiology, 131-132, 1994. 74. Zűgel U., Schoel B., Yamamoto S., Hengel H., Morein B., Kaufmann S.H.E. “Crossrecognation by CD8 TCR α/β CTL of peptides in the self and mycobacteria hsp60 which share intermediate sequence homology”, Eur. J. Immunol, 451-458, 1999a. 75. Zűgel U., Kaufmann S.T. „Role of Heat Shock Protein in Protection from and Pathogenesis of Infectious Diseases”, 19-39, 1999b. 83 9. Cytowane w pracy rozporządzenia oraz dyrektywy: 1. Dyrektywa 2003/99/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 17 listopada 2003 r. w sprawie monitorowania chorób odzwierzęcych i odzwierzęcych czynników chorobotwórczych, zmieniająca decyzję Rady 90/424/EWG i uchylająca dyrektywę Rady 92/117/EWG (Dz. U. L 325 , 12/12/2003). 2. Rozporządzenie (WE) nr 2160/2003 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 17 listopada 2003 r. w sprawie zwalczania Salmonelli i innych określonych odzwierzęcych czynników chorobotwórczych przenoszonych przez żywność (Dz. U. L 325 z 12.12.2003). 3. Rozporządzenie Rady Ministrów z dnia 28 marca 2007 r. w sprawie wprowadzenia "Krajowego programu zwalczania niektórych serotypów Salmonelli w stadach hodowlanych gatunku kura (Gallus gallus)" na lata 2007-2009 (Dz. U. 2007 nr 61 poz. 414). 4. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 1168/2006 z dnia 31 lipca 2006 r. w sprawie wykonania rozporządzenia (WE) nr 2160/2003 w odniesieniu do wspólnotowego celu ograniczenia częstości występowania niektórych serotypów Salmonelli w stadach kur niosek gatunku Gallus gallus oraz zmieniające rozporządzenie (WE) nr 1003/2005. 5. Rozporządzenie Rady Ministrów z dnia 12 maja 2009 r. w sprawie wprowadzenia „Krajowego programu zwalczania niektórych serotypów Salmonelli w stadach niosek gatunku kura (Gallus gallus) na 2009 r. oraz "Krajowego programu zwalczania niektórych serotypów Salmonelli w stadach brojlerów gatunku kura (Gallus gallus)" na 2009 r. (Dz.U.09.78.651). 84 6. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 646/2007 z dnia 12 czerwca 2007 r. wykonujące rozporządzenie (WE) nr 2160/2003 Parlamentu Europejskiego i Rady w odniesieniu do wspólnotowego celu ograniczenia częstości występowania Salmonella enteritidis i Salmonella typhimurium u brojlerów i uchylające rozporządzenie (WE) nr 1091/2005. 7. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 584/2008 z dnia 20 czerwca 2008 r. wykonujące rozporządzenie (WE) nr 2160/2003 Parlamentu Europejskiego i Rady w odniesieniu do wspólnotowego celu ograniczenia częstości występowania Salmonelli enteritidis i Salmonelli typhimurium u indyków. 85
