wykład
advertisement
ALEKSANDRA ŚWIERCZ Ekspresja genów http://genome.wellcome.ac.uk/doc_WTD020757.html A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 2 Różnice między eksperymentem mikromacierzowym a RNA-seq Przy użyciu mikromacierzy można badać poziom ekspresji znanych genów, natomiast wykorzystując RNA-seq można także wykryć nowe izoformy genów A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 3 Do czego wykorzystywane jest RNA-seq? Badanie ekspresji genów oraz różnicowej ekspresji genów Wyszukiwanie alternatywnego splicingu w genach Odkrywanie nowych transkryptów/izoform Odkrywanie mutacji w genach Wykrywanie fuzji genów Edytowanie RNA (mutacje w RNA) A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 4 Sekwencjonowanie RNA – po kolei RNA-seq Module, 2013, www.bioinformatics.ca A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 5 Trzy podejścia do mapowania RNA-seq A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 6 Mapowanie – wyznaczenie poziomu ekspresji – wizualizacja TopHat / BowTie Cufflinks Cuffmerge Cuffdiff Cummerbund A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 11 TopHat2 pipeline Znane sygnały podziału GT-AG, GC-AG, AT-AC A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 12 A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 13 Jak wyrażana jest ekspresja genu? RPKM – Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads FPKM – Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads W RNA-Seq – poziom ekspresji transkryptu jest proporcjonalny do liczby fragmentów cDNA z którego pochodzi. Chociaż: ◦ Liczba fragmentów jest przechylona w kierunku większych genów ◦ Całkowita liczba fragmentów jest uzależniona od głębokości sekwencjonowania RPKM (FPKM) = (109 * C) / (N * L) ◦ C – liczba zmapowanych odczytów (fragmentów) do genu/transkryptu/eksonu ◦ N – całkowita liczba zmapowanych odczytów (fragmentów) w bibliotece ◦ L – liczba nukleotydów w genie/transkrypcie/eksonie A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 14 Alternatywny splicing W procesie splicingu łączone są ze sobą różne eksony z pre-mRNA na różne sposoby, czasami z pominięciem niektórych eksonów, lub z zachowaniem niektórych intronów Jeśli warianty splicingowe dotyczą sekwencji kodującej, powstałe białka różnią się sekwencją aminokwasową, co może powodować np. zróżnicowanie funkcji. Jeśli warianty splicingowe dotyczą obszarów niekodujących może to wpływać np. na wzmocnienie translacji lub stabilność mRNA. Rekordem w liczbie różnych wariantów splicingowych jest gen Dscam D. melanogaster, który ma ponad 38 tys. różnych wariantów (więcej niż liczba wszystkich genów) * * C. Ghigna, C. Valacca, G. Biamonti „Alternative Splicing and Tumor Progression”, Curr Genomics. Dec 2008; 9(8): 556–570. A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 16 Różne warianty splicingowe A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 17 A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 18 Różne warianty splicingowe Mutually exclusive exons A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 19 Zhiyong Guo, Yun Qiu A New Trick of an Old Molecule: Androgen Receptor Splice Variants Taking the Stage?! Int J Biol Sci 2011; 7(6):815-822. A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 20 Jak Cufflinks radzi sobie z wykrywaniem alternatywnego splicingu? C. Trapnell, BA Williams, G Pertea, A Mortazavi, G Kwan, MJ van Baren, SL Salzberg, BJ Wold, L Pachter, „Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation, Nature Biotechnology 28(5) 2010, p. 511515 C Trapnell, DG Hendrickson, M Sauvageau, L Goff, JL Rinn, L Pachter, „Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq”, Nature Biotechnology 31(1), 2013, p. 46-53. A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 21 Mapowanie odczytów sparowanych za pomocą TopHat-a. Każda para odczytów traktowana jest jako jedno dopasowanie. Odczyty mogą być zmapowane w całości, lub z podziałem pomiędzy eksonami A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 22 Cufflinks W pierwszym kroku wyszukiwane są pary „niekompatybilnych” fragmentów, które muszą pochodzić z innych izoform mRNA (zaznaczone na żółto, niebiesko i czerwono). Fragmenty (sparowane odczyty), są wierzchołkami w grafie. Wierzchołki są łączone pomiędzy parami kompatybilnych fragmentów. Szarym kolorem zaznaczone są fragmenty, które mogą pochodzić z dowolnych transkryptów. Ścieżki w grafie odpowiadają wzajemnie wykluczającym się fragmentom, które mogą być połączone w izoformy. Graf może być pokryty minimalnie przez 3 ścieżki – oznaczone 3 kolorami, co w efekcie daje 3 odrębne izoformy A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 23 Cufflinks Fragmenty są znakowane (tutaj kolorem) w zależności od tego z której izoformy pochodzą. Fioletowy fragment może pochodzić z niebieskiego lub czerwonego. Szare fragmenty mogą pochodzić z dowolnej izoformy. Cufflinks estymuje liczność transkryptu używając modelu statystycznego, w którym prawdopodobieństwo obserwowania każdego fragmentu jest liniową funkcją liczności transkryptów, z których mogą pochodzić. Ponieważ długość sekwencjonowanych fragmentów nie jest znana (sparowane odczyty są końcami fragmentów), a przypisanie fragmentu do różnych izoform powoduje że różna jest jego długość – Cufflinks wyznacza rozkład długości odczytów. Rozkład ten jest następnie wykorzystywany do przypisania fragmentów do różnych izoform (fioletowy fragment byłby zbyt długi, gdyby został przypisany do czerwonego transkryptu). W ostatnim kroku program maksymalizuje prawdopodobieństwo liczności każdej z izoform i przydziela im odpowiednio numeryczne wartości (γ1, γ2, γ3) A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 24 Cufflinks W powyższym przykładzie analizowany był tylko fragment jednego genu. Wszystkie fragmenty genu należy potem skleić całość A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 25 A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 26 Do czego jest potrzebny cuffmerge? Pozwala na łączenie wyników z działania cufflinks’a dla różnych próbek ◦ Jest to potrzebne ponieważ dla każdej próbki cufflinks może wykryć inną liczbę oraz inną strukturę transkryptów Odfiltrowywane są transkrypty, które są najprawdopodobniej artefaktami (transfrags) Opcjonalnie może także podać plik GTF w odniesieniu do genomu referencyjnego, w którym połączone będą dotychczas znane oraz nowe izoformy wraz z maksymalizacją jakości zasemblowanych transkryptów A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 27 Jak wyznaczyć ekspresję transkryptu? A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 28 Jak działa cuffdiff? • Modelowanie zmienności w liczbie fragmentów dla każdego genu dla różnych powtórzeń – estymacja wariacji • Liczba fragmentów dla każdej izoformy jest estymowana dla każdego powtórzenia (jak poprzednio) razem z miarą niepewności pochodzącą od niejednoznacznie zmapowanych odczytów • Transkrypty, z większą liczbą współdzielonych eksonów, a niewielką liczbą jednoznacznie przypisanych fragmentów będą miały mniejszą niepewność • Algorytm łączy estymowaną niepewność razem ze zmiennością pomiędzy powtórzeniami poprzez model ujemnego rozkładu dwumianowego dla liczby fragmentów, w celu estymowania liczby niezgodności dla każdego transkryptu w każdej bibliotece • Te estymowane niezgodności używane podczas testowania statystycznego pozwalają na znalezienie znaczących statystycznie genów i transkryptów, które uległy zróżnicowanej ekspresji A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 29 Wizualizacja, np. cummeRbund Automatycznie generuje zestaw wykresów do porównania ekspresji dla różnych (zadanych) próbek ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ Wykresy z rozkładem wartości Wykresy z korelacją Wykresy MA Wykresy ‚volcano’ Wykresy klastrowania, PCA, MDS – w celu ogólnej oceny związku pomiędzy warunkami ◦ Heatmapy – wykresy gęstości ◦ Wykresy z poziomu genów lub transkryptów pokazujące strukturę transkryptów i poziom ekspresji A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 30 A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 31 ` A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 32 Alternatywne do FPKM/RPKM „Raw counts” – liczba odczytów/fragmentów przypadająca na gen/transkrypt „HTSeq” – htseq-count – zlicza liczbę odczytów przypadających na gen/ekson A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 33 FPKM czy ‚raw’ counts ? FPKM ◦ Gdy chcemy wykorzystać zalety ‚smokingu’ (tophat/cufflinks/itp) ◦ Można wykorzystać do wizualizacji na heatmapie ◦ Także do wyznaczania zmiany poziomu ekspresji genów Surowa liczba odczytów ◦ Jeśli chcemy wykorzystać bardziej zaawansowane metody statystyczne do normalizacji, czy do badania zmiany poziomu ekspresji genów ◦ Do wykorzystania przy skomplikowanych projektach eksperymentalnych, przy analizie trendów czasowych i przy wykorzystaniu innych zaawansowanych testów statystycznych A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 34 Limma Liniowy model początkowo używany do analizy danych pochodzących z eksperymentów mikromacierzowych, następnie przystosowany do analizy danych RNA-seq Umożliwia na bardzo rozbudowany model porównania, poprzez zdefiniowanie design matrix oraz contrast matrix. > design <- model.matrix(~ 0+factor(c(1,1,1,2,2,3,3,3))) > colnames(design) <- c("group1", "group2", "group3") > contrast.matrix <- makeContrasts(group2-group1, group3group2, group3-group1, levels=design) Umożliwia analizę trendów Time points 1d 2d 4d 8d 12d Control vs treated http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 36 DESeq Utworzony dla danych RNA-seq. Wymaga tabeli z wyznaczoną liczbą odczytów przypadających na dany gen. Normalizacja względem liczby wszystkich odczytów przypadających na próbkę > cds = estimateSizeFactors( cds ) Estymacja wariancji – wyznaczenie jak bardzo geny różnią się w ekspresji pomiędzy różnymi próbkami > cds = estimateDispersions( cds ) Wyznaczenie różnicowej ekspresji > res = nbinomTest( cds, "untreated", "treated" ) http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq.html A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 37 Różne programy – porównanie wyników A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 38 Alamancos GP, Agirre E, Eyras E. (2014) Methods to study splicing from high-throughput RNA sequencing data. Methods Mol Biol 1126:357-97. A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 39
