Wykład

ALEKSANDRA ŚWIERCZ
Plan wykładów
 Wprowadzenie do różnych metod sekwencjonowania
 Resekwencjonowanie – mapowanie do genomu referencyjnego
 Sekwencjonowanie de novo – asemblacja
 Różnica w ekspresji genów, alternatywny splicing
 Różnice między genomami – CNV, SNP
 Analiza krótkich miRNA
 Wizualizacja danych, Short Read Archive
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
2
Sposoby zaliczenia
Wykład:
◦ Kolokwium zaliczeniowe – max 5 punktów
◦ Prezentacja – max 2 punkty
◦ Obecność na wykładach – max 1 punkt
Zaliczenie od 3 punktów (ocena 3.0)
Laboratoria:
◦ Kilka zadań zaliczeniowych, do oddawania razem ze sprawozdaniem
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
3
Sekwencjonowanie DNA/RNA
BLACK
BOX
A. Świercz
AAATGCCTGCCCTGAAGGCCTGCGTA
GTTTTGGGAGAAGACCCACGGATA
AAGGTGTAGCCCCGTAGC
GGGGGGTATTATTTATTTTATACCCAC
…………..
ACAGGAUCGUUGGAUGGTGGGA
………….
Sekwencjonowanie polega na
odczytaniu sekwencji liter DNA/RNA
badanego fragmentu genomu
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
4
Sekwencjonowanie DNA/RNA
Sanger
SBH
BLACK
BOX
A. Świercz
AAATGCCTGCCCTGAAGGCCTGCGTA
GTTTTGGGAGAAGACCCACGGATA
AAGGTGTAGCCCCGTAGC
GGGGGGTATTATTTATTTTATACCCAC
…………..
ACAGGAUCGUUGGAUGGTGGGA
………….
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
5
Sekwencjonowanie DNA/RNA
Sanger
SBH
Roche/454
BLACK
BOX
AAATGCCTGCCCTGAAGGCCTGCGTA
GTTTTGGGAGAAGACCCACGGATA
AAGGTGTAGCCCCGTAGC
GGGGGGTATTATTTATTTTATACCCAC
…………..
ACAGGAUCGUUGGAUGGTGGGA
………….
Illumina
Applied Biosystems SOLID
Ion Torrent
Complete Genomics
Pacific Biosystems
Heilcos Heliscope
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
6
Pacific Biosystems
Długie odczyty
20 000 bp
Sanger
Ion Torrent
Roche/454
SBH
Pojedyncza
sekwencja
Illumina
Dużo powtórzeń
DNA
Applied Biosystems SOLID
Complete Genomics
Heilcos Heliscope
Krótkie odczyty
20 bp
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
7
Metoda Sangera – elektroforeza żelu
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
8
Sekwencjonowanie przez hybrydyzację (SBH)
1.
Część eksperymentalna - przeprowadzenie eksperymentu
biochemicznego, w czasie którego znalezione zostaną wszystkie
fragmenty badanego łańcucha DNA o określonej z góry długości
2.
Część obliczeniowa – odtworzenie badanej sekwencji DNA poprzez
poskładanie krótkich fragmentów w dłuższy łańcuch.
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
9
SBH – część eksperymentalna
1.
Przygotowanie sekwencji DNA:
◦
◦
◦
◦
2.
Cięcie sekwencji metodą shotgun
Tylko jedna nić
Namnażanie wielu kopii
Nałożenie koloru fluorescencyjnego
Przygotowanie chipu/mikromacierzy –płytki na której znajdują się
różne oligonukleotydy, np. wszystkie oligonukleotydy o długości 8
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
10
SBH – eksperyment hybrydyzacji
1. Przygotowanie chipu DNA
A
AC
ACG
ACGT
Round 1
ACGT
ACGT
A
Round 2
A. Świercz
ACGT
A
C
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
ACGT
A
C
G
A
C
G
T
11
A CGT
Round 3
A
C
G
T
... and so on ...
DNA chip
AAAA
0,4mm
Full library
of tetranucleotides
0,4mm
25m site per probe
44 – 0.0016 cm2
48 – 0.4096 cm2
410 – 6.5536 cm2
AAAA AACA AAGA
AAAC AACC AAGC
AAAT AACG AAGG
AAAT AACT AAGT
ACAA ACCA
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
12
2. Reakcja hybrydyzacji
DNA chip
A. Świercz
TCCACTG... Wiele
znakowanych kopii
badanej sekwencji DNA
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
13
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
14
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
15
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
16
2. Reakcja hybrydyzacji
DNA chip
TCCACTG... Wiele
znakowanych kopii
badanej sekwencji DNA
3. Wynik odczytu
Fluorescencyjny chip
DNA
. .
. . .
. .
spectrum
Spektrum – zbiór oligonukleotydów komplementarnych do
fragmentu badanej sekwencji DNA
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
17
Reakcja hybrydyzacji pomiędzy sondą o znanej sekwencji
(l-mer) i nieznaną sekwencją o długości n (n-mer):
n-mer - . . . A A C T A G A C C T . . .
l-mer -
GAT
CTA
Sekwencja komplementarna do sondy istnieje w targecie
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
18
Sekwencjonowanie DNA bez błędów
Sekwencja oryginalna: AACTAGACCT
Spektrum = {AAC,ACT,CTA,TAG,AGA,GAC,ACC,CCT}
(Dwa możliwe rozwiązania : AACTAGACCT, AACCTAGACT)
 Lysov (1988)
Graf oparty o l-mery (graph H)
AAC
ACT
CTA
CCT
TAG
ACC
GAC
AGA
Znalezienie ścieżki Hamiltona – NP-trudne
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
20
Pevzner (1989)
AAC
AA
AC
Graf oparty na (l-1)-merach (graf G):
AA
AC
CT
TA
CC
AG
GA
Znalezienie ścieżki Eulera – rozwiązywalne w czasie wielomianowym
o Problem równoważności
o Problem unikalności
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
21
Błędy w eksperymencie SBH
1. Błędy pozytywne – nadmiar w spektrum
a. W czasie eksperymentu hybrydyzacji niekomplementarne
oligonukleotydy (mające nie wszystkie zasady komplementarne)
przyłączają się do badanego łańcucha DNA. W konsekwencji odczytu
obrazu fluorescencyjnego, błędny oligonukleotyd zostaje włączony do
spektrum.
b. Obraz fluorescencyjny chipu może być zanieczyszczony i omyłkowo
oligonukleotyd może zostać włączony do spektrum
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
23
Błędy w eksperymencie SBH
2. Błędy negatywne – braki w spektrum
a. Oligonukleotyd pojawia się w sekwencji oryginalnej więcej niż jeden
raz. Ponieważ spektrum nie jest multizbiorem, tylko jedno
wystąpienie każdego elementu jest możliwe
b. Nie wszystkie zasady z komplementarnego oligonukleotydu
przyłączyły się do świecącego łańcucha DNA, stąd też sygnał na chipie
jest słabo widoczny i oligonukleotyd nie zostanie odczytany.
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
24
J. Błażewicz, P. Formanowicz, M. Kasprzak,
W.T. Markiewicz, J. Węglarz
DNA Sequencing with positive and negative errors,
Journal of Computational Biology 6, No. 1, 1999.
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
25
Sekwencjonowanie DNA w przypadku
błędów pozytywnych i negatywnych
Sformułowanie jako wariant problemu komiwojażera z nagrodami:
Mając pełny graf G=(V,A), V=spektrum, z nagrodą za odwiedzenie
każdego wierzchołka równą 1 oraz łukami z kosztami równymi liczbie
nakładających się etykiet wierzchołków (oligonukleotydów), znajdź
ścieżkę z maksymalnym zyskiem i kosztem nie większym niż n-l.
[J.Błażewicz, P.Formanowicz, M.Kasprzak, W.T.Markiewicz,
J.Węglarz,1999]
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
26
Przykład
CTTACTACG – sekwencja oryginalna
spektrum – {CTT, TAC, ACT, CTA, ACG, GCG}
Długość sekwencji n=9
Długość oligonukleotydów =3
GCG – błędy pozytywne
TTA, TAC – błędy negatywne
CTT – początkowy oligonukleotyd
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
27
CTT
CTT
TAC
GCG
ACG
ACT
TAC
GCG
ACG
ACT
CTA
CTA
koszt= 1, np. T(AC)T
Dwa rozwiązania optymalne
koszt= 2, np. AC(T)AC
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
28
Złożoność problemu SBH
Problem sekwencjonowania SBH w przypadku gdy nie ma
błędów w spektrum jest problemem łatwym obliczeniowo
(należy do klasy P).
Problem SBH w przypadku z błędami pozytywnymi albo
negatywnymi, albo błędami obu typów jest problemem trudnym
obliczeniowo (należy do klasy silnie NP-trudnej)
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
29
Przykłady modyfikacji klasycznego podejścia
o
Biblioteki izotermiczne – w celu zmniejszenia liczby błędów
eksperymentalnych zamiast bibliotek oligonukleotydów o równej
długości wprowadzono pojęcie bibliotek izotermicznych, czyli
oligonukleotydów o zbliżonej temperaturze topnienia dupleksów.
A,T- mniej stabilne, mają niższą temperaturę niż G,C
ex. t(ACGTC) = 2+4+4+2+4 = 16
o
„Sondy z dziurami” – tzw. gapped probes. Wprowadzono pojęcie
uniwersalnych nukleotydów, które przyłączają się do dowolnego
nukleotydu w łańcuchu DNA. Sondy na chipie są kombinacją
zwykłych i uniwersalnych nukleotydów, dzięki czemu można
wydłużyć długość oligonukleotydów nie zwiększając liczności
biblioteki
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
30
Wybrana literatura dla problemu SBH
J.Błażewicz, P.Formanowicz, M.Kasprzak, W.T.Markiewicz, J.Węglarz, „DNA sequencing with positive and negative errors”,
Journal of Computational Biology 6, 1999, pp.113-123.
F.P. Preparata, A.M. Frieze, and E. Upfal. On the power of universal bases in sequencing by hybridization. In Proc. 3rd Ann. Int. Conf.
Comput. Mol. Biol., pages 295–301, 1999.
J.Błażewicz, P.Formanowicz, M.Kasprzak, W.T.Markiewicz, J.Węglarz, „Tabu search for DNA sequencing with false negatives and false
positivies”, European Journal of Operational Research 125, 2000, pp. 257-265.
V.T. Phan and S. Skiena. Dealing with errors in interactive sequencing by hybridization. Bioinformatics, 17:862–870, 2001.
J. Błażewicz, P. Formanowicz, F. Guinand, M. Kasprzak, "A heuristic managing errors for DNA sequencing„, Bioinformatics 18, 2002, pp.
652-660.
J-H. Zhang, L-Y. Wu, and X-S. Zhang. Reconstruction of DNA sequencing by hybridization. Bioinformatics, 19:14–21, 2003.
S.A. Heath, F.P. Preparata, and J. Young. Sequencing by hybridization by cooperating direct and reverse spectra. J. Comput. Biol.,
10:499–508, 2003.
E. Halperin, S. Halperin, T. Hartman, and R. Shamir. Handling long targets and errors in sequencing by hybridization. J. Comput. Biol.,
10:483–497, 2003
J. Błażewicz, F. Glover, M. Kasprzak, "DNA sequencing - tabu and scatter search combined„ INFORMS Journal on Computing 16, 2004,
pp. 232-240
F.P. Preparata and J.S. Oliver. DNA sequencing by hybridization using semi-degenerate bases. J. Comput. Biol., 11(4):753–765, 2004.
J. Błażewicz, P. Formanowicz, M. Kasprzak, W. T. Markiewicz, A. Świercz, ”Tabu search algorithm for DNA sequencing by hybridization
with isothermic libraries” Computational Biology and Chemistry 28, 2004, pp. 11-19.
T.A. Endo. Probabilistic nucleotide assembling method for sequencing by hybridization. Bioinformatics, 20:2181–2188, 2004.
J. Błażewicz, C. Oğuz, A. Świercz, J. Węglarz, "DNA sequencing by hybridization via genetic search”, Operations Research 54, 2006,
pp.1185-1192.
J. Błażewicz, F. Glover, M. Kasprzak, W.T. Markiewicz, C. Oğuz, D. Rebholz-Schuhmann, A. Świercz "Dealing with repetitions in
sequencing by hybridization”, Computational Biology and Chemistry 30, 2006, pp 313-320.
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
31
Illumina
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
32
Illumina Flow cell
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
33
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
34
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
35
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
36
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
37
Podział flowcell
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
38
Whiteford N et al. Bioinformatics 2009;25:2194-2199
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
39
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
40
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
41
W których
klastrach
odczyty
przechodzą filtr
jakości?
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
42
Wiele próbek na jednej linii - multiplexing
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
43
Odczyty sparowane
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
44
Porównanie sekwenatorów Illuminy
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
45
Pyrosequencing 454 Life Sciences
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
46
Przygotowanie
biblioteki DNA
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
47
Sekwencjonowanie ...
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
48
Flowgram – wyjście dla każdej studzienki
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
49
Format danych z sekwenatora
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
50
Tabela kodów ASCII
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
51
Jakość – Phred quality score
2 -> ASCII code 50
qual = ASCII code – 33 = 17
A. Świercz
Phred quality
score
Prawdopodobieńst
wo błędu
Perror
3
1 na 2
50%
5
1 na 3
32%
10
1 na 10
10%
20
1 na 100
1%
30
1 na 1000
0.1%
40
1 na 10000
0.01%
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
52
Rozkład jakości dla każdego nukleotydu
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
53
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
54
Obrazki, slajdy…
www.illumina.com
www.454.com
I inne strony związane z sekwenatorami
Informatics on High Throughput Sequencing Data (2013) @
www.bioinformatics.ca
A. Świercz
ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
55