Sprawozdanie białka - biochemia - ewastyna1

Sprawozdanie białka.doc
(69 KB) Pobierz
Milena Kania
Ewa świegocka
Patrycja Wiśniak
Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności
Biotechnologia
Wtorek godz. 12:15-16:00
SPRAWOZDANIE
Białka
BIAŁKA
Cel ćwiczenia: Poznanie właściwości białek.
Część teoretyczna:
Białka- są najbardziej uniwersalnymi makrocząsteczkami w układach żywych i odgrywają
decydującą rolę właściwie we wszystkich procesach biologicznych. Pełnią funkcję katalizatorów,
transportują i magazynują inne cząsteczki takie jak na przykład tlen, pełnią funkcje mechanicznostrukturalne, uczestniczą w obronie immunologicznej, są generatorami ruchu, przenoszą impulsy
nerwowe oraz kontrolują wzrost i różnicowanie.
Budowa białek:
Białka są liniowymi polimerami aminokwasów. Każdy aminokwas składa się z centralnego
tetraedrycznego atomu węgla, połączonego z grupą aminową, grupą karboksylową,
charakterystycznym dla danego aminokwasu łańcuchem bocznym i z atomem
wodoru. Tetraedryczne centra, z wyjątkiem przypadku glicyny, są chiralne. Białka naturalne są
zbudowane wyłącznie z L-α- aminokwasów. W polipeptydzie aminokwasy są połączone
wiązaniami peptydowymi, utworzonymi między grupą karboksylową jednego aminokwasu i grupą
aminową następnego z uwolnieniem jednej cząsteczki wody. Wiązanie peptydowe jest to bardzo
trwałe wiązanie kowalencyjne.
Struktura białka:
Zsyntetyzowany w komórce łańcuch białkowy przypomina unoszącą się swobodnie w roztworze
"nitkę", która ulega procesowi tzw. zwijania białka. tworząc mniej lub bardziej sztywną strukturę
przestrzenną, zwaną strukturą lub konformacja białka "natywną". Tylko cząsteczki, które uległy
zwinięciu do takiej struktury, mogą pełnić właściwą danemu białku rolę biochemiczną.
Wyróżniamy:
- strukturę pierwszorzędową białka- jest to sekwencja aminokwasów, mówi o kolejności, ilości i
ułożeniu aminokwasów. Jest determinowana genetycznie.
- strukturę drugorzędową białka- opisuje wzajemne przestrzenne ułożenie reszt aminokwasów
sąsiadujących ze sobą w sekwencji liniowej. Tą strukturę stabilizują wiązania wodorowe
pomiędzy tlenem węgla karbonylowego, a azotem sąsiadującego przestrzennie kolejnego wiązania
peptydowego. Sposób wzajemnego ułożenia przestrzennego tych reszt aminokwasów powtarza się
regularnie i wówczas mamy do czynienia z:
* alfa helissą
* beta harmonijką
* zwrotem beta
- strukturę trzeciorzędową białka- odnosi się do powiązań przestrzennych i wzajemnego ułożenia
reszt aminokwasowych, oddalonych od siebie w sekwencji liniowej, oraz lokalizacji mostków
disiarczkowych. Strukturę IV rzędową stabilizują: oddziaływania jonowe, mostki disulfidowe,
oddziaływania hydrofobowe, oddziaływania Van der Waalsa, oddziaływania elektrostatyczne i
wiązania wodorowe.
- struktura czwartorzędowa białka- odnosi się do wzajemnego ułożenia przestrzennego
podjednostek i natury ich oddziaływań. (Struktura charakterystyczna dla tzw. białek
oligomerycznych). Struktura ta jest stabilizowana przez: oddziaływania jonowe, oddziaływania
hydrofobowe, oddziaływania Van der Waals, wiązania wodorowe.
Właściwości fizykochemiczne:
Bez względu na pochodzenie i strukturę wszystkie białka posiadają szereg wspólnych właściwości
fizykochemicznych.
- mają zbliżony skład pierwiastków ( C: 50%- 55%, H: 6,6%- 7,8%, N: 15%- 19%, O: 19%- 21%)
- ulegają denaturacji.
- roztwory białek są hydrofilowymi układami koloidalnymi i nie ulegają dializie.
- są amfoterami.
- wypadają z roztworu pod wpływem odpowiednio wysokich stężeń, silnych elektrolitów i
organicznych rozpuszczalników.
- są związkami optycznie czynnymi.
Podział białek ze względu na budowę i skład:
- białka proste- są zbudowane tylko i wyłącznie z reszt aminokwasów.
- białka złożone- związki białkowe zawierające w swojej strukturze oprócz podstawowego
łańcucha białkowego (białko proste) także inne grupy, tzw. grupy prostetyczne.
Podział ze względu na kształt:
- białka globularne- zwykle są zwinięte w zwarty, w przybliżeniu kulisty kształt, rozpuszczalne w
wodzie np. insulina, hemoglobina, immunoglobulina.
- białka fibrylarne- składają się z łańcuchów polipeptydowych ułożonych obok siebie w długie
włókna, nierozpuszaczalne w wodzie np. kolagen, keratyna, miozyna, elastyna.
Podział ze względu na rozpuszczalność białek:
- albuminy
- globuliny
- prolaminy
- gluteiny
2. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA – BIAŁKA
Zestawienie wymaganych odczynników, materiałów i sprzętu:
- mączka grochowa
- mąka pszenna
- 1% roztwór białka jaja kurzego
- 1% roztwór białka jaja kurzego o pH: 8,0; 4,7; oraz 3,0
- 0,1M roztwór buforu octanowego o pH 4,7
- 5% kwas octowy CH3COOH
- 5% kwas trójchlorooctowy CCl3COOH, (TCA)
- 10% kwas trójchlorooctowy CCl3COOH, (TCA)
- 6% kwas sulfosalicylowy C7H6O6S
- stały siarczan amonowy (NH4)2SO4
- 0,01M roztwór azotanu srebra AgNO3
- 0,5M chlorek potasu KCl
- 5% siarczan miedzi CuSO4
- 10% octan ołowiu (CH3COO)2Pb
- 10% wolframian sodu NaWO4
- kolby erlenmeyra (o poj. 100 i 200 ml), probówki ze statywem, pipety (1 ml, 10 ml),
wkraplacze, zlewki, lejki szklane, moździerz porcelanowy, sączki bibułowe, łąźnia wodna,
wirówka.
WYKONANIE ĆWICZENIA
2.1. Rozpuszczalność i wysalanie
2.1.1. Izolowani białek roślinnych
A) Ekstrahowanie albumin i globulin
1 g mączki grochowej ekstrahowano 25 ml 0,5M roztworu KCI, w kolbie (erlenmeyrce)
15 min. (okresowo wstrząsano). Po czym całość odwirowano i uzyskaną ciecz nadosadową
(supernatant) analizowano w następujący sposób:

Wykazano zawartość białka, za pomocą reakcji biuretowej (p.2.5.), równolegle wykonano
oznaczenia dla roztworu białka jaja kurzego
Stwierdzono obecność albumin i globulin: do dwu probówek odmierzono po 1 ml ekstraktu mączki,
następnie do jednej dodano 8 ml wody, a do drugiej 8 ml 0,5M roztworu KCl. Porównano wygląd prób.
Do próby,… (wpisać, w której probie powstało zmętnienie) zawierającej ekstrakt mączki i wodę dodano
niewielką ilość (parę kropli) roztworu chlorku potasowego. Zmętnienie, spowodowane wypadaniem
nierozpuszczalnego w wodzie białka, zniknęło, ponieważ …. (Dlaczego?) nastąpiło wsalanie białka,
ponieważ globuliny rozpuszczają się dopiero w środowisku dobrze dysocjującej na jony soli, czyli
użytego KCl. W probówce, w której użyto jako rozpuszczalnika roztworu KCl, zarówno globuliny jak
i albuminy uległy rozpuszczeniu. Dlatego w tej probówce nie zaobserwowaliśmy żadnego zmętnienia.
B) Wydzielanie glutenu
Z 30 g maki pszennej i wody przygotowano (w porcelanowym moździerzu) twarde ciasto,
odstawiono na 30 minut celem uwodnienia i spęcznienia białka. Następnie wypłukano z ciasta
skrobię, wygniatając je w strumieniu zimnej, bieżącej wody. Otrzymaną pozostałość
o gumowatej, ciągnącej konsystencji rozpuszczono w 30 ml 0,2M roztworu NaOH.
Po przesączeniu sprawdzono obecność białka metodą biuretową (p.2.5.).
Obserwacje:
W wyniku reakcji biuretowej badany roztwór zabarwił się na kolor fioletowy. W wyniku reakcji
biuretowej próba kontrolna dodatnia przeprowadzona na roztworze białka jaja kurzego zabarwiła
się na fioletowo. Próba kontrolna ujemna z wodą zabarwiła się na kolor lekko błękitny
2.1.2. Wysalanie białka
Materiały i sposób wykonania doświadczenia:
1% roztwór białka jaja kurzego
Stały (NH3)2SO4
0,5M KCl
5% kwas trójchlorooctowy CCl3COOH (TCA)
kolba (erlenmeyrka o poj. 100 ml), szklany lejek i sączek bibułowy
Do 10 ml roztworu białka kurzego dodano porcjami stały preparat siarczanu amonowego aż do
nasycenia roztworu soli. Osad wysolonego białka oddzielono na sączku i rozpuszczono
(bezpośrednio na sączku) roztworem KCl. W uzyskanym roztworze sprawdzono obecność białka
reakcją biuretową (p.4.5.). Do przesączu, otrzymanego po oddzieleniu osadu białka dodano 2-3
krople kwasu trójchlorooctowego. TCA wytrąca białka, brak osadu w próbie świadczył o
całkowitym wysoleniu białka z roztworu.
Dlaczego TCA pozwala na odbiałczenie prób?
Kwas trójchlorooctowy pozwala na odbiałczenie prób, gdyż po jego dodaniu do roztworu dochodzi
do denaturacji. Spowodowane jest to tym, że jony chloru mają silną zdolność do ściągania ładunku
elektrycznego więc tym samym wpływają na wiązania stabilizujące strukturę przestrzenną
cząsteczki białek. Białko traci swoje właściwości biologiczne.
2.2. Białka jako koloidy
Materiały i sposób wykonania doświadczenia:
0,01M roztwór AgNO3
1% roztwór białka jaja kurzego
0,01M roztwór NaCl
Do dwóch probówek odmierzono po 1 ml roztworu azotanu srebra; do jednej próby dodano
1 ml roztworu białka, a do drugiej – tę samą ilość wody. Po wymieszaniu, wprowadzono do każdej
probówki roztwór chlorku sodu. Dokonano następujących obserwacji: Po dodaniu chlorku sodu
do obu probówek w próbce z wodą wydzielił się biały osad, natomiast w próbie z białkiem jaja
kurzego roztwór pozostał klarowny. , było to spowodowane tym, że w probówce zawierającej
białko można było zaobserwować działanie ochronne koloidów białkowych. Chlorek srebra to
związek hydrofobowy. Białko pełni funkcję stabilizatora i otacza hydrofobowe cząsteczki AgCl
narzucając im hydrofilowy charakter. W probówce z wodą wytrącił się hydrofobowy osad AgCl,
co świadczy o braku obecności koloidu hydrofilowego.
2.3. Amfoteryczność białek
Strącanie białek za pomocą kationów i anionów
Materiały i sposób wykonania doświadczenia:
10% siarczan miedzi CuSO4
10% octan ołowiu (CH3COO)Pb
10% wolframian sodu NaWO4
1% roztwór białka jaja kurzego o pH 8,0; 4,7; 3,0
Do trzech probówek odmierzono po 2 ml roztworu białka jaja kurzego o odpowiednim pH.
Do poszczególnych probówek dodano kroplami, unikając nadmiaru odczynnika w próbie (!),
wymienione roztwory soli. Obserwacje przedstawiono w Tabeli 1., stosując znaki: „+” (jeśli
powstanie osad soli); „+ - ” lub „-” (w przypadku gdy nie pojawi się osad soli).
Tabela 1. Strącanie białek za pomocą kationów i anionów- dokonane obserwacje.
Odczynnik
1% roztwór białka jaja kurzego
pH=8,0
pH=4,7
pH=3,0
10% siarczan miedziowy
+
-
-
10% octan ołowiu (II)
+
-
-
10% wolframian sodowy
-
_-
_+