pcr klasyczny

PCR klasyczny i real-time
Kurs doskonalący
Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP
Po co wymyślono PCR
1. PCR służy do namnażania DNA do dalszych badań.
2. PCR przystosowano do tego, by modyfikować DNA:
wprowadzać miejsca restrykcyjne, mutacje, tworzyć geny fuzyjne,
itd.
3. PCR przystosowano do tego, by od razu, podczas namnażania
DNA, otrzymać odpowiedź na zadane pytania, np. jaki jest poziom
ekspresji genu, czy w genie znajduje się poszukiwana
odmiana genetyczna/mutant, itd.
4. Matrycą w PCR jest zawsze DNA, ale materiałem wyjściowym
może być RNA (PCR należy poprzedzić procesem odwrotnej
transkrypcji).
Odwrotna transkrypcja
Zasada działania PCR
Zasada działania PCR
Amplifikacja ekspotencjalna może nastąpić tylko w początkowych
etapach PCR, kiedy występuje nadmiar starterów, dNTP, itd.
W następnych fazach namnażania proporcje DNA – odczynniki
zmieniają się, a reakcja nie jest już tak wydajna. Detekcja DNA
na żelu możliwa jest najczęściej wtedy, gdy reakcja wejdzie
w fazę plateau.
Zasada działania PCR
PCR może być dwufazowy
(denaturacja + hybrydyzacja i wydłużanie razem)
Projektowanie starterów
1. Można użyć darmowego programu komputerowego.
2. Można zaprojektować samemu:
• Minimalna długość startera 17 (raczej więcej),
• Para starterów musi mieć zbliżone temperatury topnienia Tm;
gruba metoda liczenia Tm: na każdą A lub T – po 2oC, na każdą
C lub G – po 4oC,
• Na końcu 3’ powinny być (ale nie muszą) G lub C,
• Zawartość G i C powinna wynosić 40-50% (ale nie zawsze jest to
możliwe – nie jest kluczowe),
• Startery mogą być zaprojektowane tak, by wprowadzić do DNA
miejsce restrykcyjne albo mutację.
Tradycyjny vs real time PCR
rycina pokazuje, że na żelu agarozowym trudno jest
zobaczyć nawet 5-krotną różnicę w ilości DNA
Tradycyjny vs real time PCR
PCR czasu rzeczywistego (real time PCR) służy do określania
ekspresji genów, do porównywania stopnia metylowania genów, itd.
(badania ilościowe)
Real time PCR
Wysoka powtarzalność wyników:
Seria 5-krotnych rozcieńczeń
każdy kolor reprezentuje reakcję matrycy. Zdecydowana różnica
z taką samą ilością matrycy
w fazie ekspotencjalnej, plateau
osiągane w prawie tym samym
momencie
Real time PCR
Nomenklatura real time PCR
• Baseline is defined as PCR cycles in which a reporter fluorescent
signal is accumulating but is beneath the limits of detection of
the instrument.
• ΔRn is an increment of fluorescent signal at each time point.
The ΔRn values are plotted versus the cycle number.
• Threshold is an arbitrary level of fluorescence chosen on the
basis of the baseline variability. A signal that is detected above
the threshold is considered a real signal that can be used to
define the threshold cycle (Ct PUNKT ODCIĘCIA) for a sample.
Threshold can be adjusted for each experiment so that it is in the
region of exponential amplification across all plots.
• Ct is defined as the fractional PCR cycle number at which the
reporter fluorescence is greater than the threshold. The Ct is a
basic principle of real time PCR and is an essential component in
producing accurate and reproducible data.
Real time PCR
Stem-loop PCR (badania miRNA)