wprowadzenie do chemii białek - Zakład Biochemii Analitycznej
advertisement
WPROWADZENIE DO CHEMII BIAŁEK Praca zbiorowa pod redakcja Adama Dubina Wydziału Biotechnologii UJ Kraków 2003 2 Spis treści Przedmowa Rozdział 1 Wstęp - Struktura białek: A. Dubin i B. Władyka Rozdział 2 Wprowadzenie do metod oczyszczania białek: A. Dubin Rozdział 3 Chromatografia powinowactwa i techniki pośrednie: M. Rąpała-Kozik Rozdział 4 Proteomika: J. Silberring Rozdział 5 Spektrometria masowa: J. Silberring i M. Smoluch Rozdział 6 Chemiczna modyfikacja białek: A. Kozik Rozdział 7 Analiza składu aminokwasowego białek i peptydów: P. Mak Rozdział 8 Fragmentacja białek – mapy peptydowe: A. Dubin i B. Władyka Rozdział 9 Mikrosekwencjonowanie białek i peptydów: P. Mak Rozdział 10 Synteza peptydów: A. Dubin Rozdział 11 Przykładowe ćwiczenia z wybranych technik chemii białek: P. Mak Dodatek 3 Przedmowa Zapoczątkowanie w 1950 roku prac nad opracowaniem metody sekwencjonowania białek przez P. Edmana, sekwencja insuliny w 1951 roku przez F. Sangera, opracowanie syntezy peptydów przez R.B. Merrifielda w 1962 roku oraz prace H. Neuratha to początek nowoczesnej chemii białek. Wczesne prace Neuratha przypadały na lata w których rozpoznano białka jako makrocząsteczki o zdefiniowanej aminokwasowej sekwencji i trójwymiarowej strukturze i badania te były milowym krokiem w wyjaśnieniu struktury przeciwciał i szeregu enzymów proteolitycznych jak i określenia zmian strukturalnych, które zachodzą podczas denaturacji białek. W 1994 roku H. Neurath w załoŜonym przez siebie czasopiśmie Protein Science [3(1994)1734-1739] udowadniał, Ŝe nadchodzi druga, złota era enzymologii co moŜna teŜ rozumieć jako okres dalszego rozwoju metod chemii białek. Rzeczywiście, zakończenie etapu sekwencjonowania ludzkiego genomu [Nature 409(2001) 745-964] doprowadziło do ponownego zainteresowania chemią białek poprzez dyskusję nad koniecznością uruchomienia programu zwanego pod nazwą angielską Human Proteome Project czyli projektu, którego celem byłaby kompleksowa analiza jakościowa i ilościowa oraz porównanie duŜych zbiorów białkowych. Jest to obecnie moŜliwe dzięki dopracowaniu metod rozdziału, identyfikacji oraz analizy porównawczej takich jak 2D-elektroforeza, spektrometria masowa MALDI-TOF czy nanochromatografia. Przygotowaną monografią naleŜy traktować jako wprowadzenie do metod chemii białek. Jest ona przeznaczona przede wszystkim dla studentów biochemii, biotechnologii i chemii biologicznej oraz dla osób rozpoczynających pracę z zakresu oczyszczania oraz charakterystyki fizykochemicznej, modyfikacji chemicznej czy analizy struktury pierwszorzędowej białek i peptydów. Obejmuje ona swoim zakresem ogólny przegląd metod oczyszczania białek ze szczególnym zwróceniem uwagi na chromatografię powinowactwa; omawia wybrane metody chemicznej modyfikacji białek, analizę składu aminokwasowego, przygotowanie map peptydowych oraz oznaczenie sekwencji aminokwasowej peptydów by wreszcie scharakteryzować róŜne warianty spektrometrii masowej w aspekcie zastosowania do badania białek i peptydów. Rozdział chemicznej modyfikacji białek oraz appendix obejmuje przykładowe i sprawdzone w naszych laboratoriach przepisy oznaczeń i analiz które mogą być wykorzystane w praktyce badawczej lub jako ćwiczenia specjalistyczne. Mamy nadzieję, Ŝe ta jedyna w polskim piśmiennictwie pozycja poświęcona chemii białek będzie pomocna dla osób stawiających pierwsze kroki w zakresie szeroko pojętej proteomiki. Autorzy 4 Rozdział 1 Struktura białek – wstęp Białka pełnią kluczową rolę we wszystkich procesach biologicznych determinując układ i kierunek przekształceń chemicznych w Ŝywych komórkach. Dodatkowo pośredniczą one w wielu innych funkcjach takich jak transport, magazynowanie, ruch, ochrona immunologiczna, wzrost i róŜnicowanie czy wreszcie stanowią materiał budulcowy podtrzymujący mechanicznie struktury organizmu. RóŜnorodność funkcji białek wynika z olbrzymiej liczby odmiennych struktur przestrzennych jakie mogą one przyjmować poniewaŜ funkcja białek jest następstwem ich struktury. Białka są złoŜonymi makrocząsteczkowymi polimerami zbudowanymi z aminokwasów, które są kolejno kowalencyjnie powiązane wiązaniami amidowymi zwanymi wiązaniami peptydowymi. KaŜda cząsteczka białka ma ściśle określoną ilość podstawowych jednostek strukturalnych, aminokwasów oraz ściśle określoną ich liniową kolejność - sekwencję, czyli strukturę pierwszorzędową. W białkach powszechnie występuje 20 róŜnych aminokwasów, ale szkielet aminokwasowy tego samego białka moŜe zawierać wiele potranzlacyjnych modyfikacji, które mogą być powodem heterogenności tzn. róŜnic w wielkości, ładunku i funkcji. Dla kontrastu struktura DNA budowana jest tylko przez cztery róŜne nukleotydy, które występują parami. Sprawia to, Ŝe jest ona relatywnie prosta, regularna i przewidywalna. KaŜdy aminokwas zawiera centralny atom węgla oznaczany jako węgiel α do którego dołączone są cztery grupy: zasadowa aminowa - NH2, kwasowa karboksylowa - COOH, atom wodoru i łańcuch boczny R róŜny dla róŜnych aminokwasów. Rysunek1-1: Schematyczna wersja aminokwasu. Tetraedryczne ułoŜenie czterech róŜnych podstawników wokół węgla α nadaje aminokwasom charakter związków optycznie czynnych. Białka są zbudowane wyłącznie z L-aminokwasów. 5 W roztworze o obojętnym pH aminokwasy występują w formie zjonizowanej jako jony obojnacze (dwubiegunowe) z protonowaną grupą aminową NH3+ karboksylową COO - i zjonizowaną grupą , przy czym w roztworze kwaśnym cofa się dysocjacja grupy karboksylowej, a w zasadowym grupy aminowej. Jedynie struktura proliny róŜni się znacznie od innych aminokwasów poniewaŜ jej łańcuch boczny R jest powiązany z azotem i z węglem α . Technicznie więc prolina jest raczej imino (-NH-) niŜ amino (-NH2) kwasem. W zaleŜności od polarności i ładunku łańcucha bocznego R, amionokwasy moŜna podzielić na: -niepolarne, hydrofobowe (alanina, leucyna, isoleucyna, valina i prolina z alifatycznym łańcuchem R oraz fenyloalanina i tryptofan z aromatycznym R, i jeden aminokwas zawierający siarkę - metionina); -polarne, nienaładowane (seryna, treonina i tyrozyna zawierające grupę hydroksylową, asparagina i glutamina zawierające karboksyamid oraz cysteina z ugrupowaniem –SH. To tej grupy zalicza się teŜ glicynę choć atom wodoru nie wywołuje polarności jej cząsteczki); -polarne, naładowane ujemnie (kwas asparaginowy i glutaminowy zawierające dodatkową grupę karboksylową w łańcuchu bocznym); -zasadowe, naładowane dodatnio (lizyna zawierająca dodatkową grupę aminową w łańcuchu bocznym zwaną ε aminową, arginina ze swoją naładowaną grupą guanidynową i histydyna z protonowanym pierścieniem imidazolu). Tabela 1-1: Aminokwasy występujące w białkach. Alanina A, Ala Masa (-masa H2O na wiązanie peptydowe) 71,079 Arginina R, Arg 156,188 HN=C(NH2)-NH-(CH2)3- 5,22 Asparagina N, Asn 114,104 H2N-CO-CH2- 4,53 Kwas asparaginowy D, Asp 114,089 HOOC-CH2- 5,22 Cysteina C, Cys 103,145 HS-CH2- 1,82 Glutamina Q, Gln 128,131 H2N-CO-( CH2)2- 4,11 Kwas glutaminowy E, Glu 129,116 HOOC-( CH2)2- 6,26 Glicyna G, Gly 57,052 H- 7,10 Histydyna H, His 137,141 Nazwa aminokwasu Symbol Łańcuch boczny Częstość występowan ia (%) CH3- 7,49 N=CH-NH-CH=C- CH2- 2,23 6 Izoleucyna I, Ile 113,160 CH3- CH2-CH(CH3)- 5,45 Leucyna L, Leu 113,160 (CH3)2-CH- CH2- 9,06 Lizyna K, Lys 128,170 H2N- (CH2)4- 5,82 Metionina M, Met 131,199 CH3-S-( CH2)2- 2,27 Fenyloalanina F, Phe 147,177 C6H5- CH2- 3,91 Prolina P, Pro 97,117 Seryna S, Ser 87,078 HO- CH2- 7,34 Treonina T, Thr 101,105 CH3-CH(OH)- 5,96 Tryptofan W, Trp 186,213 C6H5-NH-CH=C- CH2- 1,32 Tyrozyna Y, Tyr 163,176 4-OH-C6H5- CH2- 3,25 Walina V, Val 99,133 -N-( CH2)3-CH- 5,12 6,48 CH3-CH (CH2)- 1.1. Cztery poziomy struktury białek Struktura białek moŜe być rozpatrywana na kilku róŜnych poziomach z których kaŜdy następny jest oparty na poprzednim i od niego zaleŜny. Struktura pierwszorzędowa określa sekwencję (kolejność) aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym; drugorzędowa opisuje wzajemne przestrzenne ułoŜenie reszt aminokwasowych sąsiadujących ze sobą w sekwencji liniowej; trzeciorzędowa odnosi się do powiązań przestrzennych reszt aminokwasowych oddalonych od siebie w sekwencji liniowej oraz takie ich ułoŜenie które stabilizowane jest mostkami disiarczkowymi. W białkach składających się z więcej niŜ jednego łańcucha polipeptydowego (podjednostki) moŜna jeszcze mówić o strukturze czwartorzędowej opisującej wzajemne ułoŜenie podjednostek i rodzaj ich kontaktu. Rysunek 1-2: Cztery poziomy organizacji struktury białek: struktura A) pierwszorzędowa, B) drugorzędowa, C) trzeciorzędowa, D) czwartorzędowa. 7 1.1.1. Struktura pierwszorzędowa Kowalencyjne wiązania które łączą kolejne reszty aminokwasowe w łańcuch polipeptydowy białek nazywamy wiązaniami peptydowymi. JeŜeli α karboksylowa grupa jednego aminokwasu kondensuje z α aminową grupą drugiego aminokwasu z utratą cząsteczki wody to powstaje amidowe wiązanie pomiędzy karbonylem grupy (C=O) jednego aminokwasu i iminową grupą (-N-H) drugiego. Wiązanie amidowe łączące cząsteczki aminokwasów w chemii peptydów i białek nosi nazwę wiązania peptydowego. Powstaje ono w wyniku połączenia węgla grupy karboksylowej aminokwasu z azotem grupy aminowej kolejnego. Wiązanie to dzięki polarnej strukturze mezomerycznej jest wiązaniem częściowo podwójnym, co wyraŜa się skróceniem połączenia C-N w peptydach w porównaniu z długością tego połączenia w innych związkach organicznych . Ten częściowo podwójny charakter wiązania C-N ogranicza swobodną rotację i powoduje, Ŝe atomy bezpośrednio połączone z azotem i karbonylowym atomem węgla mają tendencję do układania się w jednej płaszczyźnie. Nie oznacza to, Ŝe wszystkie atomy węgla i azotu w łańcuchu peptydowym są ułoŜone w jednej płaszczyźnie, gdyŜ przy pozostałych wiązaniach C-N w łańcuchu istnieje swobodna rotacja. wiazanie peptydowe H R H H N C + H N C R O H R O H R - Rysunek 1-3:. Izomeryzacja wiązania peptydowego. Oprócz wiązania peptydowego kolejnym waŜnym wiązaniem kowalencyjnym mającym wpływ na strukturę białka jest wiązanie disiarczkowe (cystynowe). Powstaje ono przez utlenienie grup sulfhydrylowych dwóch reszt cysteiny. Mostki disiarczkowe są główną siłą, która stabilizuje strukturę białka po uzyskaniu przez nie natywnej konformacji. W niektórych białkach utrzymują one razem róŜne łańcuchy polipeptydowe jak w przypadku insuliny, gdzie łańcuchy A i B połączone są dwoma mostkami disiarczkowymi. Często wewnątrzcząsteczkowe mostki –S-S- stabilizują łańcuch polipeptydowy czyniąc białko mniej podatnym na degradację. Tu przykładem mogą być toksyny jadu węŜy i polipeptydowe 8 inhibitory proteaz. Mostki disiarczkowe tworzą się spontanicznie gdy grupy sulfhydrylowe znajdą się w odpowiedniej bliskości w sensie struktury trzeciorzędowej. Rysunek 1-4: Tworzenie mostków disiarczkowych. W utrzymaniu prawidłowej struktury białka udział mają teŜ wiązanie niekowalencyjne takie jak wiązania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne czy interakcje hydrofobowe. Wiązania wodorowe utworzone pomiędzy resztami w łańcuchach bocznych peptydowo związanych aminokwasów, atomami wodoru i tlenu w samych wiązaniach peptydowych oraz między resztami polarnymi na powierzchni białek a cząsteczkami wody odgrywają waŜną rolę w utrzymaniu struktury drugo- i trzeciorzędowej. PoniewaŜ sekwencja reszt aminokwasowych w białku zawiera podstawową informację która jest zasadniczo odpowiedzialna za jego strukturę i funkcję, tak więc określenie struktury pierwszorzędowej (czyli kolejności reszt aminokwasowych) białek jest bardzo waŜnym aspektem działu biochemii jakim jest chemia białek. 1.1.2. Struktura drugorzędowa Uderzającą cecha natywnych białek jest ich wyraźnie określona struktura przestrzenna (konformacja), która stanowi o ich aktywności biologicznej. Struktura drugorzędowa jest określona poprzez chemiczne oddziaływania (głównie wiązań wodorowych) reszt 9 aminokwasowych z innymi aminokwasami znajdującymi się w pobliŜu. Strukturę drugorzędową identyfikuje się głównie jako substruktury typu helisy α lub struktury harmonijkowej β. Helisa α ma kształt cylindra, gdzie ciasno skręcony łańcuch główny polipeptydu tworzy wewnętrzną część cylindra, a łańcuchy boczne aminokwasów wystają na zewnątrz w ułoŜeniu helikalnym (śrubowym). Helisę α stabilizują wiązania wodorowe między grupami NH i CO głównego łańcucha przy czym grupa CO kaŜdego aminokwasu wiąŜe się z grupą NH aminokwasu zajmującego się w sekwencji liniowej pozycję wysuniętą do przodu o 4 reszty aminokwasowe co powoduje, Ŝe na jeden obrót helisy przypada 3,6 reszt aminokwasowych. Teoretycznie, helisy mogą być zarówno prawo- jak i lewoskrętne, ale dla L-aminokwasów występujących w białkach są zawsze prawoskrętne. W strukturze harmonijki β, łańcuch polipeptydowy jest całkowicie rozciągnięty w odróŜnieniu do ciasno upakowanego w helisie α. Harmonijkę β stabilizują wiązania wodorowe pomiędzy grupami CO - NH naleŜącymi do odrębnych łańcuchów polipeptydowych, przy czym sąsiadujące łańcuchy polipeptydowe mogą być ułoŜone w jednym kierunku (harmonijka równoległa) lub w przeciwnych kierunkach (harmonijka antyrównolegla). Dodatkowo, we większości białek posiadających cząsteczki ściśle upakowane o globularnych kształtach powstałych wskutek zmian kierunku łańcucha polipeptydowego istnieje element strukturalny zwany zwrotem β. 1.1.3. Struktura trzeciorzędowa Struktura to odnosi się do powiązań przestrzennych reszt aminokwasowych oddalonych od siebie w sekwencji liniowej oraz takie ich ułoŜenie, które stabilizowane jest mostkami disiarczkowymi. Oczywiście zachodzi bardzo ścisłe powiązanie pomiędzy strukturą drugo- i trzeciorzędową i nadal nie są wyjaśnione wszystkie aspekty zwijania białek choć modelowanie molekularnej pozwala przewidywać strukturę trzeciorzędową polipeptydów z duŜym przybliŜeniem. Poznano struktury setek białek dzięki badaniom krystalograficznym i spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego. Poziom organizacji jest określony przez niekowalencyjne oddziaływania pomiędzy strukturami helikalnymi i harmonijkowymi w powiązaniu z oddziaływaniami łańcuchów bocznych i rdzenia łańcucha polipeptydowego, unikalnymi dla danego białka. Oddziaływania te są róŜnorakiej natury od hydrofobowych, jonowych, van der Waalsa do wiązań wodorowych. Zwykle, struktura ta jest stabilizowana tworzonymi mostkami disiarczkowymi. O końcowej pofałdowanej strukturze (konformacji), którą przybiera łańcuch polipeptydowy decydują względy energetyczne i z reguły ma ona najniŜszą energię swobodną. 10 1.1.4. Struktura czwartorzędowa Wiele białek występuję w roztworach w formie agregatów dwu lub więcej łańcuchów polipeptydowych, identycznych jak np. dla inhibitora proteinaz alfa-2-makroglobuliny z osocza ludzkiego (cztery podjednostki) lub róŜnych jak np. dla ludzkiej hemoglobiny (dwie podjednostki α i dwie β). Podjednostki te oddziaływują często ze sobą róŜnymi siłami np. w makroglobulinie 2 identyczne podjednostki oddziaływują kowalencyjnie tworząc mostki disiarczkowe, a następnie takie dimery łączą się wiązaniami hydrofobowymi dając tetramer. W hemoglobinie są to oddziaływania mieszane jonowo-hydrofobowe. W obu przypadkach dopiero powstanie takiej struktury przestrzennej potęguje efekt biologiczny białka. 1.2. Literatura 1. Stryer L.: Biochemia. Wydawnictwo PWN-Warszawa 1997. 2. Branden C., i Tooze J.: Introduction to protein structure Gerland Publishing, Inc. New York – London 1001. 3. Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., i Rodwell V.W.: Biochemia Harpera. Wydawnictwo Lekarskie PZWL 1998. . Rozdział 2 Wprowadzenie do metod oczyszczania białek 2.1. Ogólna strategia oczyszczania białek Obecnie dostępnych jest wiele opracowań opisujących szczegółowo poszczególne metody izolacji i oczyszczania białek, przygotowania mediów chromatograficznych oraz obszernych opisów zastosowanej aparatury dlatego w tej monografii ten problem zostanie potraktowany jedynie skrótowo. Więcej uwagi natomiast zostanie poświęcone temu jak przygotować materiał badawczy i jak dobrać dostępne metody by osiągnąć zamierzony cel. Spróbujemy odpowiedzieć na najczęściej nasuwające się pytania. Oczyszczanie białek jest zwykle procesem wieloetapowym wykorzystującym wiele róŜnych ich własności biochemicznych i biofizycznych, takich jak kształt, masa, stęŜenie, rozpuszczalność, ładunek czy hydrofobowość. Za dobra strategię oczyszczania białek uznaje się taką, która w stosunkowo krótkim czasie, przy duŜej wydajności oraz zachowaniu aktywności oczyszczanego białka prowadzi do wydajnego maksymalnego usuniecia zanieczyszczających składników. Nie ma z góry określonej procedury określonej dla 11 oczyszczanego nieznanego białka, a sugestie muszą być kaŜdorazowo weryfikowane doświadczalnie. W zaleŜności od celów i potrzeb dla których przystępujemy do izolowania białka, dobieramy źródło izolacji, metodę ekstrakcji i oczyszczania. Bardzo waŜny więc jest zatem etap opracowania strategii pozyskiwania i oczyszczania białka. Pierwszym wstępnym etapem jest zebranie dostępnych informacji o białku, którego oczyszczanie chcemy zaplanować lub o białkach homologicznych. Szczególnie przydatne będą informacje o parametrach fizykochemicznych takich jak np. punkt izoelektryczny czy masa cząsteczkowa, budowy: skład aminokwasowy, obecność podjednostek i sposób ich powiązania, zawartość komponenty cukrowej czy lipidowej oraz ewentualne własności biochemiczne, które moŜna wykorzystać do specyficznego i w miarę taniego, prostego, jakościowego oraz ewentualnie ilościowego oznaczania tego białka w mieszaninie. Kolejny etap to zastanowienie się ile rzeczywiście materiału potrzebujemy do badań, czy chodzi nam o proces analityczny czy teŜ preparatywny oraz odpowiedni dobór materiału wyjściowego z którego mamy zamiar pozyskać białko. Zwykle nie jest wystarczająco doceniony ten etap pomimo Ŝe to właśnie to on moŜe być podstawą sukcesu całego projektu badawczego, szczególnie przy izolowaniu preparatywnym. Materiał wyjściowy przeznaczony do ekstrakcji powinien spełniać najwięcej warunków takich jak: dostępność, zasobność w interesujący składnik, stabilność, mała zawartość składników o podobnych do izolowanego składnika własności oraz niski koszt. Zobrazujmy to następującym przykładem. JeŜeli mamy zamiar otrzymać np. 100 mg alfa-1-antychymotrypsyny, która występuję w ludzkim osoczu prawidłowym w ilości 0,20 mg/ml, to przy zastosowaniu 4 stopniowej procedury izolowania tego białka przy wydajności całkowitej procesu 20 % musielibyśmy zuŜyć na ten cel około 2,5 l plazmy. Taką ilość plazmy moŜna jednorazowo pozyskać od co najmniej 8 indywidualnych dawców, nie wspominając o trudnościach i wysokich kosztach przedsięwzięcia. Tą samą ilość białka moŜna natomiast otrzymać juŜ z 500 ml płynu wysiękowego usuwanego często od jednego pacjenta z ostrym stanem zapalnym opłucnej. Tak więc często źródło materiału wyjściowego opisane w literaturze moŜe być z powodzeniem zastąpione przez inne lepiej spełniające warunki wstępnej oceny. Następne nasuwające się pytanie to: czy oczyszczane białko powinno zachować swoją aktywność biologiczną? Nie jest na przykład konieczne potrzebne aktywne biologicznie białko gdy ma być ono uŜyte jedynie jako antygen do przygotowania przeciwciał, lub gdy chcemy wyznaczyć jedynie jego masę cząsteczkową czy sekwencję pierwszorzędową. JeŜeli zaleŜy nam na otrzymaniu najaktywniejszego biologicznie preparatu to w pierwszym rzędzie naleŜy określić warunki w których interesujące nas białko jest najbardziej stabilne, tak by 12 warunki te zastosować następnie w procesach ekstrakcji, oczyszczania, zagęszczania i przechowywania białka. Zwykle jest konieczny kompromis pomiędzy warunkami największej stabilności białka, a warunkami pozwalającymi na jego wydajną izolację. Do róŜnych czynników często znacząco wpływających na aktywność biologiczną białek naleŜą: temperatura, pH, rodzaj uŜytych buforów czy rozpuszczalników organicznych, obecność detergentów, czynników chaotropowych i redukujących, jony metali i ich chelatory, niekontrolowana proteoliza oraz czas i warunki oczyszczania i przechowywania. WaŜne pytanie na które naleŜy odpowiedzieć jeszcze w trakcie planowania etapów oczyszczania białka jest teŜ to jaka rzeczywiście czystość białka jest konieczna do badań które zamierzamy wykonać (kryteria czystości białek patrz rozdział 2.7). Na przykład, dla uzyskania przeciwciał monoklonalnych, czy przeprowadzenia oznaczeń kinetycznych oczyszczanego enzymu wystarczy czasem czystość 50%, szczególnie jeŜeli zanieczyszczenia nie zawierają aktywności kompetycyjnej, podczas gdy 95% czystości konieczne będzie dla przygotowania przeciwciał poliklonalnych czy teŜ oznaczenia sekwencji aminokwasowej, a 99% wymagane jest dla oznaczenia składu aminokwasowego czy uŜycia oczyszczonego białka jako standardu. Oczywiście znacznie prościej jest oczyścić z duŜą wydajnością białko do 95% czystości niŜ usunąć te dodatkowe 5 % zanieczyszczeń. Często taki dodatkowy stopień doczyszczający powoduje inaktywację białka i przy znacznym spadku końcowej wydajności oczyszczania prowadzi teŜ do spadku jego aktywności biologicznej. Tak więc w przypadku gdy tak wysoka czystość białka nie jest konieczna dla wykonania planowanego eksperymentu ten dodatkowy proces jest niepotrzebną stratą czasu, funduszy i energii. Wstępna strategia oczyszczania białka obejmuje cztery podstawowe etapy: Zebranie informacji o białku I Ustalenie zapotrzebowania I Ustalenie aktywności biologicznej I Ustalenie wymaganej czystości 13 2.2. Wstępne przygotowanie materiału biologicznego PoniewaŜ źródłem białek są najczęściej narządy i tkanki zwierzęce lub roślinne, płyny ustrojowe albo teŜ zawiesiny komórkowe pierwszym etapem izolowania jest uwalnianie białek do roztworu, czyli ekstrakcja prowadzona zwykle poprzez rozbicie komórek na skutek zastosowania mechanicznego, chemicznego lub osmotycznego szoku. Jest to stosunkowo łatwe zadanie w przypadku miękkich tkanek czy komórek zwierzęcych oraz dla białek rozpuszczalnych w buforowanych roztworach wodnych, ale bardziej skomplikowane przy tkankach roślinnych czy komórkach bakteryjnych, szczególnie gdy interesujące białka są hydrofobowe i stanowią integralną część błony. Zagadnienie izolowania i oczyszczania błonowych, hydrofobowych białek stanowi odrębne zagadnienie i nie będzie tu omawiane. Zainteresowanego Czytelnika odsyłamy do monografii von Jagow i Schägger „A practical guide to membrane protein purifiocation”, Academic Press 1994. Istotnym z punktu widzenia wydajnego odzysku aktywnego biologicznie materiału jest odpowiedni dobór warunków ekstrakcji. NaleŜy więc określić warunki w których interesujące nas białko jest stabilne i tak dobrać ekstrakcję by uzyskać najefektywniejszy odzysk. Zwykle konieczny jest kompromis pomiędzy tymi dwoma parametrami. Czynnikami wpływającymi na wydajną ekstrakcje są przede wszystkim: - temperatura i pH (zwykle obniŜenie temperatury jest konieczne ze względu na stabilność izolowanego białaka ale wpływa niekorzystnie na szybkość ekstrakcji) - rodzaj uŜytych soli buforujących i ewentualnie dodatek detergentów (typowe detergenty patrz rys.2-1) - uŜycie czynników chaotropowych (czynniki te pomagają białkom pozostać w środowisku wodnym, przy jednoczesnym osłabieniu oddziaływań hydrofobowych moŜna je więc czasem stosować wymienne za detergenty przy jednoczesnym łatwym ich usuwaniu z ekstraktu poprzez dializę. Własności takie wykazuje z substancji organicznych np. mocznik i chlorowodorek guanidyny, ale teŜ aniony znajdujące się po prawej stronie serii Hofmeistera (Cl-, Br-, I- czy CNS-) - czynniki redukujące (poniewaŜ często izolowane białka mają wyeksponowane grupy tiolowe, które z łatwością ulegają utlenianiu często konieczne jest zachowanie w buforze ekstrakcyjnym warunków redukujących poprzez dodatek ditiotreitolu czy 2- merkaptoetanolu w stęŜeniu 1-20 mM) - jony metali i ich chelatory (często obecność jonów wapnia czy magnezy jest niezbędna do zachowania aktywności biologicznej białka, ale w większości wypadków obecność jonów 14 metali cięŜkich prowadzi do jej drastycznego spadku. Ten ostatni problem moŜna uniknąć poprzez dodatek do buforu ekstrakcyjnego chelatorów takich jak np. EDTA-Na2 ( sól sodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego) w stęŜeniu 5-25 mM) - inhibitory proteolityczne oraz czynniki bakteriostatyczne (poniewaŜ nienaruszone komórki posiadają składniki destrukcyjne, które są zwykle oddzielone w nienaruszonej komórce od docelowych substratów przegrodami wewnątrzkomórkowymi, przy przygotowaniu ich ekstraktu niszcząc te naturalne przegrody doprowadzamy do wydostania się np. enzymów proteolitycznych i ich kontaktu z innymi składnikami komórki. By zapobiec destrukcyjnemu działaniu tych enzymów ekstrakcję prowadzi się w zwykle w niskiej temperaturze często dodając do ekstrakcyjnego buforu mieszaniny niskocząsteczkowych inhibitorów. Mieszanina inhibitorów jest tak dobrana by hamować enzymy proteolityczne czterech klas (serynowe, cysteinowe, aspartylowe i metaloproteinazy). Typowy skład takiego koktajlu to: 2 mM fenylometylosulfono fluorek (PMSF) - inhibitor serynowych proteaz; 1 mM E-64 (L-trans-epoksybursztynylo-Lleucylamido-(4-guanidino) butan - inhibitor proteinaz cysteinowych; 5 ug/ml pepstatyny A - inhibitor proteinaz aspartylowych i 5 mM EDTA-Na4 - inhibitor metaloproteinaz. Najlepszą metodą uniknięcia infekcji bakteryjnej będącej często źródłem enzymów proteolitycznych jest stosowanie jałowych roztworów i naczyń co jednak nie zawsze jest moŜliwe. W takiej sytuacji naleŜy rozwaŜyć moŜliwość zastosowania czynników bakteriostatycznych takich jak azydek sodu (0,01%), n-butanol (1%) czy nawet zastosować antybiotyki). PrzewaŜnie białka rozpuszczalne ekstrahuje się do 50 mM buforu o pH 7,0-7,5, często zawierającego NaCl (0,1 M); EDTA (5 mM); 2-merkaptoetanol (5mM) lub ditiotreitol (1 mM) z dodatkiem inhibitorów proteaz. Z metod stosowanych do dezintegracji komórek naleŜy wymienić następujące: - homogenizatory (tłokowe, noŜykowe, młynkowe, wysokociśnieniowe tzw. French press, ultradźwiękowe) - zamraŜanie i rozmraŜanie - szok rozpuszczalnikowy spowodowany rozpuszczalnikami organicznymi lub szok pH - dehydratacja. 15 Rysunek 2-1: Typowe detergenty. 16 Często stosuje się celowo jedynie ograniczoną destrukcję komórki tak by zachować, w miarę nienaruszone struktury subkomórkowe oraz uniknąć ewentualnego trawienia proteolitycznego przez enzymy znajdującymi się w innym przedziale komórkowym niŜ oczyszczane białko. W takim przypadku moŜna próbować najpierw izolować frakcje subkomórkowe np. poprzez zastosowanie róŜnicowego wirowania lub wirowania w róŜnych gradientach gęstości (sacharoza, Ficoll), a później przygotować ekstrakt danej organelli komórkowej wzbogacony w oczyszczane białko. Uzyskany ekstrakt białek komórkowych powinien być w dalszej części oczyszczania traktowany w taki sposób by zapobiec procesom destabilizacji zawartych w nim białek. Taka destabilizacja prowadząca do utraty aktywności biologicznej białek moŜe być spowodowana wieloma czynnikami takimi jak: temperatura, trawienie proteazami zawartymi w homogenacie lub autotrawieniem, nieodpowiednim – ekstremalnym pH, niewłaściwym składem zastosowanego buforu, czynnikami utleniającymi etc. Często teŜ w procesie oczyszczania białka jego stęŜenie znacznie spada co tez moŜe prowadzić do jego adsorpcji do podłoŜa i utraty dobrej wydajności oczyszczania i obniŜenia aktywności właściwej. Dlatego teŜ naleŜy unikać przechowywania rozcieńczonych roztworów czystych białek, szczególnie enzymatycznych, a gdy jest to niezbędne, naleŜy stosować dodatki białka nośnikowego np. albuminy jako stabilizatora. 2.3. Technika strącania białek Jedną z najprostszych metod oczyszczania białek jest precypitacja, która polega na selektywnym wytrącaniu białek z roztworu przy zastosowaniu czynnika precypitującego, uŜytego w odpowiednim stęŜeniu i działającego w odpowiednich warunkach. Rozkład hydrofilnych i hydrofobowych reszt na powierzchni białka określa jego rozpuszczalność. Rozpuszczalność białka jest wynikiem oddziaływań polarnych z wodnym rozpuszczalnikiem, jonowych oddziaływań z solami i elektrostatycznych oddziaływań pomiędzy naładowanymi cząsteczkami. Własności rozpuszczające wodnych roztworów moŜna zmieniać poprzez zmianę siły jonowej i pH. Poprzez dodatek mieszających się z roztworami wodnymi rozpuszczalników organicznych lub polimerów moŜna tez zmieniać warunki selektywnej precypitacji. Najczęściej stosowanymi czynnikami precipitujacymi są: - sole o własnościach antychaotropowych tj. te znajdujące się po lewej stronie serii Hofmeistera (siarczan amonu, siarczan sodu). Większość białek wytraca się w granicach 40-80% soli (Tabela 2-1). 17 - rozpuszczalniki organiczne (etanol, aceton). Większość białek wytrąca się w przedziale 25-60 % rozpuszczalnika. - polimery organiczne (glikol polietylenowy PEG). Większość białek wytrąca się do 15% polimeru. Czynniki te powodują zwiększoną ekspresje hydrofobowych rejonów cząsteczki białkowej poprzez usuwanie stabilizującej otoczki dipoli cząsteczek wody, skutkiem czego staje się ona słabiej rozpuszczalna i bardziej podatna na tworzenie agregatów i wypadanie z roztworu. Takie wytrącanie jest oczywiście najbardziej wydajne jeŜeli prowadzi się je w punkcie izoelektrycznym białka. Nawet przy zastosowaniu wstępnej standaryzacji metoda ta nie wykazuje zbyt duŜej selektywności, a dodatkowo posiada ograniczenia w przypadku niskich stęŜeń białek i dlatego stosuje się ja zwykle jako wstępną metodę frakcjonowania ekstraktów, po której następują kolejne etapy oczyszczania, najczęściej techniki chromatografii cieczowej takie jak sączenie molekularne czy chromatografia hydrofobowa. Szczególnie w przypadku stosowania rozpuszczalników organicznych metoda precypitacji powinna być przeprowadzana w obniŜonej nawet do –20o C temperaturze z uwagi na denaturujące działanie tych rozpuszczalników. 18 Tabela 2-1: Zakres wysalania siarczanem amonu. 2.4. Zagęszczanie, wymiana buforu i przechowywanie białek Jedną z metod zagęszczania białek jest opisany powyŜej proces ich strącania. Zwykle wiąŜe się on jednak z koniecznością późniejszego odsalania próbki tak by moŜna było zastosować następne stopnie oczyszczania. Najlepiej jest tak zaplanować cały proces oczyszczania interesującego nas białka by uniknąć konieczności zmiany buforu, poniewaŜ zwykle jest to zabieg długotrwały powodujący często spadek aktywności właściwej oczyszczanego białka oraz spadek wydajności całego procesu oczyszczania. Zobrazujmy to przykładem. Sekwencja oczyszczania obejmująca w kolejności wytrącanie siarczanem amonu, a następnie chromatografię jonowymienna nie jest logiczna z uwagi na konieczność długotrwałego procesu dializy poprzedzającego proces chromatografii jonowymiennej. Zastosowanie jedynie chromatografii jonowymiennej prawdopodobnie doprowadzi do podobnego wyniku 19 końcowego przy jednocześnie większej wydajności procesu i uzyskaniu wyŜszej aktywności właściwej produktu. Natomiast zastosowanie sekwencji: wysalanie siarczanem amonu, chromatografia hydrofobowa jest jak najbardziej prawidłowe, poniewaŜ nie wymaga procesu długotrwałej dializy. Podobnie np. białko wytrącone glikolem polietylenowym moŜe być niemal bezpośrednio oczyszczone w procesie sączenia molekularnego, natomiast zastosowanie innych typów chromatografii wymaga procesu dializy. Zagęszczanie roztworów białek jest moŜliwe na drodze wytrącania, chromatografii jonowymiennej, ultrafiltracji czy liofilizacji. Ultrafiltrację prowadzi się zwykle w przeznaczonych do tego celu ciśnieniowych aparatach typu Amicon na specjalnych błonach półprzepuszczalnych o określonych rozmiarach por takich, które umoŜliwiają odcinanie przepuszczalności białek o określonych wielkościach. Zwykłe do zagęszczania białek stosuje się błony PM lub YM 10, 30 czy 100 zatrzymujące białka odpowiednio o dolnym limicie mas 10, 30 i 100 kD. Zagęszczanie zwykle prowadzi się pod ciśnieniem gazu obojetnego (3 atm.). Poprzez kilkakrotne zagęszczenie roztworu białka np. na membranie PM 10 i rozcieńczanie innym buforem moŜna dokonać wymiany buforu czyli teŜ przeprowadzić odsolenie roztworu białka. Proces ten, szybszy od procesu tradycyjnej dializy, prowadzić jednak moŜe do znaczniejszych strat białka, szczególnie przy pracy z rozcieńczonymi roztworami oczyszczonego białka. Przy małych objętościach i stęŜeniu białka zaleca się raczej uŜywanie ultrafiltracji na specjalnie do tego celu przygotowanych komercyjnie dostępnych zestawach do ultrafiltracji poprzez wirowanie. Inny sposób wymiany buforu w roztworach białkowych to zastosowanie sączenia molekularnego na kolumienkach wypełnionych Ŝelem o ziarnach z tak małymi średnicami kanalików wewnętrznych (porów), Ŝe nie przepuszczają białek, a pozwalają na wnikanie soli i innych substancji drobnocząsteczkowych opóźniając ich wypływ z kolumny. Do tego celu stosuje się np. kolumienki PD-10 firmy Pharmacia wypełnione Ŝelem Sephadex G-25. Ten sposób zmiany buforu jest szybki, ale wymaga niewielkiej objętości próbki na starcie i zawsze prowadzi do trzykrotnego zwiększenia jej objętości próbki po przesączeniu. Liofilizacja to proces sublimacji wody i innych rozpuszczalników pod wysoką próŜnią i w niskiej temperaturze prowadzony w celu zakonserwowania labilnego materiału biologicznego w formie odwodnionej. Proces ten przebiega zwykle w czasie kilku godzin, jeŜeli oczywiście grubość warstwy zamroŜonych roztworów wodnych białek nie przekracza 1 cm i powierzchnia parowania jest odpowiednio duŜa. Dlatego najlepiej zamraŜać roztwory na ściankach, a nie tylko na dnie probówek. Gdy warstwa zamroŜonego płynu jest większa od 1 cm to w czasie procesu liofilizacji wychładza się tylko część próbki, a reszta szczególnie na 20 dnie przy ściankach probówki ulega rozmroŜeniu i energicznie parując moŜe spowodować jej utratę poprzez wypchnięcie całej próbki na zewnątrz probówki. Oczywiście w procesie liofilizacji poza niektórymi nietrwałymi solami lub lotnymi rozpuszczalnikami (np. kwaśny węglan amonu czy metanol) większość składników buforów pozostaje wraz z białkiem w zliofilizowanym osadzie, a zwiększające się ich stęŜenie moŜe czasem być powodem utraty aktywności białka. Większość białek monomerycznych jest bardziej stabilna w przechowywaniu w stanie zliofilizowanycm niŜ w roztworze. Niektóre kompleksy białkowe, szczególnie te stabilizowane oddziaływaniami hydrofobowymi, lepiej jest przechowywać w niskiej temperaturze w obecności soli np. w 25-50% roztworach siarczanu amonu jako tzw. mokry osad. Niektóre białka enzymatyczne, niestabilne w stanie zamroŜonym (np. trombina ludzka) lepiej je przechowywać w stanie niezamroŜonym w niskiej temperaturze (-20oC) w obecności 50% gliceryny. Warunki przechowywania białka wpływają na jego stabilności i zachowanie jego aktywności biologicznej. PoniewaŜ przewaŜnie nie da się przewidzieć jakie warunki są najlepsze dla przechowywania danego białka kaŜdorazowo naleŜy to sprawdzać doświadczalnie. 2.5. Metody ilościowego oznaczania białek i peptydów Istnieje wiele metod ilościowego oznaczania białek i peptydów lecz jedynie obliczenie dokonane z dokładnie oznaczonego składu aminokwasowego jest metodą bezpośrednią. Inne metody są oparte na róŜnych załoŜeniach i zwykle są przeliczane wzg. krzywych wykonanych na białkach czy peptydach standardowych. Idealna metoda oznaczania białka powinna cechować się szybkością i łatwością wykonania, dokładnością, czułością i precyzją oraz powinna być specyficzna i wolna od interakcji z innymi niŜ białka substancjami. Oczywiście takiej metody jeszcze nie odkryto. W niniejszym opracowaniu omówimy jedynie najczęściej uŜywane metody, a to: - opartą o pomiar absorbancji w ultrafiolecie - metodę Lowry - metodę Bradford - metodę BCA - metody immunologiczne 21 2.5.1. Określanie ilości białka poprzez pomiar absorbancji w ultrafiolocie Ilościowe określenie białka w roztworze jest moŜliwe przy uŜyciu spekltrofotometru. Absorbcja promieniowania bliskiego ultrafioletu (280 nm) przez białka zaleŜy od zawartości reszt tryptofanu (W) i tyrozyny (Y) oraz w niewielkim stopniu teŜ reszt fenyloaminy (F) czy obecności mostków disiarczkowych (-S-S-) i dlatego adsorbancja roztworów o zawartości 1 mg/ml róŜnych białek róŜni się często znacznie (od wartości 4,0 dla białek wełny bogatych w tyrozynę do 0,35 dla C-1-Inhibitora plazmy ludzkiej). Dla długości fali λ = 280 nm w neutralnym środowisku stosunek absorbancji poszczególnych aminokwasów W : Y : F = 5550 : 1490 : 0,7. PoniewaŜ wartość pomiaru zaleŜy od grubości warstwy (l) absorbujacej próbki zgodnie z prawem Beera-Waltera: A (absorbancja) = ε c l (gdzie: ε- molowy współczynnik absorpcji zaleŜny od rodzaju białka; c - stęŜenie białka w molach/litr) więc przy pomiarze w w warstwie większej niŜ 1 cm naleŜy to koniecznie uwzględnić. Aby obliczyć stęŜenie musimy więc znać molowy współczynnik absorbcji badanego białka dla danego pH w którym prowadzimy pomiar, poniewaŜ współczynnik ten zaleŜy od pH. Współczynniki dla znanych białek są dostępne w literaturze, a dla nieznanego białka wielkość ta musi być albo oznaczona eksperymentalnie np. ze wzoru Scopesa poprzez pomiar absorbancji czystego roztworu białka przy dwóch długościach fali (205 i 280 nm), albo wyliczony z ponizszego wzoru: ε280 [M-1cm-1) = (5550 x ilość reszt W + 1490 x ilość reszt Y + 125 x ilość reszt C) gdzie: 5550, 1490 i 125 to odpowiednie współczynniki absorbancji odpowiednio dla reszt W, Y i C. Do pomiaru naleŜy próbkę tak rozcieńczyć by uzyskać absorbancję w zakresie wartości 0,3 bo wtedy dokładność pomiaru jest największa. Analizowana próbka oczywiście musi być klarowna więc najlepiej ją przed pomiarem przesączyć przez filtr Millipore 0,2 µm lub odwirować. Zaletą tej metody oznaczania białka jest jej prostota przy całkowitym odzysku próbki, a wadą jest to, Ŝe interferuje z innych chromoforami, narzuca konieczność określenia absorbancji właściwej i daje jedynie moŜliwość dokładnego ilościowego oznaczenia białka tylko w przypadku ich czystych roztworów. Uwaga: kwasy nukleinowe mogą dawać nawet dziesięciokrotnie większą od białek absorbancje przy λ 280 nm. Adsorbancja promieniowania dalekiego ultrafioletu (205 nm) jest powodowana głównie przez wiązanie petydowe białek przy czym maksimum tej absorbancji przypada na 190 nm. Przy tej długości fali pochłanianie promieniowania przez tlen jest jednak zbyt duŜe by moŜna było 22 łatwo przeprowadzić pomiar. Za absorbancję roztworów białek w tym rejonie ultrafioletu odpowiedzialne są reszty aminokwasów w następującym stusunku W : F : Y : H : M : R : C = 19,6 : 9,3 : 5,6 : 5,1 : 1,9 : 1,4 : 0,7. Zalety metody to jej prostota, duŜa czułość (ok. 30 x większa od oznaczania przy 280 nm) natomiast wadą jest konieczność dokładnej kalibracji spektrofotometru oraz to, Ŝe wiele składników buforów i innych związków interferuje silnie w tym rejonie. 2.5.2.Metoda Lowry i wsp. Pomimo Ŝe metoda Lowry i wsp., podobnie jak większość metod chemicznych oznaczania białek nie pozwala na określenie absolutnej ilość białka jest ona nadal jedną z najczęściej stosowanych ze względu na jej prostotę wykonania, powtarzalność i niskie koszty. Do wczesnych lat 80 tych praca Lowry i wsp., była najczęściej cytowaną pracą w naukowej literaturze biochemicznej. Metoda ta jest oparta na reakcji biuretowej. W wyniku utworzenia koordynacyjnego połączenia miedzi w dwoma przyległymi wiązaniami peptydowymi w białkach czy peptydach, powstaje w środowisku zasadowym barwny produkt soli kompleksowej, która reaguje z odczynnikiem Folin-Ciocalteau będącym mieszanina kwasów fosforowolframowy i fosforomolibdenowy. Redukcja tych kwasów do odpowiednich tlenków zarówno przez miedź związaną z białkiem jak i przez reszty tyrozyny i tryptofanu prowadzi do powstania błękitu heteropolimolibdenianu oznaczanego spektrofotometrycznie. Intensywność barwy zaleŜy nie tylko od ilości białka, ale teŜ od jego składu aminokwasowego. Tak więc zaleca się stosowanie odpowiednich wzorców oznaczanego białka. PoniewaŜ jednak w większości przypadków jest to niemoŜliwe więc stosuje się jako wzorzec albuminę i dlatego wykonane oznaczenie jest względne. Czułość tej metody w. oryginalnej mikroprocedurze przy długości fali 700 nm wynosi około 5 µg. Wadą metody jest fakt, Ŝe wiele substancji takich jak np. fenole, puryny i pirymidyny, kwas moczowy reagują z odczynnikiem Folina-Ciocalteau, a inne takie jak np. siarczan amonu, zobojętniony kwas trichlorooctowy, etanol, sacharoza, glicerol czy detergenty obniŜają intensywność barwy. 2.5.3. Metoda Bredford Obserwacja wiązania barwnika znanego pod nazwą Coomassie Brillant Blue G250 ( rys. 2-1) przez białka została wykorzystana do opracowania w 1976 r nowej wygodnej metod ich oznaczania. Wolny barwnik występuje w trzech róŜnych formach jonowych: kationowych czerwonej i zielonej o maksimum absorbancji odpowiednio przy 470 i 650 nm oraz w formie 23 niebieskiej anionowej, która wiąŜe się do białek i wykazuje maksimum absorbancji przy 590 nm. Ilość białka moŜe być oznaczana poprzez oznaczanie tej niebieskiej jonowej formy. Rysunek 2-2: Coomassie Brilliant Blue G-250. Barwnik wiąŜe się głównie do reszt argininy i słobo do reszt lizyny, histydyny, tyrozyny, tryptofanu i fenyloalaniny białek, ale nie do wolnych aminokwasów tak więc podobnie jak w metoda Lowry i wsp., barwa zaleŜeć będzie nie tylko od ilości, ale teŜ od jakości oznaczanego białka. Dodatkowo słabe wiązania van der Waalsa i oddziaływania hydrofobowe odgrywają pewną rolę we wiązaniu barwnika. Najbardziej powtarzalne wyniki otrzymuje się dla standardowej metody przy ilości białka w zakresie 20-100 µg , a w wariancie mikro- dla 1-10 µg. Zaletą metody jest trwałość odczynnika reakcyjnego, a główne wady podobne są do tych wymienionych przy metodzie Lowry i wsp., ze szczególnie silną interrakcją z detergentem typu Triton X-100. 2.5.4. Metoda BCA Kwas bicinchoninowy (BCA) został zastosowany po raz pierwszy w 1985 roku przez Smith i wsp., do oznaczania białka w oparciu o zasadę podobną do tej wykorzystanej w metodzie Lowry i wsp. Najpierw następuje konwersja Cu+2 do Cu+1 w środowisku alkalicznym, a nastepnie Cu+1 jest wykrywany przez reakcję z BCA. PoniewaŜ jednak BCA jest stabilne w alkalicznym środowisku moŜna było w tej metodzie zastosować pojedynczy odczynnik w miejsce dwustopniowej procedury stosowanej w metodzie Lowry i wsp. W wyniku reakcji powstaje purpurowe zabarwienie rozpuszczalnej soli kompleksowej, które jest oznaczane ilościowo spektrofotometrycznie przy 562 nm. 24 Rysunek 2-3: Kompleks Cu+1 z BCA. Makromolekularna struktura białka, ilość wiązań peptydowych oraz obecność czterech reszt aminokwasowych w białku (cysteina, cystyna, tryptofan i tyrozyna) to czynniki odpowiedzialne za wywoływanie barwy w reakcji z BCA. Metoda ta eliminuje konieczność precyzyjnego pomiaru czasu reakcji oraz solidnego wytrząsania w czasie dodawania odczynnika rozwijającego barwę co jest konieczne w przypadku uŜycia metody Lowry i wsp. Dodatkową zaletą w porównaniu do poprzednio omówionych metod jest to, Ŝe w szerokim zakresie stęŜeń barwa nie zaleŜy od siły jonowej buforów czy teŜ od zawartości niejonowych detergentów, mocznika czy chlorowodorku guanidyny. Wprawdzie podobnie jak poprzednie metody pomiar jest zaleŜny od obecności czynników redukujących, ale te ostatnie mogą być eliminowane z próbki poprzez strącanie białka przed pomiarem kwasem trifluorooctowym lub acetonem. Standardowa i mikro- metoda pozwalają odpowiednio oznaczać 10-100 µg i 0,51,0 µg białka, a dodatkowo przy zastosowaniu pieca mikrofalowego moŜna skrócić czas inkubacji do kilku sekund. 2.5.5. Metody immunologiczne oznaczania ilościowego białek Z ilościowych metod immunologicznych naleŜy wymienić immunodyfuzję radialne, immunoelektroforezę rakietowa, cytometria przepływowa i metod ELISA (ang. enzymelinked immunosorbent assay). W metodzie immunodyfuzji radialnej wykorzystuje się zjawisko swobodnej dyfuzji przeciwciał (Ab) i antygenu (Ag) w Ŝelu zwykle agarowym. W tym samym czasie tworzący się precypitat kompleksu Ab-Ag nie dyfunduje i w strefie równowagi powstają pierścienie precypitacyjne o średnicy uzaleŜnionej od stęŜenia antygenu. Podobnie w metodzie radialnej dyfuzji elektroforezę antygenu prowadzi się w Ŝelu 25 agarozowym zawierającym przeciwciała dla tego antygenu. Tworzące się kompleksy Ab-Ag w miejscu równowagi linie precypitacyjne kształtem przypominające rakietki, których ysokość (pole powierzchni) jest wprost proporcjonalne do stęŜenia antygenu. Poprzez zastosowanie fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał skierowanych dla badanego antygenu cytometria przepływowa moŜe być uŜyta do dokładnego określenia małych ilości antygenu w pojedynczych komórkach populacji. Daje to znaczną przewagę tej metody nad popularnie stosowane immunodetekcję za pomocą przeniesienia na membranę (immunoblotting) wymagający lizy komórek. Metody te zostały wcześniej opisane w innych wydaniach tej serii wydawniczej: Analiza instrumentalna w biochemii - 2001 (A. Kozik i wsp.), Przeciwciała monoklonalne – 2000 (J. Bereta i M. Bereta) oraz Ćwiczenia z immunologii – 1999 ( red. J. Pryjma). 2.6. Dokumentacja oczyszczania Główne metody oczyszczania białek i peptydów takie jak: Ŝelowe sączenie molekularne, chromatografie: jonowymienna, oddziaływań hydrofobowych, powinowactwa i jej pochodne oraz w wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz zostały omówione juŜ w innym wydaniu tej serii wydawniczej: Analiza instrumentalna w biochemii 2001 (A. Kozik i wsp.). Przy opracowaniu strategii oczyszczania białka wymagane jest jednak ustawienia tych metod w logiczny ciąg, który powinien doprowadzić do wydajnej izolacji i oczyszczenia do homogenności aktywnego biologicznie białka. KaŜdy kolejny etap oczyszczania musi być monitorowany poprzez pomiar całkowitej ilości białka, pomiar aktywności biologicznej oraz elektroforetyczny obraz zawartości białek w uzyskanym preparacie. JeŜeli nie ma moŜliwości określania aktywności biologicznej moŜna monitorowanie przeprowadzić poprzez oznaczanie ilości antygenu w mieszaninie ze specyficznymi przeciwciałami. Z uzyskanych danych wylicza się na kaŜdym zastosowanym stopniu oczyszczania odzysk białka całkowitego (B), odzysk całkowitej aktywności (A), aktywność właściwą oczyszczanego białka jako stosunek A/B, stopień oczyszczenia określający ile razy w danym stopniu oczyszczania zwiększyła się aktywność właściwa oczyszczanego białka oraz wydajność oczyszczania. JeŜeli wydajność jakiegoś zastosowanego stopnia oczyszczania jest niska (np. poniŜej 50%) naleŜy go zastąpić innym wydajniejszym; jeŜeli nawet wydajność oczyszczania danego stopnia jest wysoka ale stopień oczyszczania na tym etapie jest niski (np. mniejszy od czynnika 2) naleŜy ten stopień zastąpić innym. Schemat typowego oczyszczania białka przedstawiono w tabeli 2-2. 26 Tabela 2-2: Oczyszczanie elastaz (1 i 2) z ziarnistości leukocytów krwi konia. Etapy Białko Wydajność Aktywność oczyszczania całkowite białka całkowita [mg] [%] [J] Homogenat 3600 100 6400 komórkowy Ekstrakt 140 3,9 3800 ziarnistości Sephadex 9,2 0,25 1400 G-75 CMSephadex: 1,6 0,045 483 Szczyt 1 0,9 0,025 218 Sczyt 2 0,7 0,020 265 Wydajność aktywności [%] 100 Aktywność Oczyszczenie właściwa [J/mg] 1,8 1 59 27 15 22 152 84 7,5 3,4 4,1 302 242 378 167 134 210 2.7. Kryteria czystości Z metod elektroforetycznych jedynym dobrym kryterium czystości białka jest elektroforeza dwuwymiarowa obejmująca izoelektroogniskowanie w jednym kierunku i elektroforezę SDS-PAGE w drugim kierunku. Metoda ta pozwala rozdzielić białka wykazujące róŜnice nie tylko w masach cząsteczkowych, ale i w punktach izoelektrycznych. Niestety ta metoda jest pracochłonna, wymagająca specjalistycznej aparatury i nie nadaje się dla białek o skrajnych wartościach punktów izoelektrycznych (9<pI<3). Wykazanie homogenności białka w stosowanej powszechnie elektroforezie denaturującej SDS-PAGE zwykle nie wystarcza i konieczne jest potwierdzenie tego jeszcze w innym rodzaju rozdziału np. w elektroforezie natywnej PAGE lub teŜ wysokorozdzielczej chromatografii jonowymienną w systemie FPLC na kolumnie Mono Q (dla białek kwaśnych) czy Mono S (dla białek zasadowych). Dobrym przykładem potwierdzającym taka konieczność moŜe być nieudana próba wykazania heterogeniczności mieszaniny dwu białek osocza ludzkiego albuminy i alfa- antychymotrypsyny metodą SDS-PAGE, poniewaŜ białka te nie róŜnią się masą cząsteczkową. Zastosowanie natywnej elektroforezy PAGE w związku z róŜnicami w punktach izoelektrycznych tych białek wykazuje natomiast heterogeniczność mieszaniny. Brak widocznych dodatkowych prąŜków na elektrogramach SDS-PAGE i natywnym PAGE wybarwionym CBB R-250 po rozdziale 5 µg białka, moŜna uznać za 99% czysty preparat. Homogenny peptyd powinien wymywać się (w gradiencie o nachyleniu1% na minutę) z kolumy C-18 w RF HPLC jako pojedynczy, symetryczny szczyt zarówno w pH 3 jak i 7. 27 Dobrymi kryteriami homogenności białek i peptydów są teŜ oczywiście takie specjalistyczne metody jak analiza sekwencyjna czy spektrometra masowa. Literatura Literatura źródłowa 1. Rosenberg I.M.: Protein analysis and Purification. Benchtop techniques. Birkhauser, Boston-basel-Berlin 1996. 2. The protein protocols. Handbook. Red.: J.M. Walker. Humana Press 1996. 3. Protein purificatiion protocols. Red.: S. Doonan. Humana Press, Totowa, New Jersey 1996. 4. Władyka B.: Określenie struktury pirwszo- i trzeciorzędowej – dwa sposoby charakterystyki białek. Praca magisterska IBM UJ, Kraków 2002. 5. Rawn J.D.: Biochemistry. Carolina BSC, Burlington NC. 1988. Literatura uzupełniająca 1. Kozik A., Rąpała-Kozik M., Guevara-Lora I.: Analiza instrumentalna w biochemii. Wybrane problemy i metody instrumentalnej biochemii analitycznej. Seria Wydawnicza IBM UJ 2001. 2. Ćwiczenia z immunologii. Praca zbiorowa pod red. J. Pryjmy, . Seria Wydawnicza IBM UJ 1999. 3. Bereta J., Bereta M.: Przeciwciała monoklonalne. Otrzymywanie i zastosowanie. . Seria Wydawnicza IBM UJ 2000. 4. Walkowiak B.: Technik chromatografii cieczowej. Przykłady zastosowań. Amersham. Amersham Pharmacia Biotech, MORPOL, Lublin, 2000.
