Bia*ka w diagnostyce laboratoryjnej

Stelmach Justyna
Gr. A2
III OAM
Rola białek osocza:
 Kontrola dystrybucji płynów przestrzeni





pozakomórkowej
Funkcje transportowe
Regulatory enzymów
Białka odpornościowe
Ciśnienie onkotyczne
Funkcja odżywcza
Proteinogram
 Albuminy 60-70%
 Alfa-1 globuliny 2-4%
 Alfa-2 globuliny 4-7%
 Beta globuliny 8-13%
 Gamma globuliny 9-22%
Całkowite stężenie białka w osoczu 60-80 g/l
Wydalane z moczem= 20-80mg/dobę
 Za krytyczne uznaje się poziomy białka całkowitego
poniżej 45g/l i albuminy poniżej 20g/l.
Przy takich stężeniach ciśnienie onkotyczne jest
bardzo niskie, dochodzi do ucieczki wody poza
naczynia, powstawania obrzęków i przesięków do jam
ciała.
Białka specyficzne:









Albuminy- ciśnienie onkotyczne (80%)
Alfa1-antytrypsyna-inhibitor proteaz
Beta2-mikroglubulina- podjednostka układu HLA
Ceruloplazmina- białko wiążące miedź i enzym
Białko C-reaktywne (CRP)- wskaźnik stanu zapalnego
Transferyna- białko transportujące żelazo
Ferrytyna- białko transportujące żelazo w tkankach
Haptoglobina- białko wiążące hemoglobinę
SHBG-Glubulina wiążąca hormony płciowe- wiąże
testosteron
 TBG-Globulina wiążąca hormony tarczycy
 Transkobalamina- wiąże wit.B12
Paraproteiny
 immunoglobuliny produkowane przez pojedynczy klon




komórek linii limfocytów B (np. plazmocyty)
zazwyczaj występuje w obrębie globulin gamma
paraproteiny pojawiają się najczęściej w przebiegu
szpiczaka mnogiego, plazmocytom i choroby
Waldemstrom’a (makroglobulinemia-IgM)
elektroforeza białek osocza jest podstawowym badaniem
wykrywającym paraproteiny ale mocz powinien być także
badany
w przebiegu szpiczaka wydzielane są tylko
immunoglobuliny zbudowane z łańcuchów lekkich, które
są wykrywane w 75% przypadków w moczu jako białko
Bence-Jones’a
Synteza i degradacja białek osocza:
 Dwie duże pule białek:


albumina-czynnikiem regulującym jej syntezę w wątrobie jest ciśnienie onkotyczne działające poprzez
onkoreceptory łożyska naczyniowego
immunoglobuliny-syntetyzowane w limfocytach w wyniku ich aktywacji przez różne antygeny.
 Degradacja ATP-niezależna w lizosomach (białka nieuszkodzone, „długo żyjące”).
 Degradacja ATP-zależna w cytosolu (białka nieprawidłowe, „krótko żyjące”).
 Okres półtrwania białek (czas wymagany do zmniejszenia stężenia białka do 50% wartości
początkowej):



czynnik VIII krzepnięcia: kilka godzin
albumina: czternaście dni
immunoglobuliny: dwadzieścia cztery dni
 Białka osocza nie gromadzą się w wątrobie, prawie cała pula białek znajduje się w przestrzeni
międzykomórkowej, tylko 40% jest w naczyniach, pozostałe 60% w przestrzeni
pozanaczyniowej.
 Prawidłowy poziom białka całkowitego zależy od równowagi miedzy syntezą a degradacją
dwóch, głównych frakcji białkowych: albuminy i immunoglobulin.
 Większość białek jest katabolizowana w wątrobie lub komórkach śródbłonka naczyń.
Hipoproteinemia:
 Obniżenie poziomu białek w wyniku:
a) zwiększonej utraty białek
b) zahamowania ich syntezy w wątrobie
c) rozcieńczenia przez nadmiar lub zmiany dystrybucji
wody pozakomórkowej.
 Niedobory immunoglobulin
 Zmiany objętości przestrzeni pozakomórkowej:
 przewodnienia
 spadek ciśnienia krwi
 stany zapalne
 Przyczyny:

Zespoły utraty białka:







nerkowe (kłębkowe zapalenie nerek, cukrzyca, toczeń rumieniowaty
trzewny, zakrzepica żył nerkowych)
jelitowo/żołądkowe (stany zapalne, nowotwory złośliwe, zwężenie,
uchyłki, choroba popromienna, niewydolność krążenia, zapalenie krezki)
skórne (rozległe oparzenia, dermatozy)
wysięki (obrzęki, zapalenia płuc, wodobrzusze)
krwotoki
stany ciężkie (urazy, nowotwory, sepsa)
Zahamowanie syntezy białek w wątrobie:



uszkodzenie miąższu wątroby (toksyczne, marskość, zanik miąższu,
pierwotny lub wtórny nowotwór)
zaburzenia wchłaniania (zespoły poresekcyjne, biegunki bakteryjne,
zakażenia, mukowiscydoza)
niedobory białka w diecie (niedożywienie)
 Ocena niedoborów białek osocza


Niskie poziomy białka całkowitego i albuminy mogą
poza leczeniem ich przyczyny, wymagać uzupełniania
ich niedoboru, a szczególnie gdy są poniżej poziomów
krytycznych.
Podczas uzupełniania niedoborów należy uwzględnić
również wielkość dobową ujemnego bilansu
białkowego. Skuteczność tego typu leczenia należy
monitorować przez oznaczanie poziomu białka
całkowitego i albuminy.
Hiperproteinemie
 Prawdziwa hiperproteinemia jest spowodowana znacznym
wzrostem produkcji jednej lub wielu klas immunoglobulin.
 Zwiększeniu stężenia immunoglobulin często towarzyszy obniżenie
poziomu albuminy.
 Stężenie białka całkowitego może być w granicach normy lub
obniżone, nawet przy znacznej hipergammaglobulinemii (w
póżnych stadiach marskości wątroby, w rozwoju zespołu
nerczycowego w przebiegu chorób kolagenowych).
 Przyczyny hiperproteinemii
 Hipergammaglobulinemie:




monoklonalne (szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenströma,
choroba ciężkich łańcuchów)
poliklonalne (przewlekłe stany zapalne, choroby autoimmunologiczne)
przewlekłe choroby wątroby (marskość, wirusowe zapalenia, sarkoidoza)
odwodnienia
Dysproteinemia
 to nie prawidłowe proporcje białka we krwi, przy
prawidłowym poziomie białka całkowitego
Szybkość opadania krwinek czerwonych
(Odczyn Biernackiego,OB).
 Test oceny zaburzeń proporcji między stężeniami
poszczególnych białek osocza i właściwości erytrocytów.
 W próbie krwi pobranej z antykoagulantem (cytrynian
sodu) krwinki czerwone opadają w wyniku większego
ciężaru właściwego (1.095g/l) niż osocze (1.027g/l).
 Szybkość OB. Jest wypadkową składu osocza oraz
właściwości erytrocytów. Zwiększenie stężenia
fibrynogenu, białek frakcji globulinowych alfa i beta
(białka ostrej fazy), oraz spadek poziomu albuminy
powodują wzrost OB.
 Mała ilość erytrocytów w niedokrwistościach jest
przyczyną ich szybszego opadania.
Elektroforeza białek surowicy
Elekroforeza
(bibułowa, na agarozie, na octanie celulozy, w żelu skrobiowym i żelu
poliakylamidowym)
polega na wędrówce oznaczonych ładunkiem elektrycznym cząstek
białkowych w roztworze elektrolitu podczas przepływu stałego prądu
elektrycznego
 szybkość wędrówki zależy od ruchliwości w polu elektrycznym, a ta
zależy od wielkości cząstek i wielkości ładunku powierzchniowego
 Białka, których zmiana stężeń może wpłynąć na obraz
elektroforetyczny surowicy to:
a) frakcja albuminowa (53-68%)
b) frakcja α 1-globulinowa (1-4%)
c) frakcja α2- globulinowa (1-14%)
d) frakcja β globulinowa (8-17% razem z beta2)
e) frakcja gamma-globulinowa (9-22%)
Immunoelektroforeza białek
surowicy ludzkiej
 to połączenie rozdziału elektroforetycznego i
immunoprecypitacji białek, przy zastosowaniu specyficznych
reakcji precypitacji antygen-przeciwciało, jest często
wykorzystywana w rozpoznawaniu paraproteinemii.
Identyfikacja nieprawidłowych białek po rozdziale
elektroforetycznym jest możliwa, jeśli zastosuje się surowice
odpornościową. W wyniku reakcji antygen (antygenem jest w
tym przypadku rozdzielone elektroforetycznie białko) z
przeciwciałami znajdującymi się w surowicy odpornościowej
wytwarzają się linie precypitacyjne, które umożliwiają
identyfikację nieprawidłowego białka.
Charakterystyczne zmiany zawartości jednej lub kilku frakcji
białkowych stwierdza się w wielu chorobach.
CHROMATOGRAFIA
 (bibułowa, jonowo wymienna, cienkowarstwowa)
wykorzystuje różnice szybkości wędrówki składników
białkowych w ośrodkach porowatych.
Białka płynu mózgowordzeniowego:
mają skład podobny do białek osoczowych
 zaliczamy do nich: prealbuminy, albuminy, α 1- i 2- ,
β-, gamma- globuliny
 stężenie białek w płynie mózgowo-rdzeniowym jest
ok. 100 razy mniejsze i wynosi 0,15-0,45 g/l
Elektroforeza białek PMR
 Cechy charakterystyczne:
prealbumina,
białko tau (związane z mikrotubulami neuronów,
odpowiada za ich stabilizacje oraz wiązanie z
neurofilamentami i organellami komórkowymi)
Brak fibrynogenu.
Albumina
 Syntetyzowana w wątrobie, ok.15g/dobę.
 Czas połowicznego trwania (T1/2) 14 dni.
 Nieswoisty transporter bilirubiny, hormonów, witamin,
wapnia, magnezu, kwasów tłuszczowych, leków oraz
substancji wchłoniętych w jelitach i transportowanych
do wątroby.
 Bisalbuminemia – występowanie dwóch rodzajów
albumin o różnym składzie aminokwasowym i różnej
mobilności elektroforetycznej.
Immunoglobuliny:
 Immunoglobuliny (przeciwciała) mają zdolność
swoistego łączenia się z antygenem i są najważniejszymi
cząsteczkami układu odpornościowego.
 Syntetyzowane przez limfocyty B.
 Na podstawie różnic w budowie łańcuchów ciężkich
(α,δ,ε,γ,μ) wyróżniamy odpowiednio pięć klas: IgA, IgD,
IgE, IgG, IgM.
Hipogammaglobulinemia

Pierwotna – uwarunkowana genetycznie raczej rzadko
spotykana, może dotyczyć wszystkich lub jednej klasy
Ig.

Wtórna – związana z chorobą (nowotwory, leczenie
cytostatykami, usunięcie śledziony). Bardzo niskie
poziomy immunoglobulin związane są najczęściej z
ubytkiem limfocytów B.
Hipergammaglobulinemia




Hipergammaglobulinemia poliklonalna – jest to prawidłowa
odpowiedź organizmu na infekcję bakteryjną lub wirusową. W
pierwszym etapie infekcji następuje wzrost stężenia IgM, po
dwóch tygodniach IgG oraz stopniowy zanik IgM.
Podwyższony poziom IgA jest często związany z infekcjami błon
śluzowych (S-IgA wytwarzane miejscowo przez komórki
plazmatyczne błon śluzowych mają zdolność neutralizowania
wirusów i wiekszą efektywność aglutynacji bakterii).
Hipergammaglobulinemia monoklonalna – wzrost
immunoglobulin produkowanych przez nadmiernie rozrastającą
się linię limfocytów (grupa chorób nowotworowych limfocytów
B).
Przyczyny: szpiczaki, makroglobulinemia Waldenströma,
chłoniaki i łagodne gammapatie monoklonalne.
Białka ostrej fazy
 Synteza w wątrobie pod wpływem cytokin zapalnych w
przebiegu zakażeń bakteryjnych, martwicy tkanek,
ostrych i przewlekłych stanów zapalnych, chorób
zakaźnych, nowotworów.
Część nieswoistej odpowiedzi immunologicznej.
 Rola- modulowanie odczynu zapalnego i ochrona
tkanek nieobjętych stanem zapalnym przed
niszczącym działaniem proteinaz i silnych oksydantów
wydzielanych przez fagocyty.
Niewielki ↑:
 Choroby nowotworowe
 Niedożywienie
 Ciąża
 Menstruacja
 Zespół metaboliczny
 Opsoniny, inhibitory proteinaz, chelatory metali,
transportery hormonów, białka wiążące hem i
hemoglobinę, białka układu krzepnięcia (fibrynogen i
antyplazmina III) oraz białka układu dopełniacza.
Ujemne białka ostrej fazy:
 Albumina
 Transferryna
 Prealbumina
Dodatnie białka ostrej fazy:
 fibrynogen
 α1- antytrypsyna (AAT)
 ceruloplazmina
 haptoglobina (HP)
 białko C-reaktywne (CRP)
 surowicze amyloidowe białko A (SAA)
 laktoferryna
 białka układu dopełniacza
Białko C-reaktywne





Znaczny wzrost obserwowany jest w pierwszej dobie uszkodzenia
tkanek (zawał mięśnia sercowego, białaczek, w odrzucie
przeszczepów, zakażeniach bakteryjnych).
Prawidłowe stężenie CRP w surowicy jest mniejsze niż 5 mg/l.
hsCRP - test o wysokiej czułości: 0.2 mg/l; pozwala na zmierzenie
bardzo małych wartości CRP z dużą precyzją w zakresie decyzyjnym.
Wyniki ostatnich badań wskazują, że stężenie CRP posiada
znaczenie prognostyczne w chorobie sercowo-naczyniowej. Procesy
zapalne odgrywają bardzo ważną rolę w patogenezie miażdżycy, a
stopień podwyższenia poziomu CRP, który jest charakterystyczny dla
przewlekłego stanu zapalnego, jest czynnikiem oceniającym ryzyko
wystąpienia zawału mięśnia sercowego lub udaru mózgu.
Poziom CRP powyżej 2.1 mg/l jest związany z trzykrotnym
zwiększeniem ryzyka wystąpienia zawału mięśnia sercowego oraz
dwukrotnym zwiększeniem ryzyka wystąpienia udaru mózgu.
Metody ilościowego oznaczania
białek:
 Metoda Lowry’ego
 Metoda Bradforda
 Metoda mikrobiuretowa
 Metoda pomiaru absorbancji w UV
 Metoda z kwasem Bis-cynchoninowym (BCA)
 Metoda Kiejdahla
 Metoda biuretowa
 Metoda kolorymetryczna z odczynnikiem Nesslera
Metoda Kiejdahla
 Metoda referencyjna, oznaczanie azotu,
Zasada:
 Zawartość azotu w różnych białkach jest względnie
stała i wynosi ok. 16%.
 Znając odsetek azotu w badanej próbie, można
obliczyć, ile zawiera białka.
Metoda kolorymetryczna z odczynnikiem
Nesslera
 Żółtozielony roztwór jodku rtęciowo-potasowego
przechodzi w czerwony jodek amidooksyrtęciowy.
Pomiar absorbancji 490-510 nm
 Zalety: duża specyficzność da wszystkich białek
 Wady: duża pracochłonność
Metoda biuretowa
Zasada oznaczenia:
 Oznaczanie natężenia barwy powstałej w wyniku
utworzenia związków kompleksowych białek z jonami
miedzi (II) w środowisku zasadowym λ =530 nm
 Zalety:Wysoka specyficzność dla wszystkich białek
 Wady: niska czułość (10mg/l).
 Materiał: Surowica, mocz (w zaawansowanej nerczycy)
Metoda mikrobiuretowa:
Modyfikacja metody biuretowej
 Mechanizm podobny, ale zastosowana długość fali 310 nm
zwiększa ok 10 x jej czułość
 Każdą próbę wykonuje się w dwóch szeregach: biały (B) i
niebieski (N)
 Szereg biały zawiera roztwór białka + 30% NaOH, szereg
niebieski roztwór białka + CuSO4 w 30% NaOH
 Właściwą absorbancję do obliczeń otrzymuje się z różnicy
N-B.
Zalety: wysoka specyficzność w stosunku do wszystkich
białek.
Wady: duże zużycie roztworu białka (dwa szeregi)
Metoda Lowry’ego
 Zasada: dwie odrębne reakcje: reakcja aminokwasów z
odczynnikiem Folina reakcja biuretowa.
 Zalety:bardzo wysoka czułość reakcji (1mg/l)
 Wady: mała specyficzność.
 Materiał : Mocz, PMR.
Metoda Bradforda
 W metodzie wykorzystuje się zdolność wiązania barwnika
błękitu brylantowego - Coomassie Brilliant Blue G-250
(CBB G250) z grupami aminowymi białek.
 λ=595 nm




Zalety:
prostota i szybkość oznaczenia
duża czułość (0,5mg/l)
oznaczenia można wykonywać w obecności powszechnie
stosowanych buforów, EDTA, związków tiolowych,
sacharozy, glicerolu
Metoda pomiaru absorbancji w UV
 Wartość wsp. absorpcji zależy od % zawartości
aminokwasów aromatycznych i dla białek osocza o
stężeniu 1 mg/ml wynosi od 0,8 do 1,6
 Obecność kwasów nukleinowych w badanym materiale
przeszkadza w oznaczeniu (max absorbcji 260 nm)
 Wady:
 Mała specyficzność
 Metoda nadaje się do oznaczania stężenia oczyszczonego
białka (na podstawie znanego wsp. absorpcji)
Metoda z kwasem bis-cynchoninowym
(BCA)
 W alkalicznym środowisku niektóre składniki białek
(tyrozyna, tryptofan, cysteina, cystyna) redukują jony
Cu2+ do Cu1+
 Cu1+ tworzą barwny kompleksowy związek z
kwasem biscynchoninowym(BCA)
 λ=540 –580 nm
Markery zawału mięśnia secowego
 Markery prognostyczne:
Hs-CRP- high sensitive-C-Reactive Protein (wysoko czułe
białko C-reaktywne)
MPO- mieloperoksydaza
CD-40
 Markery destabilizacji blaszki miażdżycowej
PAPP-A- Pregnancy-Associated Protein-A (ciążowe białko
osoczowe A)
 Markery niedokrwienia
IMA (ACB)- Ischemia Modifed Albumin (Albumin Cobalt
Binding) Albumina modyfikowana niedokrwieniem
(wiązanie kobaltu przez albuminę)
 Markery martwicy komórkowej
Mioglobina (niespecyficzny)
H-FABP- Hart-Fatty Acid Binding Protein (sercowe białko
wiążące kwasy tłuszczowe)
CK-MB
Troponiny sercowe (cardiac)- cTnT, cTnI
 Marker niewydolności serca
Peptydy natriuretyczne (Natriuretic peptides)- ANPprzedsionkowy (atrial) (typ A); BNP- mózgowy (brain) (typ
B); NT-proBNP
Markery filtracji kłębkowej
(nerkowej):
 Beta-2 mikroglobulina- jest niskocząsteczkowym białkiem
(11.8kDa) obecnym na błonie komórkowej prawie
wszystkich komórek jądrzastych (także limfocytów). Beta2-M jest małą podjednostką antygenu zgodności tkankowej
(HLA). Nerka jest głównym miejscem eliminacji beta-2-M
gdzie jest filtrowana w kłębuszkach i w 99.9%
reabsorbowana w kanalikach proksymalnych.
 cystatyna C- jest kationowym polipeptydem o masie
cząsteczkowej 13kDa. Ponieważ podlega stałej i
równomiernej produkcji i ulega całkowitej filtracji w
kłębuszkach nerkowych, cystatna-C jest endogennym
markerem filtracji (GFR) lepszym niż beta-2-M i
kreatynina.
SHBG
 Steroi Hormons Binding Globulin (globulina wiążąca
hormony sterydowe)- oznaczenie SHBG jest polecane
w przypadku konieczności wyjaśnienia niskiego lub
wysokiego stężenia testosteronu, gdy wolny
(biologicznie aktywny) testosteron jest w normie