analiza białek

Nowoczesne metody diagnostyczne
Nowoczesne metody diagnostyczne
Molekularne metody fenotypowe
‐ analiza białek
dr hab. Beata Krawczyk
dr
hab Beata Krawczyk
Katedra Mikrobiologii PG
Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej
w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
Metody fenotypowe oparte o analizę białek
• Elektroforetyczne
Elektroforetyczne techniki analizy białek techniki analizy białek
drobnoustrojów :
‐ profile białkowe uzyskane z całych komórek
fil bi łk
k
ł hk ó k
‐ profile białkowe błony zewnętrznej bakterii gram‐ujemnych
‐ metody elektroforetyczne rozdzielające izoenzymy f
komórkowe (Multilocus Enzyme Electrophoresis ‐ MLEE)
‐ różne odmiany immunoblottingu
óż
d i
i
bl tti
• Typowanie serologiczne oparte na reakcji antygen‐
przeciwciało
i i ł
2
Analiza profili białkowych – techniki Analiza profili białkowych –
elektroforetyczne
Cząsteczki białek w polu elektrycznym migrują z szybkością ą
p
y y
g ją
y
ą
zależną od ich masy cząsteczkowej, wypadkowego ładunku, od ładunku zależy też ich kierunku ruchu.
PAGE ‐‐ elektroforeza natywna PAGE Ograniczeniem jest: ‐potrzebna standaryzacja
potrzebna standaryzacja
‐kompleksy białek dają profile trudne do interpretacji, y
‐stosunkowo słaba rozdzielczość metody.
3
Elektroforeza w obecności SDS (strefowa)
• Zastosowanie SDS (dodecylu siarczan sodu) ‐substancji powierzchniowo czynnej ‐ przyczynia się do znacznego poprawienia rozdzielczości techniki elektroforetycznej
poprawienia rozdzielczości techniki elektroforetycznej. • Potraktowanie cząsteczki białka przez SDS skutkuje powstaniem kompleksów białko ‐ SDS o ustalonym stosunku powstaniem kompleksów białko SDS o ustalonym stosunku
ładunku elektrycznego do masy. 4
Obecność SDS przynosi szereg korzyści:
● zdecydowana większość białek jest d d
i k ść bi ł k j
rozpuszczalna w elektrolitach zawierających SDS, szczególnie po redukcji mostków disiarczkowych
● separacja białek odbywa się zgodnie z ich masami cząsteczkowymi
z ich masami cząsteczkowymi
● barwienia kompleksów białko ‐ SDS jest znacznie wydajniejsze niż samego białka
bi łk
● obecność SDS skutecznie eliminuje enzymatyczną degradację białek w trakcie separacji.
Rys. Podstawy biologii komórki, Bruce Alberts i in. PWN 1999
5
Schemat metody SDS‐
Schemat metody SDS
Schemat metody SDS‐PAGE
Dodanie SDS;
podgrzanie
białka
1
2
Naniesienie próbki białka na SDSPAGE ścieżka 2; ścieżka 1 –
marker
k molekularny
l k l
SDS wiąże się do
reszt
aminokwasowych
i nadaje ujemny
ładunek po
ładunek,
podgrzaniu białka
ulegają linearyzacji
6
Elektroforeza nieciągła
Elektroforeza nieciągła
• Połączenie izotachoforezy
Połączenie izotachoforezy
z elektroforezą strefową • Nośnik
Nośnik elektroforetyczny składa się z elektroforetyczny składa się z
dwóch kontaktujących się ze sobą części wypełnionych elektrolitami o różnym składzie i różnej wartości pH
kł d i i óż j
ś i
(ang. discontinue electrophoresis
or disc‐electrophoresis). p
)
izotachoforeza
Elektroforeza
strefowa
7
Detekcja żeli białkowych
Można w ten sposób znaleźć 1 μg
białka w prążku
prążku.
Coomassie Brillant Blue
Metoda ta pozwala oznaczyć 10 ng
białka w prążku.
pą
Barwienie srebrem
8
Nowości - DualColor™ Protein Loading Buffer Pack
(Fermentas
F
t Science)
S i
)
•
DualColor zapobiega degradacji białek DualColor™
zapobiega degradacji białek
podczas podgrzewania próbek do SDS‐
PAGE jak i podczas prowadzenia elektroforezy.
•
W skład obciążnika wchodzą dwa barwniki: bromofenol blue oraz pironina Y, dzięki czemu można śledzić przemieszczanie się próbek podczas elektroforezy oraz Western blotting. Zawarty w DualColor™ SDS i DTT niszczy wyższe struktury białkowe. SDS przyłącza się do hydrofobowych regionów białka powodując rozwijanie struktury tym samym nadając ładunek ujemny DTT
rozwijanie struktury tym samym nadając ładunek ujemny. DTT niszczy mostki dwusiarczkowe oraz pozostałe struktury dwurzędowe. •
•
•
Zastosowanie:
i
Przygotowanie białek do SDS‐PAGE
Monitorowanie transferu białek podczas Western blotting
•
Śledzenie próbek z DualColor™ Protein Loading
Buffer Pack
Zwiększona stabilność białka dzięki DualColor™ Protein Loading Buffer Pack
M ‐ PageRuler™ Unstained Protein Lauder (#SM0661)
1,3 ‐ próbka białka przygotowana z DualColor™ Protein Loading Buffer Pack
2,4 ‐ próbka białka przygotowana z konwencjonalnym buforem obciążającym Leammli (pH
6.8) i DTT. Fermentas. 9
El k f
Elektroforeza dwukierunkowa d ki
k
białek
• Łączy w sobie dwie techniki: ogniskowanie izoelektryczne i elektroforezę SDS‐PAGE
10
Dwukierunkowa elektroforeza w żelu
poliakryloamidowym
Stabilny gradient pH
kwaśne
Migracja
a SDS (m.cz. 10 -3
zasadowe
Rys. Podstawy biologii komórki, Bruce Alberts i in. PWN 1999
11
2D electrophoresis of periplasmic fractions of E. coli BL21(DE3)/pET30b-sygDraBE (A) and E. coli BL21(DE3)/pET30b (B). [n] indicates
oligomers of the DraE protein resolved on the gel; 1 corresponds to a monomer of DraE, and 2, 3, 4, 5, and 6 correspond to a dimer, a trimer, a
tetramer, a pentamer and a hexamer of DraE, respectively. In panel A at pH 9 and 30 kDa is a spot corresponding to the DraB protein. The
IEF was performed with a linear pH 3 to 10 gradient as indicated at the top.
top Separation by size was performed by using an SDS-12%
polyacrylamide gel; the masses of compounds in a low-molecular-mass protein marker (Amersham Bioscience) are indicated between the gels.
The gels were stained with silver.
Molecular Aspects of Biogenesis of Escherichia coli Dr Fimbriae: Characterization of DraB-DraE Complexes ; Rafał
Piątek i in. Infection and Immunity, January 2005, p. 135-145, Vol. 73, No. 1
12
allozymy
Elektroforeza allozymów
Allel A
Locus 1
Allel B
izoenzymy
Locus 2
Chromosomy
homologiczne
pojedynczego osobnika
Izoenzymy ‐ enzymy o tych samych funkacjach katalitycznych, ale różniących się składem aminokwasowym , są kodowane przez geny położone w różnych locus ;
różnych locus
Allozymy – warianty enzymu, które są kodowane przez różne allele tego samego locus
13
Technika MLEE (ang. Multilocus Enzyme Electrophoresis
Electrophoresis) ) • Charakterystyka gatunków drobnoustrojów poprzez relatywną mobilność l
bil ść
elektroforetyczną ich dużej liczby enzymów komórkowych •
•
Metoda służy do badania genetycznej zmienności (wyrażonej f
fenotypowo) wewnątrz populacji bakterii oraz stopnia pokrewieństwa )
l ji b k ii
i
k
i ń
pomiędzy izolatami, populacjami i gatunkami
Używa się do badania zmienności w populacjach bakterii z rodziny Escherichia, Salmonella, Legionella, Leishmania, Neisseria i Haemophilus
14
Technika MLEE
Technika MLEE
Technika 1. Różnicowanie szczepów metodą MLEE polega na względnej ruchliwości elektroforetycznej rozpuszczalnych w buforach wodnych izoenzymów komórkowych
2. Rozdział elektroforetyczny białek cytoplazmatycznych w żelu poliakryloamidowym w warunkach natywnych
3. Transfer na błonę
4. Reakcja błony ze związkami substratowymi specyficznymi dla danego enzymu (procedurę powtarza się każdorazowo dla każdego białka, w zależności od ilości badanych izoenzymów)
5 Uzyskujemy
5.
Uzyskujemy charakterystyczny wzór mówiący o podobieństwach charakterystyczny wzór mówiący o podobieństwach
i różnicach fenotypowych
15
MLEE
16
Dokumentacja KM PG
MLEE
three enzymes
(A) Mannitol 1-phosphate
dehydrogenase in E. coli; 18
isolates.
((B)) Glucose 6-phosphate
p
p
dehydrogenase in N. meningitidis;
19 isolates.
(C) Malate dehydrogenase in
E. coli; 14 isolates.
Anodal direction of migration
g
from
the origin is indicated by the
Arrow.
Copyright © 1986, American Society for Microbiology
Methods of Multilocus Enzyme Electrophoresis for Bacterial Population Genetics and Systematics ROBERT K. SELANDER,l* DOMINIQUE A. CAUGANT,' HOWARD 17
OCHMAN,2 JAMES M. MUSSER,’MARION N. GILMOUR,' AND THOMAS S. WHITTAM3
Wady MLEE:
y
• B
Brak odtwarzalności w różnych laboratoriach k d
l ś i
óż h l b
i h
(problemy proceduralne)
• Użyteczna w badaniach długoterminowych
Uż
b d i h dł
i
h
(studiach epidemiologicznych globalnych) • mało czuła w badaniach epidemiologicznych ł
ł
b d i h id i l i
h
krótkoterminowych dla szczepów blisko spokrewnionych
18