Biolomolo Ćwiczenia - biolomolo - farmacjaUMP

Biolomolo Ćwiczenia.doc
(211 KB) Pobierz
METODY ANALIZY KWASÓW NUKLEINOWYCH
1. Jeżeli chcemy otrzymać DNA z jakiejkolwiek tkanki, to przed wyizolowaniem
musimy tę tkankę najpierw:
a) zhomogenizować:
 mechanicznie (homogenizator)
 za pomocą ultradźwięków
b) LUB zniszczyć całą komórkę przy pomocy detergentów, np.:
 SDS – sól sodowa siarczanu dodecylu – degraduje błony komórkowe, a
dodatkowo denaturuje białka
 Triton-X100 – tylko niszczy błony
 oprócz detergentów konieczna jest jeszcze podwyższona temperatura i
proteinaza K
c) jeżeli dodatkowo chcemy pozbyć się RNA z naszego preparatu to inkubujemy
go w 37°C w obecności rybonukleazy A
2. Metody izolacji DNA:
a) ekstrakcja z użyciem mieszaniny fenolu i chloroformu:
 kilkukrotne wytrząsanie lizatu z fenolem i chloroformem – usunięcie
lipidów i białek (za denaturację białek odpowiedzialny jest fenol -zbierają
się one na granicy faz)
 wytrącenie DNA – konieczne są:
- izopropanol/etanol
- niska temperatura
- obecność jonów sodu
 przemycie osadu etanolem (dalsze oczyszczenie)
 rozpuszczenie osadu DNA w jałowej wodzie lub buforze TE o składzie:
- TRIS – zapewnia lekko zasadowe pH (bufor właściwy)
- EDTA – chelatuje jony, przez co DNA jest bardziej stabilny
b) adsorpcja na kolumnach wypełnionych krzemionką
 podczas lizy w buforze z proteinazą muszą być jeszcze sole chaotropowe
(KI, nadchloran sodu, guanidyny) – usuwają one wiązania wodorowe
między DNA a wodą, dzięki czemu DNA może wiązać się z membraną
krzemionkową
 tiocyjanian guanidyny dodatkowo ułatwia lizę i inaktywuje nukleazy





przeniesienie lizatu na kolumnę z membraną krzemionkową
selektywna absorpcja DNA do membrany – czyli nic oprócz DNA się tam
nie przyklei
odwirowanie kolumny i przemycie jej etanolem – wymycie soli i
usunięcie ewentualnych zanieczyszczeń
DNA z kolumny wymywamy j.w. buforem TE lub jałową wodą
generalnie metoda jest prostsza, szybsza, bezpieczniejsza, ale mniej
wydajna niż ekstrakcja
c) przy pomocy cząstek magnetycznych:

cząstki wykonane z tetratlenku żelaza (Fe3O4) o właściwościach
magnetycznych miesza się z lizatem komórkowym – DNA specyficznie
adsorbuje się na powierzchni cząstek
 nie ma tak prosto, te cząstki nie są tylko żelazem; są pokryte:
- polistyrenem/krzemionką  zwiększenie adsorpcji DNA
- LUB silanem (silanizacja)
 przyłożenie pola magnetycznego w celu usunięcia lizatu

przemycie DNA buforem (tak, żeby go dodatkowo oczyścić) +
przyłożenie pola, żeby ten bufor usunąć

elucja – wypłukanie DNA z cząsteczek za pomocą buforu
wymywającego + ponowne przyłożenie pola magnetycznego, żeby
„zabrać” roztwór DNA z cząsteczek
 metoda jest prosta, szybka, wydajna, ale droga
3. Jak już wyizolujemy DNA, to sprawdzamy, czy nadaje się do dalszych analiz –
określamy jego stężenie i ewentualne zanieczyszczenia (fenol, EDTA, heparyna).
Korzystamy ze spektrofotometrycznej analizy widma w zakresie 230-280 nm
a) STĘŻENIE – pomiar absorbancji przy 260 nm (tam kwasy nukleinowe
wykazują maksimum absorpcji) –
 wartość ta jest wprost proporcjonalna do stężenia
 jak przeliczyć absorbancję na stężenie: 1 OD (gęstość optyczna) = 50
μg/ml DNA
b) CZYSTOŚĆ – pomiar absorbancji przy: 280 nm (maksimum absorbancji
białek) i 230 nm
 stosunek A260/A280 – ocena stopnia zanieczyszczenia białkami; powinien
się mieścić w granicach 1,8 – 2,0
 stosunek A260/A230 – ocena stopnia zanieczyszczenia fenolami, EDTA,
etanolem i polisacharydami – powinien wynosić ok. 1,8
4. PCR – Łańcuchowa reakcja polimerazy – służy do powielenia ściśle określonego,
wybranego odcinka DNA
a) główne cechy:
 specyficzność – powielamy tylko to co chcemy; można oczywiście powielić
cały genom i nazywa się to wtedy WGA
 przebiega poza komórką (in vitro)
 konieczna obecność enzymów, ale innych niż w procesie replikacji in vivo
b) składniki reakcji PCR:
 specyficzne startery
- jednoniciowe oligonukleotydy komplementarne do sekwencji, która
sąsiaduje z tym fragmentem, który chcemy zamplifikować
- umożliwiają inicjację procesu – są „punktem przyczepu” dla polimerazy
DNA
- muszą być dwa startery – po każdym dla jednej nici DNA – starter
sensowny dla nici sensownej i starter antysensowny dla drugiej nici (i
on jest jakby „na drugim końcu” powielanej sekwencji)
 matryca – czyli nasz wyizolowany i sprawdzony DNA
 rekombinowana polimeraza Taq – termostabilna polimeraza DNA, która
katalizuje reakcję wydłużania starterów (czyli przyłącza po kolei kolejne
„cegiełki”)
 dNTP – trifosforany deoksyrybonukleotydów – substraty reakcji i źródło
energii dla polimerazy
 bufor – zapewnia odpowiednie pH dla aktywności polimerazy
 Mg2+ - kofaktor reakcji polimeryzacji
 (glicerol/DMSO) – dodawane w przypadku amplifikowana fragmentów
bogatych w pary GC
c) przebieg procesu:
 cały PCR składa się z 30-40 powtarzających się cykli:
TEMPERATURA
95°C
50-65°C (charakt. dla danej pary starterów)
72°C




CO SIĘ DZIEJE?
denaturacja DNA – rozplecenie helisy
przyłączenie się starterów
wydłużanie starterów pod wpływem polimerazy
próba kontrolna: mieszanina reakcyjna bez matrycy – sprawdzamy, czy do
naszych buforów/starterów etc. nie dostał się oby materiał genetyczny
każdy cykl prowadzi do podwojenia ilości DNA
liczba końcowych kopii = 2x (x – liczba cykli)
UWAGA! Fragmenty o interesującej nas długości pojawiają się dopiero w
drugim cyklu
5. Życie nie jest proste (a już zwłaszcza studenta… no chyba, że na UAMie), więc mamy
jeszcze kilka wariacji na powyższy temat tzn. modyfikacji PCR
a) multipleks PCR – amplifikujemy na raz kilka różnych fragmentów
 dodajemy 2-4 par starterów zamiast jednej
 zamiast jednego produktu mamy ich kilka

jeżeli chcemy sobie te nasze fragmenty zidentyfikować za pomocą
elektroforezy, to muszą one różnić się wielkością, bo inaczej wszystko się
wymiesza i nie będzie wiadomo co jest co
b)
Hot-start PCR – PCR z użyciem polimerazy typu Hot-start, która jest
aktywowana dopiero w 95°C (czyli wtedy, kiedy denaturuje DNA)

nie powstają wtedy produkty niespecyficzne, ponieważ zaczynamy
reakcję dopiero jak już wszystko jest dodane, jesteśmy gotowi, mamy dobry
humor etc.

polimeraza jest zablokowana w niższych temperaturach, ponieważ jej
centrum aktywne jest blokowane przez:
- przeciwciało
- LUB termolabilną grupę chemiczną, która odłącza się od polimerazy po
ogrzaniu
 metoda przydatna w amplifikacji malutkich fragmentów DNA
c)
MSP PCR – metylospecyficzna reakcja PCR – umożliwia analizę profilu
metylacji danego fragmentu (to jest to co robiliśmy na zajęciach i o niej powiem
dokładniej niżej)
6. MSP PCR – cały myk polega na tym, że zanim zaczniemy powielać nasze DNA
poddajemy je konwersji w obecności NaHSO3:
a) sekwencja zmetylowana nie ulegnie zmianie i nadal będzie zawierała cytozynę
b) sekwencja niezmetylowana ulegnie modyfikacji – niezmetylowana cytozyna
zamieni się na uracyl
c) skoro mamy dwie różne „wersje” tego samego DNA, to trzeba użyć dwóch
różnych par starterów
 jeden dla sekwencji zmetylowanej w której są cytozyny i komplementarne
do nich guaniny

drugi dla sekwencji niezmetylowanej, w której będzie uracyl i
komplementarna do niego adenina
d) musimy jeszcze wrzucić coś w stylu „prób odniesienia”, żeby skontrolować, czy
wyniki są wiarygodne (czy bufor był dobry, stratery nie za stare etc.)

...
Plik z chomika:
farmacjaUMP
Inne pliki z tego folderu:
Niekodujące RNA. TKN.pdf (7283 KB)
 RNA-niekodujące-2009-dla-studentów.ppt (1731 KB)
 12790947_10201188633354109_301612126006720785_n.jpg (68 KB)
 12803062_10201188632994100_1915783836328528056_n.jpg (62 KB)
 12802822_10201188633674117_2601083970834367509_n.jpg (59 KB)

Inne foldery tego chomika:

biochemia
 chemia leków
 farmakognozja
 farmakologia
 mikroby
Zgłoś jeśli naruszono regulamin





Strona główna
Aktualności
Kontakt
Dział Pomocy
Opinie


Regulamin serwisu
Polityka prywatności
Copyright © 2012 Chomikuj.pl