pytania - Genetyka kliniczna - que-hiciste

pytania.doc
(207 KB) Pobierz
2)Wymienić składniki mieszaniny PCR
Wymienić i krótko opisać etapy reakcji PCR
nested PCR
sekwencjonowane pcr - skład mieszaniny opisać i etapy
opisać southern blot i czym sie różni od northern blot; zastosowanie northern blot
dot blotting
Opis DNA fingerprinting
etapy izolacji materiału DNA
Izolacja DNA i z czego izolujesz. Jakie warunki powinno spełniac , zeby można ja dalej badac
przygotowanie materialu do badania
Mutageny i jak wpływają na DNA. Wymień rodzaje mutacji opisz je i podział mutacji
5.Metody badań molekularnych.
 Budowa DNA, RNA, własności (denaturacja, hybrydyzacja). Enzymy restrykcyjne.
Mutacje genowe.
6.Metody badań molekularnych - c.d.
 Mutacje.
Temat: Diagnostyka molekularna cz.1 + cz. 2.

1) Materiał do badań:
Krew obwodowa pobrana na EDTA (antykoagulant)
 Śluzówka policzka
 Komórki naskórka
 Nasienie
 Fibroblasty
 Cebulki włosa
 Inne komórki np. kosmówka, mięśnie itp.
 Kości, zęby <- zwęglone zwłoki
2) Etapy izolacji DNA:
 Wstępne przygotowanie materiału biologicznego do izolacji DNA:
W zależności od rodzaju i pochodzenia materiału wstępne przygotowanie może obejmować
oczyszczenie z różnego rodzaju zanieczyszczeń zewnętrznych, pożywki i pozostałości innych
komórek, a następnie rozdrobnienie, homogenizację, później zawieszenie jednolitej masy w
odpowiednim buforze
 Liza komórek:
Lizę komórek prowadzi się w zależności od rodzaju komórek i tkanek np. poprzez:
homogenizację (miękkie tk. zwierzęce), rozcieranie (tk. roślinne, kom. bakteryjne), lizę
detergentami (komórki z hodowli komórkowych, krew), lizę enzymatyczną (komórki bakteryjne,
drożdżowe, krew). Destrukcji błony towarzyszy uwolnienie DNA i innych komponentów
komórkowych do roztworu.
 Inaktywacja nukleaz komórkowych w celu zabezpieczenia DNA (np. proteinaza
K)
 Oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych komponentów kom.:
W tym celu stosuje się m.in. sole (SDS), które degradują białka (także białka histonowe)
 Zagęszczenie preparatu DNA i usunięcie zanieczyszczeń małocząsteczkowych
celem uzyskania roztworu DNA o pożądanej czystości i gęstości. Po wytrąceniu
(98% etanolem) i przemyciu (70% etanolem) DNA pozostawia się do
wyschnięcia i następnie zawiesza się w małej objętości buforu o niskiej sile
jonowej lub w wodzie.
3) Standardowe metody izolacji DNA:
 Izolacja metodą ekstrakcji fenolowej
 Izolacja z pełnej krwi z użyciem nadchloranu sodowego zamiast fenolu
 Izolacja metodą odsalania białek
 Izolacja z pełnej krwi metodą z użyciem Igepalu (IGEPAL – nazwa handlowa
preparatu)
 Izolacja za pomocą kolumienek (najczęściej stosowana i najszybsza)
 Izolacja automatyczna
4) Reakcja łańcuchowej polimerazy, PCR:
 Została opracowana w 1983 roku przez Kary’ego Mullisa, za co otrzymał on Nagrodę
Nobla w 1993 roku
 Umożliwia specyficzną amplifikację (powielanie) in vitro wybranych odcinków DNA i
RNA (przepisanych na cDNA) dzięki wykorzystaniu dwóch starterów komplementarnych
do sekwencji docelowej
 Stanowi odwzorowanie procesu replikacji DNA, ponieważ dochodzi do syntezy
komplementarnej nici DNA
 Skład mieszaniny reakcyjnej:
Matryca (DNA, cDNA)
Polimeraza Taq
Bufor
Woda
Jony Mg2+
Startery
Nukleotydy (dNTP)
 Matryca – DNA lub RNA przepisane na cDNA nie może być zdegradowane, ani
zanieczyszczone białkami, inhibitorami enz. (np. etanol, heparyna)
 Termostabilna polimeraza Taq - wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus, nie
wykazuje aktywności 3’-5’ egzonukleazy - jednego z mechanizmów naprawy błędów
podczas syntezy DNA, a więc nie ma możliwości naprawy błędów replikacji. replikacja
zachodzi z prędkością ok 1000 pz w czasie 30 s w temperaturze 72 stopni C. Główny
enzym przeprowadzający PCR.
 Bufor – zapewnia odpowiednie warunki do działania polimerazy (pH 8,3-8,8), jest
dostarczany przez producenta do polimerazy
 Woda – środowisko reakcji
2+
 Jony Mg - wiązane są przez startery, matrycę, polimerazę i dNTP; dokładność reakcji
PCR jest proporcjonalna do stężenia wolnych jonów Mg 2+ - z reguły stosuje się st. jonów
nieco większe niż stężenia dNTP, co zwiększa dokładność polimerazy
 Startery (primery) – zapewniają specyficzność reakcji; komplementarne do
określonego fragmentu nici DNA (matryca) oskrzydlającego analizowany fragment genu;
są to krótkie ( 18-28 nukleotydów), jednoniciowe fragmenty DNA; wyróżniamy 2 rodzaje
starterów: forward i reverse.
 Nukleotydy (dNTP) – dATP, dCTP, dGTP, dTTP
 Czas trwania: ok. 2 godz.
 Przebieg PCR: są to wielokrotnie (30-40) powtarzane 3-etapowe cykle:
I. DANATURACJA (94-95 st. C) – rozplatanie podwójnej nici DNA, czas ok.
30-60 s
II. WIĄZANIE STARTERÓW (40-65 st. C) – przyłączanie (hybrydyzacja)
starterów do matrycy ustalane doświadczalnie w zależności od składu
nukleotydowego starterów, czas ok. 30-60 s
III. SYNTEZA NICI/ELONGACJA (72 st. C) - właściwa amplifikacja pożądanego
fragmentu genu przez polimerazę Taq
 Zastosowanie PCR:
Ginekologia, położnictwo – m. in. niepłodność (mutacja genu CFTR),
nawracające poronienia (analiza mutacji Leiden), przedwczesne wygaszanie
czynności jajników (ekspansja powtórzeń (CGG)n w genie FMR1)
Gastroenterologia – celiakia, choroba Wilsona, hemochromatoza, nietolerancja
laktozy typu dorosłego, fruktozemia, zespół Gilberta
Kardiologia – hipercholesterolemia (analiza mutacji genu LDLR oraz APOB),
zakrzepica żył (analiza mutacji genu MTHFR), zespół hipoplazji lewego serca
(analiza mutacji w genie GJA1), zespół wydłużonego QT
Neurologia – choroba Alzheimera (analiza mutacji genu PSEN1), drżenie
samoistne, wada cewy nerwowej, zespół łamliwego chromosomu X, choroba
Huntingtona
Onkologia – badanie mutacji genu BRCA1, BRCA2 (nowotwory piersi, jajnika),
polipowatość jelita grubego, siatkówczak (retinoblastoma), rak rdzeniasty
tarczycy, czerniak
Okulistyka – zwyrodnienie siatkówki
Dermatologia – AZS, czerniak
Choroby metaboliczne, endokrynologia – choroba
Gauchera, fenyloketonuria, galaktozemia, niewrażliwość na hormony tarczycy,
otyłość (analiza genu dla receptora melanokortyny)
Inne: mukowiscydoza, tromobocytopenie (postać rodzinna), określanie płci
pacjenta (z poronienia lub gdy makroskopowo po urodzeniu lekarz nie może
stwierdzić), sekwencjonowanie genów, hybrydyzacja, monitorowanie leczenia,
mikrobiologia (HIV, prątki gruźlicy, H.pylori, Hepatitis virus A, B, C), ustalenie
grupy krwi, medycyna sądowa, farmakogenetyka (podawanie leków na miarę
genomu pacjenta – indywidualny polimorfizm)
PCR
- tylko fragmenty dwuniciowe!
- bada się DNA (2-niciowy) i RNA (reakcja z odwrotną transkryptazą  2-niciowy)
1. w probówce umieszczamy DNA, namnożony fragment DNA, interesujący nas odcinek
„zaznaczamy”
2. denaturacja – topnienie DNA w 94 st.C
3. hybrydyzacja starterów – do jednoniciowych fragmentów muszą się przyłączyć startery (=
primery, ok. 20 nukleotydów) w 50 – 60 st.C;
4. wydłużanie starterów przy użyciu polimerazy (72 st.C)
5. powstały amplikon poddajemy elektroforezie (różnicowanie wielkości fragmentu między
starterami)
- można wykryć delecję lub inercję
- amplikon można sekwencjonować
- odczyt wyniku jest ważny w diagnostyce
- zastosowanie do identyfikacji osobniczej
Reakcje multipleksowe – kilka par starterów; można wykryć kilka mutacji
5) Metoda PCR w czasie rzeczywistym (real time PCR, RT-PCR):
Umożliwia amplifikację danego fragmentu DNA z jednoczesną detekcją przyrostu
ilości w czasie rzeczywistym
 Pomiar ilość produktu jest możliwy dzięki zastosowaniu technik fluorescencyjnych
 Może być używany do jakościowych i ilościowych analiz materiału genetycznego –
wykrywanie zmian pojedynczych nukleotydów, np. pacjenci hematoonkologiczni
 Różnica między RT-PCR a PCR: w mieszaninie mamy dodatkowo specyficzne
sondy lub SybrGreen
 Rodzaje sond do RT-PCR:
o Sondy hybrydyzujące
o Sondy TaqMan
o Molecular Beacon
o I inne…
 SybrGreen:
o Barwnik fluorescencyjny wiążący się z dwuniciowym DNA (dsDNA) – to nie
jest SONDA!
o Silnie i specyficznie wiąże się do mniejszej bruzdy DNA, dając silny sygnał
wprost proporcjonalny do ilości DNA
o Wzrastająca ilość nowosyntetyzowanych nici powoduje wzrost sygnału
fluorescencji
o Nie wiąże się do ssDNA (jednoniciowe DNA)
o SybrGreen rozpoznaje sekwencje niespecyficzne
o Nietoksyczny – teoretycznie :P
o Wykorzystywany do oceny ekspresji produktu
 Sondy hybrydyzujące:
o Zbudowane z 2 cz. – każda wyznakowana barwnikiem fluorescencyjnym
o Są komplementarne do sekwencji bez lub z mutacją
o W obecności światła o określonej długości fali barwnik umieszczony na
końcu jednej z sond ulega wzbudzeniu i uwalnia energię
 Sondy TaqMan:
o Jednoniciowa (20-30 pz)
o 1 koniec – barwnik fluorescencyjny
o 2 koniec – wygaszacz
o Gdy barwnik od wygaszacza zostanie oddzielony następuje emisja promieni
-> wiemy że jest mutacja
o Sonda niehybrydyzująca – brak fluorescencji
o W czasie PCR sonda przyłącza się do sekwencji między starterami
 Molecular Beacon:
o 1-niciowa
o Tworzy strukturę spinki do włosów
o Końce są znakowane: jeden koniec fluorochromem, a drugi wygaszaczem
o W obecności komplementarnej sekwencji sonda rozwija się i hybrydyzuje do
matrycy

Oddzielenie się od siebie fluorochromu i wygaszacza powoduje
fluorescencję
o Bardzo duża czułość tej metody
 Zasady RT-PCR:
o Wykonujemy minimum 3 powtórzenia dla danej próby (ze względu na
ograniczoną czułość)
o Kontrola pozytywna
o Kontrola negatywna (NTC – non template control)
o Wewnętrzna kontrola ilości ( np. β-aktyna)
 Zastosowanie RT-PCR: wykrywanie mutacji i polimorfizmów, porównanie
aktywności genu, badanie lekooporności, monitorowanie choroby resztkowej,
oznaczenie zawartości GMO w produktach spożywczych, diagnostyka
mikrobiologiczna i wirusologia
o
6) Sekwencjonowanie DNA: technika umożliwiająca ustalenie sekwencji (kolejności zasad)
w DNA, nie musimy przy tym bawić się w sondy, obecnie jest to zloty standard;
najczęściej sekwencjonowanie wykonuje się techniką Sangera.
Ludzki genom: ponad 3 mld pz z czego 2% to sekwencje kodujące (>20 tys. genów kodujących
białka, >8 tys. genów kodujących RNA, >12 tys. pseudogenów), a 98% to sekwencje
niekodujące (introny + sekwencje niekodujące)
Metoda Sangera (metoda „dideoksy”): jest to metoda enzymatyczna; punktem wyjścia jest prąd
PCR, następnie dodajemy dideoksynukleotydy (ddNTP zamiast dNTP). Do ddNTP dołączony
jest barwnik fluorescencyjny w różnych kolorach – wynik badania to elektroforegram.
NGS (next generations sequencing) – w Polsce analizy całego genomu jeszcze nie
przeprowadza, koszt 1,5 tys $, czas 1 tydzień, problemem jest tylko odczyt wyników za względu
na ogromną ilość polimorfizmów w obrębie jednego genu; NGS jest to szybka, tania i wydajna
metoda, mało precyzyjna w porównaniu z Sangerem. Zastosowanie: sekwencjonowanie całych
genów, sekwencjonowanie wyłącznie eksonów.
MLPA – metoda do analizy mikrodelecji, na pograniczu cytogenetyki molekularnej; polega na
hybrydyzacji DNA z sondami; zastosowanie: diagnostyka prenatalna i nowotworowa
IZOLACJA MATERIAŁU GENETYCZNEGO KOMÓRKI
Materiał musi być wysokocząsteczkowy, mieć wysoki stopień czystości i nie być
pofragmentowany.
Enzymy restrykcyjne – rozpoznają pewne charakterystyczne sekwencje nukleotydów
dwuniciowego DNA i przecinają je.
Hybrydyzacja:
1. Kwas nukleinowy musi być jednoniciowy.
2. Celem hybrydyzacji jest wykrycie fragmentu, który nas interesuje np. z mutacją. Trzeba
sporządzić sondę molekularną.
Sondy – fragmenty DNA o różnej długości otrzymane drogą:
- klonowania
-syntezy chemicznej
- naturalne lub syntetyczne geny i ich fragmenty
- cDNA...
Plik z chomika:
que-hiciste
Inne pliki z tego folderu:





genetyka-met molekularne.part1.rar (22528 KB)
genetyka-metody molekularne2.part1.rar (22528 KB)
genetyka-metody molekularne2.part2.rar (22528 KB)
genetyka-metody molekularne2.part3.rar (22528 KB)
genetyka-metody molekularne2.part4.rar (21339 KB)
Inne foldery tego chomika:

Diagnostyka laboratoryjna
Etyka i deontologia
 Farmakologia
 Immunologia
 Interna

Zgłoś jeśli naruszono regulamin





Strona główna
Aktualności
Kontakt
Dział Pomocy
Opinie


Regulamin serwisu
Polityka prywatności
Copyright © 2012 Chomikuj.pl