Właściwości małych interferencyjnych RNA
advertisement
Właściwości interferencyjnych RNA małych Zjawisko interferencji RNA funkcjonujące jako mechanizm regulacji ekspresji genów odkryto niemal dwie dekady temu. RNAi wzbudziło duże zainteresowanie w świecie nauki. Eksperyment z wykorzystaniem syntetycznych siRNA pokazał, że może to być nie tylko jeden z procesów zachodzących w komórkach, ale również metoda dająca nadzieję na wykorzystanie w terapii, gdy pojawiają się trudności ze stosowaniem klasycznych metod leczenia. Wiele przeprowadzonych badań nad RNAi pozwoliło poznać właściwości siRNA. Dzięki temu projektując sekwencje syntetycznych małych interferencyjnych RNA można próbować uniknąć przynajmniej części działań niepożądanych. Jest to bardzo ważny etap na drodze do zastosowania siRNA w medycynie. Mechanizm wyciszania genów z wykorzystaniem interferencyjnego RNA (RNAi) był opisywany na łamach Doliny Biotechnologicznej. Zasadniczo można tu rozróżnić dwa rodzaje RNA biorące udział w wyciszaniu genów: dwuniciowe RNA (dsRNA) oraz mikroRNA (miRNA). W pierwszym przypadku dsRNA może być efektem ekspresji trans genu, lub replikacji wirusowego genomu RNA. Proces związany z interferencją RNA jest w tym przypadku mechanizmem obronnym komórki przed inwazją obcych wirusów czy transpozonów [1]. Z kolei w drugim przypadku komórka w egzonach posiada geny z których polimeraza II RNA transkrybuje prekursory pri-mikroRNA (ok. 70 nukleotydów) o kształcie „spinki do włosów”, które przechodzą proces dojrzewania. Dalszy mechanizm działania jest zbliżony niezależnie od pochodzenia RNA [2,3]. Dwuniciowy RNA jest cięty do krótkich odcinków (od 21 do 23 par zasad) przez wielodomenową nukleazę Dicer. Powstałe w ten sposób produkty hydrolizy są włączane do kompleksu RISC (ang. RNA-induced silencing complex – indukowany przez RNA kompleks wyciszający), który jest kierowany do docelowej sekwencji mRNA. Znajdująca się w RISC endorybonukleaza wykorzystuje antysensowną nić siRNA (małe interferencyjne RNA ang. Small interfering RNA) do odnalezienia komplementarnego do niej fragmentu mRNA. Z tego powodu siRNA bywa nazywany dupleksem kierującym. Specyficzność mechanizmu RNAi opiera się na dokładnym sparowaniu antysensownej nici siRNA z docelowym mRNA. Jeżeli takie sparowanie dojdzie do skutku, endorybonukleaza hydrolizuje komplementarną sekwencję mRNA [4]. W przypadku miRNA sparowanie nie musi być aż tak dokładne. Może opierać się na komplementarności tzw. rejonu seed – nukleotydów w pozycjach 2-8 od końca 5” nici aktywnej (antysensownej). Ponadto w przypadku miRNA hamowanie aktywności genu częściej odbywa się poprzez represję translacji niż degradację mRNA [5]. Przełomowym odkryciem, istotnym dla wykorzystania zjawiska interferencji RNA w terapii, było wprowadzenie do komórki syntetycznego siRNA [6]. Jednak ze skuteczną inkorporacją siRNA do komórki wiąże się szereg wymogów związanych doborem sekwencji docelowej, budową RNA, funkcjonowaniem kompleksów białkowych zaangażowanych w proces wyciszania genów, czy konieczność zabezpieczenia siRNA podczas wprowadzania do komórki przed działaniem nukleaz. Sekwencja docelowa Sekwencja docelowa to miejsce w genie komplementarne dla wybranego siRNA, dzięki czemu krótki RNA będzie mógł zainicjować proces regulacji ekspresji wybranego genu. Sekwencje docelowe mogą znajdować się w niekodujących rejonach mRNA od końca 5’ i 3’ (ang. UnTranslated Region, 5’ i 3’UTR). Mogą też znajdować się w sekwencji kodującej – 70 do 100 nukleotydów od kodonu START translacji. Są to zarazem sekwencje, gdzie liczba nukleotydów G+C mieści się w granicach od 30 do 70%. Ich dostępność jest uzależniona od odległości od kodonu START. Położone blisko niego mogą nie być dostępne dla siRNA ze względu na asocjacje tego regionu z białkami [7]. Budowa siRNA siRNA powstające w wyniku hydrolizy dsRNA przez rybonukleazę Dicer wykazuje się charakterystyczną budową. Obie nici mierzą od 21 do 23 nukleotydów. Tworzą one dupleks na odcinku 19 par nukleotydów, pozostawiając dwa lub więcej wolnych nukleotydów na końcach 3’. Na końcu 3’ znajduje się wolna grupa hydroksylowa, natomiast na końcu 5’ grupa fosforanowa. Obecność grupy fosforanowej na końcu 5’ nici antysensownej ma wpływ na występowanie procesu interferencji RNA. Grupa ta została określona jako punkt odniesienia, od którego mierzone jest miejsce hydrolizy mRNA przez endonukleazę znajdującą się w kompleksie RISC. Warunkiem poprawnego działania siRNA jest jego homologia względem jednego wybranego genu. Nawet częściowa homologia względem innych genów może prowadzić do niespecyficznego i nieplanowanego ich wyciszania, czego skutkiem jest wystąpienie niepożądanych efektów (ang. off-target effects) [8]. Dupleks, który jest homologiczny względem więcej niż jednej sekwencji genowej jest w stanie skutecznie hamować działanie wybranego genu. Może jednak równocześnie częściowo hybrydyzować z innym transkryptem, zgodnie z mechanizmem działania miRNA. Wykorzystuje wówczas komplementarność rejonu seed. Z tego względu należy unikać homologii tego regionu do sekwencji genów innych niż gen docelowy. siRNA może zostać zabezpieczone przed wystąpieniem off-target effects poprzez wprowadzenie modyfikacji chemicznych w pozycji 2 nici antysensownej. Ryc. 1 Struktura klasycznego siRNA. Opracowanie własne. Przeprowadzono badania wskazujące na to, że nie tylko dupleks o klasycznej budowie złożony z dwóch komplementarnych nici 21-nt z dwoma niesmarowanymi nukleotydami na końcach 3’, może wydajnie uczestniczyć w wyciszaniu genów. Ograniczeniem długości jest 30 par zasad. Dupleksy przekraczające rozmiarami tę liczbę mogą wywoływać niespecyficzną odpowiedź komórki. Interferencyjne RNA, którego nici są dłuższe niż 21 nukleotydów staje się substratem dla nukleazy Dicer. Może to zwiększać ich aktywność w procesie interferencji RNA, co związane jest z bezpośrednim przeniesieniem produktu hydrolizy Dicer do kompleksu RISC. W badaniach wykorzystywano również asymetryczne dupleksy o różnej długości nici sensownej i antysensownej. Testowano między innymi układy gdzie nić sensowna mierzyła od 15 do 19nt natomiast nić antysensowna 21nt [9]. Taka konstrukcja dupleksu może stać się zabezpieczeniem przed udziałem nici sensownej w reakcjach niespecyficznych. Ponadto, jeśli nić sensowna nie będzie posiadać dwóch wolnych nukleotydów na końcu 3’ – nie będzie rozpoznawana i kierowana do kompleksu RISC. Co więcej, „tępy” koniec 3′ nici sensownej pomaga w inkorporacji nici antysensownej do kompleksu RISC. Funkcjonalnie można dupleks zbudować z trzech nici. Nić antysensowna pozostaje niezmieniona. Natomiast zamiast jednej nici sensownej opracowano dwie krótkie: 9 i 12 nukleotydów. Powstaje w ten sposób sisiRNA (ang. small internally segmented interfering RNA). Tak skonstruowane RNA może bardzo wydajnie brać udział w procesie wyciszania genów. W badaniach interferencji RNA wykorzystano też zwinięte z jednej nici RNA, aby uzyskać siRNA struktury spinki do włosów (ang. short hairpin – shRNA. Skutecznie zastosowano również nietypowe cykliczne siRNA (ang. dumbbell siRNA), które jak się okazuje również może brać udział w wyciszaniu genów. W przypadku shRNA lub struktury cyklicznej nukleaza Dicer rozpoznaje takie RNA [10], a następnie hydrolizuje je wytwarzając typowe dupleksy siRNA. Zaletą dumbbell siRNA jest wyższa o około 20°C temperatura topnienia, co zwiększa stabilność struktury RNA [11]. Ryc. 2. Przykładowe modyfikacje struktury siRNA. Opracowanie własne. Dużym ułatwieniem dla wszystkich zamierzających projektować siRNA są programy pomagające zaplanować miejsca w wyciszanym genie, jak również proponujące sekwencje nici siRNA [12]. Immunostymulacja Jak już wcześniej zostało wspomniane, długie dupleksy liczące powyżej 30 par zasad mogą w większości komórek somatycznych wywoływać obok interferencji RNA również szereg niespecyficznych odpowiedzi. Odpowiedź interferonowa na tej długości dupleks może prowadzić do śmierci komórki. RNA w cytoplazmie rozpoznawane jest przez immunorecptory TLR (ang. Toll-Like Receptors), kinezę białkową zależną od RNA (PKR, ang. Double-Strand RNA Dependent Protein Kinase) a także helikazy RIG-1 oraz MDA5 [13]. Zostały zidentyfikowane motywy występujące w sekwencji RNA, które działają immunostymulująco. Są to: 5’-UGUGU-3’, 5’-GUCCUUCAA-3’. Wiadomo, że każda sekwencja bogata w uracyl (U) może być rozpoznana przez immunorecptor TLR7. Z kolei wpływ na aktywację helikazy RIG-1 może mieć obecność 5’-trifosforanu lub „tępych” końców dupleksu (jest to sytuacja, gdy obie nici kończą się wspólną parą nukleotydów). W przypadku siRNA zbudowanego z nici mierzących od 23 do 30 par zasad, możliwa jest odpowiedź interferonową. Niektóre metody transefekcji dupleksu do komórki mogą być przyczyną odpowiedzi immunologicznej. Na przykład zastosowanie nośników liposomowych lub specyficznych przeciwciał będzie wywołać taką odpowiedź, podczas gdy elektroporacja jej nie indukuje [14]. Poważnym problemem związanym z inkorporacją siRNA do komórki jest rozpoznanie ich jako cząsteczek nieswoistych. Negatywnie zweryfikowane RNA jest hydrolizowane przez nukleazy znajdujące się w cytoplazmie. Pierwszym sposobem zapobiegania enzymatycznej hydrolizie siRNA jest zastosowanie naturalnie modyfikowanych nukleozydów takich jak pseudourydyna lub 5metylocytydyna. Drugim jest modyfikacja wiązania internukleotydowego (fosfodiestrowego) [15]. Można tego dokonać podmieniając niemostkowany atomu tlenu innym podstawnikiem takim jak atom siarki (tiofosforany), grupę aminową (amidofosofrany) czy borowodorową (boranofosforany) [16]. Zastępienie grupy wodorotlenową w pozycji C2’ pierścienia rybozy przez modyfikacje chemiczne (2’deoksy-, 2’-O-Me, 2’-fluoro- i podobne) również jest sposobem przeciwdziałania odpowiedzi immunologicznej komórki[17]. Podstawowym warunkiem poprawnego działania siRNA jest jego homologia względem jednego wybranego genu. Źródło: pdb101.rcsb.org, doi:10.2210/rcsb_pdb/mom_2008_2, autor David Goodsell, licencja CC-BY-4.0 Wprowadzenie syntetycznych siRNA do komórki dało nadzieję na wykorzystanie interferencji RNA w medycynie. Jednak jak każda metoda również i ta poza zaletami posiada również ograniczenia wynikające z budowy, funkcjonowania i oddziaływań w jakie mogą włączać się małe interferencyjne RNA. Najistotniejszym elementem podczas ich projektowania jest wybór sekwencji i struktury dupleksu. Planując wykorzystanie tych cząsteczek jako narzędzi terapii trzeba pamiętać o ich właściwościach. Można je korzystnie zmienić stosując modyfikacje chemiczne. W efekcie nastąpi poprawa stabilności struktury, wzrośnie odporność na działanie nukleaz, zredukowana zostanie przynajmniej część niepożądanych efektów stosowania tej metody. Piśmiennictwo 1. Olszak K. Zjawisko interferencji RNA u zwierząt i ludzi. Dolina Biotechnologiczna. 03.05.2016 2. Andrzejczak O. MikroRNA w terapii nowotworów (I) — małe cząsteczki o wielkim znaczeniu. Dolina Biote chnologiczna. 21.10.2015 3. Andrzejczak O. MikroRNA w terapii nowotworów (II) — o miRNA i nowotworzeniu. Dolina Biotechnologiczna. 21.10.2015 4. Hannon GJ. RNA interference. Nature, 2002, 418, 6894: 244-51. 5. Birmingham A. Et al. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 2006, 3, 3:199-204. 6. Elbashir S. et al. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev, 2001, 15, 2: 188–200. 7. Hajeri PB, Singh SK. siRNAs: their potential as therapeutic agents–Part I. Designing of siRNAs. Drug Discov Today. 2009, 4, 17-18: 851-8. 8. Jackson AL. et al. Widespread siRNA “off-target” transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity. RNA. 2006, 12, 7: 1179–1187. 9. Chang CI. et al. Asymmetric shorter-duplex siRNA structures trigger efficient gene silencing with reduced nonspecific effects. Mol Ther. 2009, 17, 4:725-32. 10. Siolas D. et al. Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers. Nat Biotechnol. 2005, 23, 2:227-31. 11. Pieczyński M. i wsp. Zastosowanie cząsteczek RNA w modelowaniu ekspresji wybranych genów. Biotechnologia. 2010, 3, 90: 7-28. 12. Fakhr E. et al. Precise and efficient siRNA design: a key point in competent gene silencing. Cancer Gene Ther. 2016, 23, 4:73-82. 13. Schlee M. et al. siRNA and isRNA: two edges of one sword. Mol Ther. 2006, 14, 4: 463-70. 14. Song E. et al. Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors. Nat Biotechnol. 2005 Jun;23(6):709-17. 15. Sierant M. Modyfikowane chemicznie dupleksy siRNA. Biotechnologia. 2010, 3, 90: 146-172. 16. Li ZY. et al. The effects of thiophosphate substitutions on native siRNA gene silencing. Biochem Biophys Res Commun. 2005, 15, 329, 3:1026-30. 17. Prakash TP. et al. Positional effect of chemical modifications on short interference RNA activity in mammalian cells. J Med Chem. 2005, 30, 48, 13:4247-53. Data publikacji: 24.05.2016r.
