Programy do projektowania siRNA,Przygotowanie liniowych
advertisement
Programy do projektowania siRNA Zjawisko interferencji RNA poznane zostało stosunkowo niedawno, bo w latach 90. XX wieku. Bardzo szybko jednak doceniono jego rolę, bo już w 2006 roku za jego odkrycie Andrew Z. Fire oraz Craig C. Mello otrzymali nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny i fizjologii. O tym, że decyzja o uhonorowaniu tego odkrycia jest słuszna może świadczyć duża ilość publikacji opisujących RNAi, jak również wiele prób wykorzystania go w terapii różnych chorób. Kluczowym elementem w procesie interferencji jest krótki dwuniciowy RNA. Wsparcie w jego przygotowaniu niosą programy pomagające w projektowaniu krótkich interferencyjnych RNA. Są to bardzo przydatne narzędzia, których zadaniem jest ułatwienie przygotowania RNA o takiej sekwencji i budowie, aby doprowadzić do wyciszenia wybranego genu. Interferencyjne RNA zostało już zaprezentowane w dwóch artykułach opublikowanych na stronach Doliny Biotechnologicznej. Pierwszy z nich był omówieniem zjawiska interferencji RNA. W kolejnym artykule natomiast zostały omówione różne właściwości, o których warto pamiętać podczas projektowania krótkich RNA. Warto przypomnieć, że podstawowym warunkiem prowadzącym do wyciszenia wybranego genu jest dokładne sparowanie antysensownej nici siRNA z docelowym mRNA. Choćby częściowa niehomologiczność krótkiego RNA może być przyczyną niespecyficznego i nieplanowanego wyciszania innego genu niż planowany, czego skutkiem jest wystąpienie niepożądanych efektów (ang. off-target effects) [1]. W ostatniej fazie procesu interferencji RNA udział bierze dwuniciowy krótki RNA. Każda z jego nici zbudowana jest z 21 nukleotydów. Stwierdzono jednak, że można również wykorzystać w wyciszaniu genów także nieco inaczej zbudowane RNA. Warto przypomnieć w tym miejscu sisiRNA (ang. small internally segmented interfering RNA) – dupleks zbudowany z trzech nici: antysensownej liczącej 21 nukleotydów oraz dwóch krótkich zamiast jednej sensownej. W badaniach interferencji RNA wykorzystano też siRNA o strukturze spinki do włosów (ang. short hairpin – shRNA). Skutecznie zastosowano również nietypowe cykliczne siRNA (ang. dumbbell siRNA). Projektując siRNA trzeba wziąć pod uwagę opisane powyżej i poprzednio uwarunkowania, jak również kilka innych dotyczących sekwencji krótkiego RNA [2]. Dobór sekwencji krótkiego RNA musi zapewnić homologię nici antysensownej z wybranym mRNA. Jednocześnie też dobierając sekwencję mRNA i siRNA należy brać pod uwagę dostępność nici mRNA, oraz czy wybrana sekwencja pozwoli zaprojektować poprawnie zbudowane krótkie RNA. Ważnym parametrem jest ilość par GC w projektowanym siRNA. W literaturze można napotkać dwa nieco różniące się zakresy. Pierwszy to przedział pomiędzy 31,6 a 57,9% [3], drugi natomiast mieści się w zakresie pomiędzy 36 i 52%. Pożądane jest by w przypadku nici antysensownej procent nukleotydów G i C na odcinkach od drugiego do siódmego oraz od ósmego do osiemnastego nukleotydu zawierał się pomiędzy 19 i 52%. Warto przy tym pamiętać, że pomiędzy 10 i 11 nukleotydem wypada miejsce gdzie następuje hydroliza sparowanej nici mRNA. Sekwencje GGGG lub CCCC niosą ryzyko tworzenia się nie pożądanych struktur szpilkowych. Z kolei więcej niż trzy kolejne A lub U może być odczytane przez polimerazę III jako miejsce transkrypcji poli U [5]. Podstawą powstania i utrzymania odpowiedniej struktury RNA jest szereg zależności termodynamicznych określonych dla poszczególnych fragmentów RNA, jak i dla całej cząsteczki. Z punktu widzenia termodynamiki najtrwalsza jest struktura o najniższej energii swobodnej, będącej sumą energii poszczególnych fragmentów struktury cząsteczki. Istotnym parametrem dla kwasów nukleinowych jest temperatura topnienia (TM – ang. melting temperature). Jest to temperatura, w której 50% badanego w próbie RNA lub DNA ulega denaturacji [6]. Dla siRNA wartość ta z reguły nie przekracza 20°C. Większa ilość par GC może zwiększyć stabilność struktury RNA. Z kolei duża ilość par AU będzie destabilizować dupleks. Co jest ważne w przypadku, gdy siRNA będzie wykorzystywane w temperaturze na przykład 37°C. Mało stabilny region ze względu na zależności termodynamiczne znajduje się pomiędzy dziewiątym i czternastym nukleotydem w dupleksie siRNA [7]. Podstawy przewidywania struktury RNA Wymienione wyżej zależności zostały wykorzystane podczas opracowywania algorytmów, które stały się podstawą do stworzenia programów wspomagających projektowanie siRNA. Narzędzia pozwalające generować możliwe wersje drugorzędowej struktury RNA są wykorzystywane od lat 90. XX wieku. W oparciu o zastosowany algorytm pozwalają one przewidywać budowę drugorzędową dla wybranych sekwencji RNA. Niektóre z tych programów oparte są na badaniu właściwości termodynamicznych RNA [8]. Program mając podaną sekwencję przelicza wartości energii swobodnej i proponuje różne wersje struktury drugorzędowej, jakie mogą powstać dla podanej sekwencji nukleotydów. Za przykład tego typu programu może posłużyć m-fold, który został opracowany przez zespół Michaela Zukera. Jest to program, który może być przydatny również w przypadku projektowania siRNA, aby dla wybranej sekwencji przetestować parametry termodynamiczne cząsteczki [9]. Programy wspomagające projektowanie siRNA mają za zadanie wspomóc dobór sekwencji RNA homologicznej do fragmentu mRNA. W ich przypadku algorytmy opracowane są nie tylko w oparciu o termodynamiczne podstawy istnienia dupleksów. Brane są też pod uwagę inne wspomniane właściwości siRNA. Przegląd wybranych programów wspomagających projektowanie siRNA BLOCK-iT™ RNAi designer Program dostępny pod adresem https://rnaidesigner.lifetechnologies.com został udostępniony przez Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA), jako strona internetowa. Daje on możliwość wyboru sześciu opcji różnych krótkich RNA. W tym miRNA i siRNA, specjalnych siRNA oferowanych przez firmę udostępniającą program. Możliwe jest także generowanie struktury szpilki do włosów shRNA. Procedura działania została podzielona na pięć kroków: 1. Należy podać Accession number lub sekwencję nukleotydową. 2. Wybrać należy region mRNA: Otwarta ramka odczytu (ang. open reading frame – ORF), 5’ UTR lub 3’UTR. 3. Wybrać organizm z pośród trzynastu możliwych na czele z człowiekiem dla porównania sekwencji w bazie BLAST (ang. Basic Local Alignment Search Tool. Dzięki temu można sprawdzić czy wybrane siRNA nie będzie homologiczne względem innych genów, niż wybrany do wyciszenia. 4. Należy wybrać procent par GC. Możliwy wybór zamyka się w przedziale od 20 do 90%. 5. Wybór algorytmu. Do wyboru jest domyślny algorytm lub alternatywnie Tuschl’s Motif Pattern [10]. Długość siRNA jest ograniczona do 19 nukleotydów. W przypadku struktur szpilkowych do wyboru są trzy sekwencje pętli: GAGA, AACG i CGAA [5]. GenScript siRNA Target Finder Program znajduje się na stronach GenScript USA Inc. (Piscataway, NJ, USA) – https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai. Dostępny jest po zarejestrowaniu się i zalogowaniu na stronie http://www.genscript.com/. W programie istnieje możliwość ustawienia parametrów stosowanego algorytmu – metody (Statistical Model (pattern:AAN19) lub Machine Learning (pattern:N21)). Do wyboru jest procent udziału par GC – domyślnie jest to przedział 30-60%. Można wybrać maksymalną ilość otrzymywanych siRNA. Do wyboru jest też organizm i tkanki – z tym, że mimo większej listy wyboru różnych zwierząt baza jest dostępna dla człowieka, myszy i szczura. Na koniec przed rozpoczęciem sprawdzania siRNA należy wkleić sekwencję cDNA wybranego mRNA. Program generuje tylko siRNA o długości 21 nukleotydów. Dla struktur szpilkowych jest dostępna pętla TTGATATCCG [5]. Oligowalk for siRNA design Program został opracowany przez zespół David H. Mathewsa z University of Rochester Medical Center. Dostępny jest pod adresem http://rna.urmc.rochester.edu/cgi-bin/server_exe/oligowalk/oligowalk_form.cgi Działanie programu opiera się na przeliczeniu danych termodynamicznych związanych z hybrydyzacją nici antysensownej do mRNA niosącego gen przeznaczony do wyciszenia [11]. Obsługa programu jest bardzo prosta i sprowadza się do wpisania nazwy oraz sekwencji lub wysłaniu pliku z sekwencją w formacie fasta. Wadą programu jest brak aktualizacji od 2008 roku. RNAi codex Program został opracowany przez Cold Spring Harbor Laboratory. Dostępny jest pod adresem http://codex.cshl.edu/. Program jest opracowany pod kątem pracy z shRNA. Struktur szpilkowych można szukać korzystając z dostępnych opcji lub przez wysłanie pliku z sekwencją. Program ma ograniczenia. Wyszukiwanie ograniczone jest do sekwencji człowieka, myszy i szczura. Dostępne są tylko sekwencje pętli dwóch ludzkich miRNA mir-30 oraz mir-1. Długość ramienia shRNA liczy 21 par nukleotydów [12]. RNAi explorer Kolejny z programów można znaleźć na stronie http://www.genelink.com/sirna/RNAicustomorder.asp. Został opracowany przez Gene Link Inc. (Westchester, NY, USA). Oddzielna strona jest przeznaczona dla shRNA: http://www.genelink.com/sirna/shRNAi.asp Obie jednak są do siebie podobne. Istnieje możliwość wprowadzenia danych o sekwencji w postaci GeneID, Accession Number. Można też przesłać plik lub wkleić samą sekwencję. Istnieją też opcje do wyboru udziału par GC. Jest tu wybór tylko między trzema podanymi zakresami: 30-40, 40-50 oraz 50-60%. Program generuje siRNA zawierające 19 par nukleotydów. W przypadku shRNA program jest bardziej rozbudowany. Są do wyboru trzy sekwencje pętli: TTCG, TCAAGAG, GAAGCTTG lub inna do samodzielnego wpisania. Długość shRNA jest również dostępna jako opcja do wyboru [5]. RNA Wizard v3.1 Program firmy InvivoGen jest dostęny pod adresem http://www.sirnawizard.com/design_advanced.php. Wyróżnia się umieszczoną na górze prostą instrukcją obsługi. Pod nią jest miejsce na wpisanie nazwy, wklejenie sekwencji (maksymalnie: 9600bp) i ustawienie parametrów. Standartowo przewidziane jest siRNA zbudowane z nici po 21 nukleotydów, ale istnieje możliwość zmiany. Do wyboru są trzy bazy danych dla mRNA i miRNA SEED. Wybór jest ograniczony do człowieka, myszy i szczura. W wersji rozbudowanej, którą można wybrać z bocznego paska można również wprowadzić ograniczenia dla wybranego regionu siRNA, można wybrać procentowy udział par GC. Również z bocznego paska można wybrać wersję programu pozwalającą zbudować z siRNA strukturę szpilkową. Domyślna sekwencja pętli to TCAAGAG [5]. siDesign Center Ten program dostępny jest pod adresem: http://dharmacon.gelifesciences.com/design-center/. Znajduje się na stronie GE Healthcare Dharmacon Inc. Obsługa programu odbywa się w czterech krokach. Sekwencję można wprowadzić bądź podając jej dane np. Accession number, bądź też wpisując sekwencje w formacie fasta. W drugim kroku wybiera się region mRNA, który będzie miejscem hybrydyzacji nici antysensownej z mRNA. Do wyboru jest 5’ lub 3’ UTR lub ORF. W kroku trzecim wybiera się procentowy udział par GC. Jako domyślny proponowany jest przedział 30-64%. W kroku czwartym można skorzystać z sprawdzenia bazy BLAST. Program generuje siRNA złożone z 19 par nukleotydów. Dział pomocy dla użytkowników jest napisany bardzo szczegółowo zaczynając od wyjaśnienia podstawowych pojęć. Jest też przy tym bardzo przejrzyście ułożony, dzięki czemu początkujący użytkownik nie pogubi się w tej lekturze [5]. siDirect version 2.0 Ostatni z opisywanych szerzej programów znajduje się pod adresem http://sidirect2.rnai.jp/. Strona programu jest bardzo oszczędna i na początek pokazuje tylko miejsce na wpisanie accession number lub wklejenie sekwencji. Opcje dostępne są pod linkiem na dole strony. Program pozwala na wybór jednego z trzech algorytmów: Ui-Tei [13], Reynolds [4], Amarzguioui [3]. Możliwy jest też wybór jednej z trzech kombinacji wymienionych algorytmów. Można również regulować temperaturę topnienia, czy procentowy udział par GC. Bardzo przejrzyście opracowana została strona pomocy z graficznym przedstawieniem poszczególnych opcji [14]. Korzystając z wyżej prezentowanych lub innych dostępnych programów zazwyczaj projektuje się od trzech do pięciu dupleksów siRNA skierowanych na dany gen. W ten sposób można wybrać najaktywniejsze cząsteczki, nie powodujące niepożądanego wyciszania genów [15] Poza wymienionymi wyżej programami powstało jeszcze kilkanaście podobnych programów. Nie wszystkie z nich są obecnie dostępne. Zapewne każdy użytkownik będzie w stanie znaleźć taki program, który okaże się być wygodnym w obsłudze i jednocześnie będzie generował sekwencje siRNA spełniające wszystkie wymagania związane z wyciszaniem wybranego genu. Ważną pomocą w procesie wyciszania ekspresji genów są programy wspierające projektowanie siRNA Schemat budowy drugorzędowej shRNA. Źródło - opracowanie własne K. Olszak, na podstawie Ziomek K. Kierzek R. Drugorzędowe motywy strukturalne RNA. Postepy Biochem. 1999, 45, 2: 80-7. licencja CC BY 3.0 Przedstawione programy zostały opracowane przez grupy zajmujące się badaniami interferencji RNA lub przez firmy zajmujące się produkcją odczynników czy syntezą oligonukleotydów dla potrzeb biologii molekularnej. Prezentują różny poziom dostępności ustawień parametrów mających wpływ na jakość projektowanych siRNA. Programy bardziej rozbudowane są z pewnością trudniejsze do obsługi dla szczególnie dla użytkowników, którzy rozpoczynają swoją pracę przy projektowaniu siRNA. Z drugiej strony jednak większa liczba opcji do ustawienia przez użytkownika daje możliwość lepszego doboru sekwencji krótkiego RNA – takiej która będzie skutecznie wygaszała ekspresję tylko wybranego genu. Piśmiennictwo 1. Jackson AL. et al. Widespread siRNA “off-target” transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity. RNA. 2006, 12, 7: 1179–1187. 2. Olszak K. Właściwości małych interferencyjnych RNA. Dolina Biotechnologiczna. 24.05.2016 http://dolinabiotechnologiczna.pl/nowosci/wlasciwosci-malych-interferencyjnych-r na/ 3. Amarzguioui M. Prydz H. An algorithm for selection of functional siRNA sequences. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 316, 1050-1058. 4. Reynolds A. Et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 326-330. 5. Fakhr E. et al. Precise and efficient siRNA design: a key point in competent gene silencing. Cancer Gene Ther. 2016, 23, 4:73-82. 6. Freier SM. Et al. Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex stability. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Dec; 83(24): 9373–9377. 7. Khvorova A. Et al. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 2003; 115: 209–216. 8. Mathews DH. Et al. Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure. J. Mol. Biol. 1999, 288, 911-940. 9. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 2003, 31, 13, 3406-3415, 2003. 10. Elbashir S. et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2004, 411, 6836: 494-8. 11. Lu ZJ, Mathews DH. OligoWalk: an online siRNA design tool utilizing hybridization thermodynamics. Nucleic Acids Res. 2008. 36: W104–W108. 12. Olson A. Et al. RNAi Codex: a portal/database for short-hairpin RNA (shRNA) gene-silencing constructs. Nucleic Acids Research. 2005, 34, D153-D157. 13. Ui-Tei K. Et al. Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference. Nucleic Acids Res. 2004, 32, 936-948 14. Naito Y. Et al. siDirect 2.0: updated software for designing functional siRNA with reduced seed-dependent off-target effect. BMC Bioinformatics. 2009, 10:392 15. Sierant M. Modyfikowane chemicznie dupleksy siRNA. Biotechnologia. 2010, 3, 90: 146-172. Przygotowanie liniowych standardów do reakcji Real-Time PCR (protokół) Niejednokrotnie zdarza się, że projektujemy własną metodykę opartą o technikę Real-Time PCR. Największym problemem przy optymalizacji gotowej metody, zarówno na etapie badań naukowych, jak i standaryzacji oraz komercjalizacji, jest przygotowanie odpowiednich standardów. Jak zrobić to najprościej? Krzywe standardowe przygotowuje się zwykle na bazie plazmidów- kolistych lub linearyzowanych (poprzez cięcie restrykcyjne). Pokutuje teoria, że takie cząsteczki zachowują się podczas Real-Time PCRu tak samo jak mieszanina różnych cząsteczek we właściwej reakcji z cDNA, podczas gdy reamplifikacja produktu PCR ma inną kinetykę niż właściwego cDNA, przez co ilościowanie jest zafałszowane. Niewielu zdaje sobie sprawę, że jest to mit. Zamiast linearyzowanych cząsteczek plazmidu wystarczy użyć produktu PCR namnożonego na „szerszych” starterach, niż startery używane podczas właściwej reakcji ilościowej. Oto prosty przepis na standardy: * Zaprojektuj specyficzny, dobrze działający PCR na starterach zewnętrznych względem starterów użytych do Real-Time’u o ok. 100-200nt z każdej strony (patrz rycina) * Zamplifikuj dużą ilość matrycy na zewnętrznych starterach. Oczyść produkt na kolumienkach, pozbywając się zanieczyszczeń i buforu reakcyjnego. (KITy do oczyszczania produktu PCR oferowane są na polskim rynku przez wiele firm) * Zmierz przy pomocy Nanodropa lub innego spektrofotometru stężenie matrycy wobec buforu użytego do elucji produktu PCR. * Przelicz stężenie według poniższego wzoru: Liczba kopii w 1ul Lk =(x * 6.022×1023)/(długość matrycy w pz*1×109 * 650), gdzie x to wartość stężenia wyrażona w ng/ul. Żeby zrobić to szybko i bez pomyłek, użyj gotowego kalkulatora * Rozcieńcz standard w dowolny sposób. Pierwszego stężenia przygotuj tyle, żeby starczyło go na wszystkie eksperymenty, jeżeli zabraknie go, należy kolejny batch pierwszego standardu wywzorcować w Real-Time PCR z uwzglęnieniem standardu używanego wcześniej! Przykład: * Produkt Real-Time PCRu ma 223 pz. Zewnętrzne względem nich startery mają 580pz. * Po amplifikacji i sprawdzeniu na żelu agarozowym jakości i wysokości prążka (silny, wąski prążek produktu o wielkości ~580pz) oczyszczamy próbkę na żelu. * Zmierzone stężenie wynosi 26ng/ul. * Wstawiamy wartości 26 i 580 w odpowiednie miejsca kalkulatora (lub liczymy ręcznie). Wyliczona wartość to 4,15×10^10 * Żeby przygotować kolejne rozcieńczenia pipetujemy np. po 90ul H2O (lub buforu do elucji, zależy czym eluowaliśmy) do kolejnych próbówek, po czym do pierwszego rozcieńczenia dodajemy 10ul. Przygotowanego standardu, vortexujemy, następnie do 2-go standardu 10ul pierwszego itd. Podczas RealTime’u definiujemy kolejne stężenia jako 4,15×10^10, 4,15×10^9, 4,15×10^8 itd. Uwagi dotyczące metody: Metoda obliczenia opiera się na założeniu, że średnio mol 1 pary zasad waży 650g (czyli 1 para zasad 650 Daltonów). Oczywiście można obliczyć dokładną wagę naszej matrycy, używając skryptu zliczającego ilość par GC i AT, mnożąc to następnie przez ich wagę, ale doświadczenie podpowiada, że jest to niepotrzebne. Stężenie oczyszczonego produktu PCR mierzone spektrofotometrycznie także nie jest bardzo dokładne, ale jeżeli amplifikacja poszła dobrze, taka dokładność wystarcza. Jeżeli zmierzone stężenie produktu jest mniejsze niż 10ng/ul (czyli mocno zawyżone z powodu bliskiego poziomu tła), polecam powtórzyć amplifikację, to na pewno lepsze niż powtarzanie całej procedury przygotowania standardów, jeżeli okazałoby się że ilościowy PCR nie chodzi przy 10 czy też 100 kopiach na reakcję. Ważną pomocą w procesie wyciszania ekspresji genów są programy wspierające projektowanie siRNA Schemat budowy drugorzędowej shRNA. Źródło - opracowanie własne K. Olszak, na podstawie Ziomek K. Kierzek R. Drugorzędowe motywy strukturalne RNA. Postepy Biochem. 1999, 45, 2: 80-7. licencja CC BY 3.0 Niepłodność o podłożu immunologicznym- przeciwciała przeciwplemnikowe Przeciwciała przeciwplemnikowe (ang. Antisperm Antibodies, ASAs) są jednym z głównych czynników odpowiedzialnych za wywoływanie niepłodności na tle immunologicznym. Mogą one być produkowane zarówno przez kobiety jak i mężczyzn. ASAs są przyczyną całkowitego zahamowania płodności lub tylko jej zmniejszenia. Dzięki rozwojowi diagnostyki laboratoryjnej i wykorzystaniu odpowiednich testów można oceniać ASAs jakościowo, półilościowo lub ilościowo w nasieniu, surowicy krwi lub śluzie szyjki macicy. Niepłodność immunologiczna dotyczy 9 – 36% par. ustalono, że w surowicy 30% kobiet z niewyjaśnioną przyczyną niepłodności są obecne ASAs. Natomiast u mężczyzn odestek ten wynosi 10 – 15%. Dla porównania, częstotliwość ASAs w płodnej populacji kobiet i mężczyzn wynosi <2% [1]. Ważną pomocą w procesie wyciszania ekspresji genów są programy wspierające projektowanie siRNA Schemat budowy drugorzędowej shRNA. Źródło - opracowanie własne K. Olszak, na podstawie Ziomek K. Kierzek R. Drugorzędowe motywy strukturalne RNA. Postepy Biochem. 1999, 45, 2: 80-7. licencja CC BY 3.0 Przyczyny powstania ASAs Męskie komórki rozrodcze oddzielone są od układu immunologicznego barierą anatomiczną. Bariera ta nie jest jednakowo szczelna we wszystkich częściach męskiego układu rozrodczego. Jest ona znacznie mniej efektywna w sieci jądra, kanalikach wyprowadzających nasienie oraz w najądrzu. Przełamanie fizjologicznych mechanizmów autotolerancji prowadzi do zainicjowania syntezy ASAs. Ponadto u mężczyzn powstawaniu ASAs sprzyja niedobór czynników immunosupresyjnych, odgrywających rolę w utrzymywaniu aktywnej tolerancji wobec męskich komórek rozrodczych. Innymi czynnikami sprzyjającymi wytwarzaniu ASAs u mężczyzn są: przewlekłe infekcje, żylaki powrózka, wnętrostwo, podwiązanie nasieniowodów. U kobiet procesy zapalne narządów rozrodczych mogą zwiększać ryzyko wystąpienia przeciwciał [2]. Wpływ ASAs na organizm ASAs wywierają wpływ na proces spermatogenezy, transport plemników w drogach rozrodczych, wzmożoną fagocytozę, blokowanie kapacytacji plemników, reakcji akrosomalnej, interakcję plemników z komórką jajową oraz przebieg wczesnych etapów rozwoju zarodkowego [3]. ASAs mogą wiązać się z rożnymi częściami morfologicznymi plemnika i w zależności od tego mieć różne znaczenie kliniczne. Przeciwciała, które opłaszczają główkę plemnika, zwłaszcza w okolicy akrosomu, utrudniają reakcję plemnika z komórka jajową. Mogą one prowadzić do trwałej bezpłodności. Ruch plemnika natomiast mogą zaburzać przeciwciała wiążące się z jego witką. Przeciwciała te mogą występować w niewielkiej ilości również u zdrowych mężczyzn [2]. Materiał do badania SPERMA Materiał powinien być uzyskany drogą masturbacji i dostarczony w przeciągu 1 godziny do laboratorium lub oddany na miejscu. Badanie wykonuje się z ejakulatu pobranego po około czterech dniach od ostatniej ejakulacji. W związku z tym, że jakość nasienia jest parametrem zmiennym, w przypadku nieprawidłowego wyniku, zaleca się przeprowadzenie drugiego badania po okresie 2 – 3 tygodni od pierwszego [3]. Zgodnie z zaleceniami WHO ogólne badanie nasienia czyli seminogram jest podstawowym badaniem w diagnostyce zaburzeń płodności u mężczyzn i powinno być wykonywane równocześnie z testem na obecność przeciwciał przeciwplemnikowych w nasieniu [4]. SUROWICA KRWI Krew jest materiałem, który może być wykorzystany do oceny obecności ASA u obu płci. Krew powinna być oddana pomiędzy 7:00 a 9:00 rano, przed śniadaniem, po 12 godzinach od ostatniego posiłku [5]. ŚLUZ SZYJKI MACICY W połowie cyklu miesięcznego śluz szyjki macicy sprzyja penetracji nasienia dzięki estrogenom. Długość czasu, w którym plemniki mogą przeniknąć do śluzu szyjkowego różni się znacznie u kobiet, a także może się zmieniać u tej samej osoby w różnych cyklach miesięcznych. Badania w śluzie szyjki macicy należy przeprowadzać możliwe jak najbliżej owulacji. Jajeczkowanie określa się na podstawie kryteriów klinicznych (długość cyklu, temperatura ciała, zmiany morfologiczne w śluzie szyjki macicy), badań laboratoryjnych (w surowicy lub moczu ocenia się stężenie hormonu luteinizującego oraz estrogenów) oraz badań obrazowych (np. ultrasonografii jajników) [4]. Testy wykorzystywane do diagnostyki ASAs METODY BEZPOŚREDNIE -DIBT (ang. Direct Immunobead Binding Test) -MART (ang. Mixed Antiglobulin Reaction Test) ASAs wystepują w trzech klasach: A, M oraz G. Największe znaczenie kliniczne mają przeciwciała w klasie A, a najmniejsze w klasie M. Testy oparte na wykorzystaniu żywych plemników należą do najbardziej informatywnych diagnostycznie metod oznaczania ASAs. Wyniki obu testów nie zawsze są jednakowe. DIBT lepiej koreluje z testami pośrednimi wykonywanymi w surowicy krwi. Protokoły przeprowadzenia obu badań są różne jednak zasada metody taka sama. Polega na łączeniu się kul lateksowych z powierzchnią plemników, co obserwuje się pod mikroskopem świetlnym. MART przeprowadza się bezpośrednio na świeżym nasieniu, a DIBT na odpowiednio przygotowanych plemnikach. Jeżeli w nasieniu jest dużo nieruchomych plemników, oba testy nie wykryją ASAs i należy wykorzystać metody pośrednie [4]. W tabeli 1 przedstawiono normy dla testów bezpośrednich. Tabela 1. Normy dla testów bezpośrednich [%] [3] METODY POŚREDNIE -CB-RIA (ang. Radio Immuno Assay) -ELISA (ang. Enzyme-Linkes Immunosorbent Assay) -Testy oparte o aglutynację -IIF (Immunofluorescencja pośrednia) -IDIBT (ang. Indirect Immunobead Test) Testy in vivo -Test postkoitalny (ang. Postcoital test, PCT) Testy in vitro -Test penetracji -Test kapilarny Testy pośrednie polegają na ocenie przeciwciał w surowicy krwi, rozpuszczonym śluzie szyjki macicy, osoczu spermy, płynie jądrowym. Metody immunochemiczne czyli RIA i ELISA wykrywają reakcję antygenu ze swoistym przeciwciałem, znakowanym w RIA izotopem promieniotwórczym, a w ELISA enzymem. Najczęściej stosuje się je do oceny stężenia różnych substancji. W tabeli 2 przedstawiono normy ASAs w teście ELISA. Tabela 2. Normy ASAs w teście ELISA [IU/l] [6] Testy oparte o reakcję aglutynacji ocenia się wizualnie, gdyż w próbce zawierającej ASAs dochodzi do wytrącenia się dużych kompleksów. Test lateksowy aglutynacyjny w kierunku ASAs. Kontrola ujemna i dodatnia. Autor: Natalia Grzegorzak Licencja: CC BY SA 3.0 W teście immunofluorescencji pośredniej za pomocą znakowanych fluoresceiną antyludzkich przeciwciał wykrywa się ludzkie przeciwciała ASAs jakościowo bądź półilościowo, stosując szereg rozcieńczeń materiału badanego. IDIBT przeprowadza się tak samo jak DIBT z tą różnicą, że materiałem badanym nie są plemniki lecz surowica krwi czy osocze nasienia [4,6]. Test IBT zarówno pośredni jak i bezpośredni jest uważany za „złoty standard”, ponieważ pozwala zidentyfikować specyficzne immunoglobuliny związane z powierzchnią plemnika [2]. Test PCT czyli „po stosunku” przeprowadza się w warunkach laboratoryjnych w śluzie pobranym od kobiety od 9 do 14 godzin po stosunku (test in vivo). Ocenia się w obrazie mikroskopowym liczbę plemników obecnych w śluzie szyjki macicy, stopień ich przeżycia i zachowanie plemników kilka godzin po kopulacji. Test ocenia czy śluz szyjki macicy spełnia swoje zadanie jako rezerwuar plemników. Może też być przydatny do oceny istotności dodatnich wyników testów stwierdzających ASAs. O negatywnym wyniku testu mówimy, gdy nie stwierdza się obecności plemników w śluzie szyjki macicy. Obecność jakiegokolwiek progresywnego ruchu plemników w śluzie szyjkowym pozwala wykluczyć czynniki immunologiczne jako przyczynę niepłodności. W przypadku ujemnego wyniku testu, należy go powtórzyć. Natomiast, gdy negatywny wynik się powtórzy warto wykonać test PCT in vitro. Zasada tej metody jest taka sama jak testu in vivo z tą różnicą, że sperma pobrana od mężczyzny zostaje połączona ze śluzem pobranym od kobiety w laboratorium [4]. Test kapilarny mierzy zdolność plemników do przenikania przez kolumnę, w której w rurce kapilarnej umieszczono śluz szyjkowy. Po 2 godzinach od dodania nasienia do rurki ocenia się odległość migracji plemników, gęstość penetracji oraz obecność ruchliwych plemników w poszczególnych strefach. Po odpowiednich obliczeniach wyniki odczytuje się z przedstawionej niżej tabeli 3. Poszczególne strefy, do których docierają plemniki zostały zobrazowane na rycinie 1 [4]. Rycina 1. Schemat rurek wykorzystywanych do testu kapilarnego [4] Tabela 3. Średnia liczba plemników w odpowiedniej strefie w kapilarze [4] Obecność ASAs w surowicy bądź innym materiale badanym wskazuje na niepłodność immunologiczną. Przeciwciała te mogą być dodatkowym czynnikiem związanym z rodzinną niepłodnością. Mogą one mieć znaczenie również u pacjentów, u których nie wykryto przyczyny niepłodności. Dlatego też wszystkie niepłodne pary powinny zostać poddane testom stwierdzającym ASAs. Dostępnych jest wiele metod pozwalających ocenić ASAs jakościowo bądź ilościowo. Często pojedyncze badanie nie wystarcza i trzeba wykonać testy kilkukrotnie. Wykrycie przyczyny niepłodności ma ogromne znaczenie, gdyż pozwala podjąć odpowiednie leczenie zmierzające do przywrócenia prawidłowej koncepcji. Piśmiennictwo: 1.Nagaria T. et al. Evaluation of serum antisperm antibodies in infertility. J Obstet Gynaecol India 2011, 61(3) :307-316. 2.Kamieniczna M. i wsp. Wykorzystanie cytometrii przepływowej do oceny występowania przeciwciał przeciwplemnikowych w surowicy od niepłodnych osób dorosłych i chłopców przed pokwitaniem z wadami w drogach rozrodczych. Ginekol Pol 2010, 81: 588-593. 3.DIAGNOSTYKA laboratoria medyczne broszura informacyjna Przeciwciała przeciwplemnikowe IgG w nasieniu. 4.WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. WHO Press, Geneva, Switzerland, 5th ed. 2010, 108-127. 5.Deschka M. Pobieranie krwi w praktyce. Poradnik dla personelu medycznego. Bezpieczne pobieranie krwi włośniczkowej i żylnej w ambulatorium i szpitalu. str 28-29. 6.Domagala A. et al. Antisperm antibodies in prepubertal boys with cryptorchidism. Arch Androl 2006, 52: 411-416. Płód pacjentem – diagnostyka laboratoryjna wrodzonych wad rozwojowych Ciąża to czas, kiedy kobieta ma szczególne potrzeby dotyczące opieki zdrowotnej i wysokie oczekiwania wobec personelu medycznego. W trakcie tych dziewięciu miesięcy przyszła matka pozostaje pod specjalnym nadzorem medycznym. Ogromne znaczenie ma tutaj diagnostyka laboratoryjna, w tym badania prenatalne. Testy te wykonywane są w celu wykrycia stanów nieprawidłowych u płodu oraz w diagnostyce i monitorowaniu leczenia wykrytych patologii. Umożliwiają podjęcie wczesnego leczenia i działają korzystnie na psychikę przyszłej matki. Ważną pomocą w procesie wyciszania ekspresji genów są programy wspierające projektowanie siRNA Schemat budowy drugorzędowej shRNA. Źródło - opracowanie własne K. Olszak, na podstawie Ziomek K. Kierzek R. Drugorzędowe motywy strukturalne RNA. Postepy Biochem. 1999, 45, 2: 80-7. licencja CC BY 3.0 Codziennie w każdej komórce ma miejsce nawet milion uszkodzeń DNA. Wiele z nich powoduje trwałe zmiany, które mogą upośledzić albo pozbawić komórkę możliwości prawidłowej transkrypcji genu kodowanego przez uszkodzony fragment DNA. Proces naprawy materiału genetycznego w komórce jest cały czas aktywny, aby szybko i skutecznie niwelować skutki każdego uszkodzenia komórkowego DNA. Niestety nie zawsze mechanizmy naprawcze są w stanie usunąć wszystkie nieprawidłowości. Powstają mutacje, które mogą dotyczyć zmiany struktury lub liczby chromosomów, zarówno w komórkach somatycznych jak i rozrodczych. Z tą różnicą, że te drugie są dziedziczne. Wśród aberracji liczbowych wyróżnia się aneuploidie i poliploidie. Większość aberracji chromosomowych jest letalna. Wyjątek stanowią trisomie (2n+1) chromosomów 21, 18 i 13, które są najczęściej występującymi zespołami wad wrodzonych, wywołanymi przez obecność dodatkowej kopii chromosomu. Średnio 1 na 800 dzieci rodzi się z zespołem Downa (trisomia 21), 1 na 6 000 dzieci rodzi się z zespołem Edwardsa (trisomia 18) oraz 1 na 10 000 dzieci rodzi się z zespołem Patau (trisomia 13) [2,3,4]. Diagnostyka prenatalna pozwala rodzicom na przygotowanie się do narodzin dziecka obarczonego wadą genetyczną. Wywiera też pozytywny wpływ na zdrowie psychiczne ciężarnej. W ten sposób zmniejsza się stres związany z obawą o prawidłowy rozwój dziecka. Daje to poczucie bezpieczeństwa. Wykonanie badań prenatalnych służy ocenie stanu zdrowia płodu. Ich przeprowadzenie niesie za sobą wiele korzyści. Pozwala wykluczyć lub wykryć wady u płodu np. nieprawidłową budowę serca oraz różne schorzenia np. hemofilię. Niektóre z występujących u płodu patologii stanowią zagrożenie jego życia postnatalnego, ale dzięki badaniom prenatalnym możliwe jest wczesne rozpoczęcie leczenia, nawet w łonie matki. Daje to dziecku ogromną szansę na osiągnięcie pełnej sprawności [5]. Wskazania do wykonania badań prenatalnych Polskie Towarzystwo Ginekologiczne (PTG) zaleca, aby nieinwazyjne badania prenatalne w kierunku najczęściej spotykanych wad rozwojowych i nieprawidłowości genetycznych były proponowane wszystkim kobietom ciężarnym w Polsce, bez względu na wiek. Natomiast ciężarne, które spełniają wymienione niżej kryteria powinny badania te bezwzględnie wykonać: -Wiek kobiety powyżej 35 lat; -Występowanie w rodzinie chorób genetycznych; -Urodzenie poprzedniego dziecka z wadą genetyczną [6,7]. Ograniczenia testów prenatalnych Wśród ograniczeń testów prenatalnych wymienia się m.in.: -Kobiety ciężarne powyżej 35 roku życia częściej otrzymują nieprawidłowy wynik testu potrójnego; -Kobiety po 42 roku życia nie powinny poddawać się testowi potrójnemu z uwagi na wysokie prawdopodobieństwo uzyskania fałszywego wyniku; -U kobiet młodych (ok. 20-25 lat) wykrywalność chorób genetycznych za pomocą testu potrójnego jest niska stanowiąc około 50%. Dla testu podwójnego wykrywalność schorzeń u tej grupy pacjentek wynosi około 80%; -U ciężarnych, które zaszły w ciążę dzięki procedurom rozrodu wspomaganego, istnieje wyższe prawdopodobieństwo wyniku fałszywie dodatniego badania biochemicznego; -U ciężarnych z ciążą bliźniaczą czułość badań biochemicznych jest niższa niż w przypadku ciąży pojedynczej [7]. BADANIA PRENATALNE NIEINWAZYJNE Wykazano, że ocena stężenia w surowicy krwi parametrów biochemicznych, takich jak wolna podjednostka ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (fβhCG) w połączeniu ze związanym z ciążą białkiem osoczowym A (PAPP-A) równocześnie z ultrasonograficznym potwierdzeniem przezierności karku (NT) jest wiarygodnym markerem aneuploidii płodowej. Ponadto biorąc pod uwagę wiek matki, ryzyko wystąpienia wad płodu może być wyliczone za pomocą specjalnego algorytmu, opartego na współczynniku prawdopodobieństwa. To badanie zostało określone mianem testu podwójnego, który wykonuje się dokładnie między 11 a 13 tygodniem ciąży. Najczęściej test służy ocenie ryzyka wystąpienia zespołów Downa, Edwardsa i Patou, a rzadziej również rozszczepu kręgosłupa, bezmózgowia i innych wad cewy mózgowej. W drugim trymestrze ciąży, dokładnie między 15 a 18 tygodniem, wykonuje się test potrójny. W teście ocenia się stężenie αfetoproteiny (AFP), wolnego estriolu (uE3) oraz wolnej lub całkowitej βhCG. Wykonuje się go, aby ocenić ryzyko wystąpienia u płodu zespołu Downa i Edwardsa oraz wad cewy nerwowej. Może też być pomocny w wykryciu rozszczepu kręgosłupa, bezmózgowiu czy niedrożności przełyku. Czułość i specyficzność tego testu jest niższa niż testu podwójnego. Dlatego też warto go wykonać u grupy kobiet, które z różnych przyczyn nie miały wykonanego testu podwójnego [8,9]. Więcej informacji na temat obu testów znajduje się w artykule: Test PAPP-A i test potrójny w nieinwazyjnej diagnostyce prenatalnej. Wartości prawidłowe wybranych parametrów biochemicznych w próbkach surowicy ciężarnych Każde laboratorium ustala własne zakresy referencyjne w oparciu o reprezentatywne grupy pacjentów i/lub przeprowadzenie walidacji podanych przez wytwórcę danych komercyjnego zestawu diagnostycznego. Przedstawione poniżej wartości są podane wyłącznie jako przykład i mogą się różnić w zależności od rodzaju metody oznaczeń oraz wykorzystanej aparatury. Indywidualne ryzyko wystąpienia nieprawidłowości chromosomalnych jest obliczane przy uwzględnieniu wszystkich parametrów, za pomocą odpowiedniego oprogramowania np. CISline Prenat’ScreenTM, B·R·A·H·M·S Fast Screen pre I plus, Prisca 4. Badania przeprowadzone na 250 osobach o przypuszczalnie dobrym stanie zdrowia wykazały, że w 97,5 % próbek stężenie AFP znajdowało się poniżej 13,11 ng/mL (mediana 3,21 ng/ml). W tabeli 1 przedstawiono wartości prawidłowe AFP [ng/ml] w surowicy krwi w drugim trymestrze ciąży. Tabela 1. Stężenie AFP [ng/ml] w surowicy kobiet ciężarnych [10] Badanie 100 uznanych za zdrowych mężczyzn i kobiet nieciężarnych wykazało, że 95 % próbek dało wynik PAPP-A poniżej 0,014 IU/l. Wartość średnia PAPP-A wyniosła 0,01 IU/l. W tabeli 2 przedstawiono stężenie PAPP-A u zdrowych ciężarnych w pierwszym trymestrze ciąży. Tabela 2. Stężenie PAPP-A [IU/l] u zdrowych kobiet w ciąży [10] Poniżej przedstawiono normy stężenia HCG+β u ciężarnych w pierwszym i drugim trymestrze ciąży. Tabela 3 Prawidłowe wartości stężenia HCG+β w surowicy krwi ciężarnych [10] BADANIA PRENATALNE INWAZYJNE Inwazyjna diagnostyka prenatalna obejmuje badania, do których w sposób inwazyjny pobierane są komórki płodu. Oznacza to naruszenie ciągłości tkanek matki i płodu. Ten typ badań umożliwia bezpośrednie wykrycie zaburzeń chromosomalnych u płodu. Charakteryzuje się najwyższą czułością diagnostyczną, ale też stwarza największe ryzyko powikłań, takich jak: wywołanie nadmiernej czynności skurczowej macicy, pęknięcie błon płodowych z odpłynięciem płynu owodniowego, przedwczesne oddzielenie się łożyska lub fragmentu kosmówki, zainfekowanie środowiska jaja płodowego, tamponada pępowiny, okresowa bradykardia lub tachykardia płodu, przedwczesny poród. Do badań prenatalnych inwazyjnych należą: -Amniopunkcja -Biopsja trofoblastu -Kordocenteza -Fetoskopia -Biopsja tkanek płodu Amniopunkcja Badanie to wykonuje się między 13 a 19 tygodniem ciąży. Ustala się położenie dziecka przy pomocy ultrasonografu, a następnie nakłuwa pęcherz płodowy i pobiera płyn owodniowy. Są w nim obecne komórki płodu pochodzące z owodni, skóry, układu moczowo-płciowego oraz pokarmowego. Następnie zakłada się ich hodowlę in vitro i po namnożeniu komórek wykonuje się badanie kariotypu. Amniopunkcja jest obarczona najmniejszym odsetkiem powikłań spośród badań inwazyjnych i ryzyko utraty ciąży wskutek amniopunkcji wynosi ok. 0,5-1%. Na wynik badania cytogenetycznego z amniopunkcji czeka się około miesiąca [11]. Niżej przedstawiono mediany AFP w płynie owodniowym ciężarnych. Tabela 4.Wartości prawidłowe AFP w płynie owodniowym u kobiet w ciąży [10] Biopsja trofoblastu Przeprowadza się ją między 11 a 14 tygodniem ciąży. Biopsja trofoblastu polega na pobraniu fragmentu kosmówki pod kontrolą USG. Możliwe jest pobieranie kosmówki drogą przez brzuszną lub przez pochwową. Ryzyko utraty ciąży jest według najnowszych danych porównywalne z ryzykiem amniopunkcji. Kosmówka jest dobrym źródłem DNA pochodzenia płodowego do badań molekularnych. Wczesne wykonanie zabiegu daje więcej czasu na przeprowadzenie niekiedy trwających wiele tygodni analiz molekularnych. Wyniki otrzymuje się po kilku dniach. Kordocenteza Badanie można wykonać od około 18 tygodnia ciąży. Polega na pobraniu krwi z żyły pępowinowej po nakłuciu pępowiny przez powłoki brzuszne pod kontrolą USG. Leukocyty płodu są poddane badaniu cytogenetycznemu. Ponadto we krwi płodu można wykonać morfologię, ocenę równowagi kwasowo-zasadowej lub diagnostykę wrodzonych infekcji. Fetoskopia Fetoskopię można zrobić zwykle pomiędzy 18 a 20 tygodniem ciąży. Polega ono na wziernikowaniu macicy specjalnym systemem optycznym wprowadzanym przez powłoki brzuszne po uprzednim niewielkim nacięciu skóry. Badanie umożliwia oglądanie płodu a nawet wykonywanie niektórych zabiegów. Biopsja tkanek płodu Badanie polega na pobraniu wycinka tkanki płodu najczęściej skóry, mięśni lub wątroby. NOWOŚCI ZE ŚWIATA NAUKI Nowe testy laboratoryjne mogą podnieść efektywność prenatalnego skryningu. Badaniem, które w przyszłości może znaleźć zastosowanie w diagnostyce prenatalnej, jest nieinwazyjna ocena krwi matki pod kątem zaburzeń chromosomalnych płodu. Obecnie uważa się, iż około 1 na 103-107 komórek jądrzastych we krwi ciężarnej jest pochodzenia płodowego. Dzięki wykorzystaniu sond specyficznych dla konkretnych chromosomów i techniki FISH (ang. fluorescent in situ hybrydisation), można podejrzewać trisomię u płodu. Badanie komórek płodowych wyizolowanych z krwi obwodowej ciężarnej może znaleźć zastosowanie raczej jako metoda oceny ryzyka niż inwazyjnej diagnostyki prenatalnej zaburzeń chromosomalnych [12,13]. Więcej informacji na temat tego badania znajduje się w artykule: Diagnostyka prenatalna płodowego DNA z krwi matki – lepsza niż metody tradycyjne? Podejmowane są też próby wprowadzenia do diagnostyki przesiewowej nowych wskaźników biochemicznych np. inhibiny A czy białka wiążącego insulinopodobne czynniki wzrostu ADAM 12S. Oba parametry wykazują różnicę w stężeniu u kobiet z zespołem Downa u płodu w porównaniu z grupą kontrolną. Inhibina A w drugim trymestrze ciąży jest wyraźnie wyższa w ciąży obarczonej zespołem Downa, a ADAM 12S niższe w pierwszym trymestrze. Do tej pory jednak nie potwierdzono ich przydatności w rutynowej diagnostyce [14,15]. Należy zwrócić uwagę, że wyniki badań prenatalnych nieinwazyjnych mogą być pomocne w diagnostyce różnych schorzeń, ale nie dają stuprocentowej pewności, co do wykrytej patologii. Dodatnie wyniki testów są wskazaniem do wykonania inwazyjnej diagnostyki prenatalnej, która niesie ryzyko powikłań zarówno dla matki jak i płodu. Procedury inwazyjne mogą być wykonywane tylko przez odpowiednio wyszkolonych i doświadczonych lekarzy. Konieczne jest wykorzystywanie odpowiedniego certyfikowanego sprzętu laboratoryjnego, aparatów USG oraz prowadzenie cyklicznych szkoleń dla personelu medycznego. Wyniki wszystkich testów powinny podlegać corocznemu audytowi. Wszystkie ciężarne, bez względu na wiek, powinny być objęte programem diagnostyki prenatalnej w kierunku wad rozwojowych i aberracji chromosomowych. Narodowy Fundusz Zdrowia refunduje badania prenatalne tylko u kobiet powyżej 35. roku życia. Tymczasem większość kobiet ciężarnych, które rodzą około 80% wszystkich dzieci z zespołem Downa, to pacjentki młodsze [16,17]. Piśmiennictwo: 1. Chazan B. i wsp. Opieka laboratoryjna nad przyszłą mamą. Diagnosta Lab, 2013; 1(30): 7-12. 2. Vink J. et al. Prenatal NAP+SAL prevents developmental delay in a mouse model of Down syndrome through effects on N-methyl-D-aspartic acid and gamma-aminobutyric acid receptors. Am J Obstet Gynecol, 2009;200(5),524: e1-4. 3. Cadle RG. et al. The prevalence of genetic disorders, birth defects and syndromes in central and eastern Kentucky. J Ky Med Assoc, 1996; 94(6): 237-241. 4. Vendola C. et al. Survival of Texas infants born with trisomies 21, 18, and 13. Am J Med Genet A, 2010;152A(2): 360-366. Harefuah, 2015;154(10):653-656, 675, 674. 5. Wieacker P. et al. The Prenatal Diagnosis of Genetic Diseases. Dtsch Arztebl Int: 2010; 107(48): 857-862. 6. Canick JA. First and Second Trimester Evaluation of Risk (FASTER) Trial Research Consortium. Obstet Gynecol, 2006; 108(5):1192-1199. 7. Nicolaides KH. Screening for fetal aneuploidies at 11 to 13 weeks. Prenat Diagn, 2011; 31: 7-15. 8. Malone FD. et al. First- and Second-Trimester Evaluation of Risk (FASTER) Research Consortium. First-trimester or second-trimester screening, or both, for Down’s syndrome. N Engl J Med, 2005;10; 353(19): 2001-11. 9. Narasimhan K. et al. Maternal serum protein profile and immune response protein subunits as markers for non-invasive prenatal diagnosis of trisomy 21, 18, and 13. Prenat Diagn, 2013;33(3):223-231. 10. Dane przedstawione przez firmę Thermo Scientific w broszurach załączonych do zestawów odczynnikowych BRAHMS Kryptor. 11. Ławicki S. i wsp. Laboratoryjna diagnostyka prenatalna. Diagnosta Lab, 2013; 1(30): 7-12. 12. Vrachnis N. et al. DNA sequencing versus standard prenatal aneuploidy screening. N Engl J Med, 2014; 371(6):578. 13. Gekas J. et al. Non-invasiveprenatal testing for fetal chromosome abnormalities: review of clinical and ethical issues. Appl Clin Genet 2016, 9: 15-26. 14. Huttly W. et al. Effect of smoking status on inhibin-A in second-trimester prenatal screening for Down syndrome. Prenat Diagn, 2014; 34(4):406-407. 15. Wortelboer EJ. et al. ADAM12s as a first-trimester screening marker of trisomy. Prenat Diagn, 2009; 29(9): 866-869. 16. Opszała A. i wsp. Markery biochemiczne we krwi matki i ich rola w nieinwazyjnej diagnostyce. Bad Diagn, 2012; 18(3) 17-22. 17. Borowski D. i wsp. Rekomendacje Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego dotyczące postępowania w zakresie diagnostyki prenatalnej. Ginekol Pol, 2009: 51: 200-206. Wirus HIV nadal groźnym problemem epidemiologicznym Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) jest nadal jednym z głównych globalnych czynników chorobotwórczych. Stosowanie terapii antyretrowirusowej oraz wczesnej diagnostyki zmieniło epidemiologię, powodując przedłużenie życia osób już zakażonych. Rozwój badań pozwalających na zrozumienie patomechanizmów zakażenia wirusem oraz odpowiedzi immunologicznej może w przyszłości przyczynić się do całkowitego wyleczenia chorych. Prowadzone są prace mające na celu opracowanie skutecznej i bezpiecznej terapii antywirusowej oraz wynalezienie leków stosowanych w profilaktyce. Epidemiologia Liczba osób zakażonych wirusem HIV na świecie stale rośnie i w 2014 roku osiągnęła wartość 36,9 miliona. Stosowanie wczesnej diagnostyki i wprowadzenie projektów zapobiegających przenoszeniu wirusa wpłynęło na ograniczenie ilości nowych zakażeń. Wirus HIV jest główną przyczyną zachorowalności u osób w wieku 30-44 lat oraz piątą główną przyczyną chorób w innych grupach wiekowych. Stosowanie leków antyretrowirusowych spowodowało spadek umieralności u chorych na AIDS [1]. W regionie europejskim WHO wirus HIV pozostaje jednym z najważniejszych problemów dla zdrowia publicznego bez wyraźnych oznak ogólnego spadku zakażeń. W tym obszarze w 2013 roku odnotowano 29 157 nowych zakażeń. Najwięcej zakażeń miało miejsce w Estonii, natomiast nieco mniej na Łotwie, w Belgii i w Portugalii. W Europie najwięcej nowych zakażeń odnotowuje się w populacji mężczyzn mających kontakty seksualne z mężczyznami, natomiast w Polsce wśród osób heteroseksualnych [2]. Schemat budowy wirusa HIV. Źródło Wikimedia. Autor: Carl Henderson. Licencja: PD-USGov-HHS-NIH. Patogeneza Głównym celem ataku wirusa HIV są aktywowane limfocyty T pomocnicze. Wirus wnika do ich wnętrza przyłączając się do antygenu CD4 oraz do receptorów dla chemokin CCRS lub CXCR4. HIV atakuje również inne typy komórek mające na swojej powierzchni antygen CD4, takie jak spoczynkowe limfocyty T pomocnicze, monocyty, makrofagi i komórki dendrytyczne. Wirus może wniknąć także do astrocytów i komórek nabłonkowych nerek, powodując zaburzenia neuropoznawcze i nefropatie. Przedostaje się on przez błony śluzowe, namnaża się w komórkach odpornościowych i powoduje bardzo silną odpowiedź immunologiczną. Wkrótce po zakażeniu HIV specyficzne limfocyty T CD8+ zabijają komórki zainfekowane za pośrednictwem limfocytów T pomocniczych CD4+. Silna odpowiedź immunologiczna z czasem powoduje wyczerpanie się i utratę funkcji zarówno HIV-specyficznych limfocytów T jak i całej populacji limfocytów T [1]. Wirus charakteryzuje się dużą zmiennością genetyczną, co wiąże się z ograniczeniem efektu antywirusowego wywieranego przez komórki NK (natural killer) oraz możliwością ucieczki HIV spod kontroli immunologicznej. Przeciwciała neutralizujące pojawiają się w czasie 3 miesięcy po wniknięciu wirusa. Ze względu na dużą zmienność genetyczną oraz maskowanie wrażliwych powierzchni wirusa, przeciwciała są wytwarzane latami i nie przynoszą dużej korzyści [3]. Cechą charakterystyczną zakażenia HIV jest stopniowe zmniejszenie się liczby limfocytów T CD4+ ze względu na obniżone wytwarzanie i zwiększone niszczenie spowodowane aktywacją układu immunologicznego. W początkowej fazie zakażenia znacznie obniża się liczba limfocytów T CD4+, szczególnie w obrębie układu pokarmowego, co powoduje naruszenie bariery ochronnej i podatność na choroby. Ważną pomocą w procesie wyciszania ekspresji genów są programy wspierające projektowanie siRNA Schemat budowy drugorzędowej shRNA. Źródło - opracowanie własne K. Olszak, na podstawie Ziomek K. Kierzek R. Drugorzędowe motywy strukturalne RNA. Postepy Biochem. 1999, 45, 2: 80-7. licencja CC BY 3.0 Diagnostyka laboratoryjna Badania przesiewowe zakażenia HIV opierają się na wykryciu przeciwciał w testach immunoenzymatycznych EIA. Obowiązuje zasada dwustopniowej diagnostyki: dwa dodatnie testy wykonane z dwóch próbek krwi EIA potwierdza się testem Western Blot. Innym badaniem potwierdzającym zakażenie jest test immunoenzymatyczny wykrywający obecność antygenu wirusa p24. Wykorzystanie badań metodami biologii molekularnej pozwoliło na skrócenie okienka serologicznego do 7 dni. Badając obecność RNA wirusa metodą PCR można wykryć zakażenie już po 7 dniach po ekspozycji, a także monitorować leczenie w badaniu Real Time PCR. Liczba limfocytów T pomocniczych CD 4+ jest jednym z najważniejszych parametrów stosowanych w monitorowaniu zakażenia HIV. Liczba komórek CD4+ gwałtownie spada w ostrym zakażeniu, oraz koreluje wraz z progresją choroby. W badaniu cytometrią przepływową można określić stosunek limfocytów CD4+ do CD8+, który jest istotny podczas terapii antyretrowirusowej [4]. Leczenie antyretrowirusowe W leczeniu antyretrowirusowym stosuje się coraz więcej grup leków wykorzystujących różne mechanizmy działania pozwalające na zahamowanie replikacji wirusa i zahamowanie postępu choroby. Leczenie antyretrowirusowe nie zapewnia jednak całkowitego wyleczenia i powoduje wystąpienie wielu powikłań, takich jak zaburzenia ze strony układu pokarmowego, lipodystrofię, cukrzycę, choroby układu krążenia. Grupy i działanie leków stosowanych w terapii antyretrowirusowej: – nukleozydowe i nienukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy: uniemożliwiają przepisanie materiału genetycznego z RNA wirusa na DNA – inhibitory proteazy: zapobiegają kształtowaniu się białek wirusa w zakażonej komórce – inhibitory fuzji: zapobiegają przyłączeniu się wirusa do komórki – antagoniści koreceptora CCR5: blokują receptor CCR5 utrudniając wniknięcie wirusa – inhibitory integrazy: zabezpieczają przed wniknięciem materiału genetycznego HIV do jądra zakażonej komórki [4]. Terapia genowa Stosując terapię antyretrowirusową można znacznie zmniejszyć miano wirusa w osoczu. Jest ona jednak kosztowna i nie prowadzi do całkowitego wyleczenia. Terapia genowa stanowi alternatywę leczenia antyretrowirusowego, ponieważ może spowodować opanowanie zakażenia już po jednym zabiegu. Terapia genowa polega na pobraniu krwiotwórczych komórek macierzystych od pacjenta, wprowadzeniu genu terapeutycznego i po leczeniu ablacyjnym przeszczepienie komórek z transdukowanym genem. Wprowadzane geny są tak zaprojektowane, aby ich produkt kolidował z kluczowymi etapami replikacji wirusa: poprzez bezpośredni wpływ na wiriony lub poprzez wpływ na ludzkie czynniki komórkowe niezbędne do cyklu życiowego HIV. Po pilotażowych badaniach klinicznych nadal prowadzone są prace nad poprawą skuteczności wprowadzania genu oraz nad osiągnięciem długoterminowego efektu terapeutycznego [5]. Szczepionka przeciw HIV Pierwsza szczepionka przeciw HIV została opracowana z ponad 20 rekombinowanych białek otoczki wirusa, pochodzących z różnych szczepów. Okazała się ona jednak nieskuteczna. Wiązało się to z dużą autoreaktywnością i usuwaniem limfocytów B, które miały wytwarzać szerokie spektrum przeciwciał neutralizujących. Przyczyną niewielkiej skuteczności opracowywanych szczepionek jest duża zmienność wirusa oraz jego trimeryczna struktura powodująca maskowanie epitopów HIV. W latach 2004-2009 pracowano szczepionkę ALVAC HIV charakteryzującą się stosunkowo najwyższą skutecznością. Badania prowadzone w Tajlandii potwierdziły, że szczepionka w 31,2 % zmniejsza ryzyko zakażenia HIV obserwowane przez 3,5 roku [6]. Najnowsze badania Kierunek najnowszych badań nad HIV/AIDS to przede wszystkim nowe terapie antywirusowe. 1. Prowadzone są badania nad wynalezieniem nowych leków antyretrowirusowych o większej skuteczności i mniejszych działaniach ubocznych. Jednym z nich jest deferypron, lek chelatujący żelazo, do tej pory stosowany w talasemii. Deferypron indukuje apoptozę limfocytów T zakażonych HIV nie wpływając na komórki niezakażone. Stosowanie deferypronu przez 7 dni powoduje znaczny spadek wiremii utrzymującej się przez 8 tygodni po odstawieniu leku. Dużą zaletą specyfiku jest także brak lekooporności wirusa [7]. 2.Trwają prace nad zwiększeniem komórkowej odpowiedzi immunologicznej poprzez zmiany w strukturze receptorów TCR limfocytów T. Metoda polega na elektroporacji do limfocytów mRNA kodującego receptory TCR rozpoznające swoiście białka otoczki wirusa. Badania wykazały, że metoda ta powoduje znaczne obniżenie wiremii. Prace nad wynalezieniem skutecznej szczepionki mają na celu opracowanie immunogenów wywołujących silniejszą odpowiedź limfocytów B i T w stosunku do białek otoczki wirusa. 3.Trwają badania kliniczne prowadzone wśród ludności południowej Afryki nad nową postacią szczepionki ALVAC/gp120, której skuteczność zostanie określona pod koniec 2016 r. Prowadzone są także prace nad wynalezieniem szczepionki terapeutycznej dla osób już zakażonych HIV. Włoskie Narodowe Centrum AIDS jest w trakcie opracowywania przeciwciał, których celem jest białko Tat, kluczowe w ekspresji genów oraz replikacji wirusa. Druga faza badania potwierdziła obniżenie wiremii oraz wzrost liczby komórek CD4+, CD8+ oraz NK w ciągu 5 lat. Aktualnie badania nad szczepionką Tat wejdą w trzecią fazę z zastosowaniem placebo i podwójnej ślepej próby [6]. Wirus HIV stanowi nadal zagrożenie dla milionów ludzi na świecie. Pomimo wielu opracowań dotyczących patogenezy wirusa oraz złożonych reakcji immunologicznych w przebiegu choroby, nie udało się opracować skutecznego leczenia antyretrowirusowego. Aktualnie trwają prace nad wynalezieniem bezpiecznej terapii genowej oraz szczepionki mogącej zapobiec nowym zakażeniom. Pismiennictwo: 1. Maartens G, Celum C. Lewin SR. HIV infection: epidemiology, pathogenesis, treatment and prevention. Lancet 2014; 19;384: 258-71 2. Sytuacja epidemiologiczna w HIV/ AIDS w Europie – 2013. Na podstawie raportu HIV/AIDS surveillance in Europe 2013. ECDC, WHO 2014. Europejskie Centrum ds. Zapobiegania i Kontroli Chorób (ECDC), Sztokholm. http://www.aids.gov.pl/wspolpraca_miedzynarodowa/720/ 3. Smith SA, Derdeyn CA. Harnessing the protective potential of HIV-1 neutralizing antibodies. F1000Res 2016; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4754033/ 4. Bąkowska E, Rogowska-Szadkowska D. Leczenie antyretrowirusowe (ARV). Warszawa 2008; Krajowe Centrum ds. AIDS 5. Herrera-Carrillo E, Berkhout B. Bone marrow gene therapy for HIV/AIDS. Viruses 2015; 7(7): 3910-3936. 6. Gray G, Laher F, Lazarus E, at al. Approaches to preventative and therapeutic HIV vaccines. Curr Opin Virol 2016; 17: 104-109. 7. Saxena D, Spino M, Tricta F, at al. Drug-based lead discovery: the novel ablative antiretroviral profile of deferiprone in HIV-1-infected cells and in HIVinfected treatment-naive subjects of a double-blind, placebo-controlled, randomized exploratory trial. PLoS One. 2016; 11(5) W zasadzie to jestem na czczo – czyli o wpływie używek na zmiany metaboliczne Niektóre czynności traktowane są przez nas jako nieodzowna część naszego życia. Często nie wyobrażamy sobie ich zaniechania. Czasami jednak należy się zatrzymać i zastanowić czy w pewnych sytuacjach nie byłoby lepiej choć chwilę powstrzymać się od nich. Wiadomo, że rutynowe stosowanie używek ingeruje w metabolizm organizmu. Wpływ dotyczy także działania krótkoterminowego. Dobrym przykładem jest tutaj kawa. Wiele osób codziennie rano mechanicznie ją przygotowuje, ale.. gdy idziemy do laboratorium na badania nie powinniśmy pić kawy. Często słyszy się w odpowiedzi na pytanie „Czy jest Pan/i na czczo”- „Tak, wypiłem/am tylko kawę”. W takiej sytuacji pacjent już nie jest na czczo. Aby zachować taki stan dopuszczalne jest jedynie wypicie wody. W czym tkwi szkopuł? Jednym ze składników kawy jest kofeina i to właśnie ona może wywoływać zmiany niektórych parametrów. Kofeina powoduje wzrost GFR, spadek wchłaniania zwrotnego elektrolitów w kanalikach nerkowych, inhibicję fosfodwuesteraz (odpowiadają one za degradację cAMP, który z kolei inicjuje glikogenolizę, podnosząc poziom glukozy we krwi), wzrost aktywności reninowej osocza i stężenia katecholamin (po 3 godzinach od spożycia 250 mg kofeiny). W związku z działaniem kofeiny na poziom cAMP należy wspomnieć o wpływie tego związku przykładowo na działanie wielu hormonów (stymulacja glukoneogenezy przez adrenalinę) czy na przemianę lipidów (aktywacja lipazy powoduje nawet 3-krotny wzrost poziomu wolnych kwasów tłuszczowych). Wzrost stężenia wolnych kwasów tłuszczowych sprawia, że oznaczanie hormonów i leków wiążących się z albuminą jest utrudnione (efekt wypierania) [1, 2, 3]. Okazuje się jednak, że za większość znamiennych zmian w lipidogramie nie jest odpowiedzialna kofeina. Naukowcy wyizolowali z kawy dwa związki – cafestol i kahweol, odpowiedzialne za wyższe stężenie cholesterolu całkowitego i LDL w surowicy osób pijących kawę [4]. Ze względu na złożoność zawartości kawy, jej spożycie często prowadzi do wystąpienia reakcji o przeciwstawnym wpływie na metabolizm. Z jednej strony powoduje wzrost poziomu frakcji lipoproteinowych w wyniku zwiększonego uwalniania wolnych kwasów tłuszczowych, zwiększoną retencję cholesterolu w organizmie, a z drugiej strony wykazuje silne działanie antyoksydacyjne. Ważną pomocą w procesie wyciszania ekspresji genów są programy wspierające projektowanie siRNA Schemat budowy drugorzędowej shRNA. Źródło - opracowanie własne K. Olszak, na podstawie Ziomek K. Kierzek R. Drugorzędowe motywy strukturalne RNA. Postepy Biochem. 1999, 45, 2: 80-7. licencja CC BY 3.0 Jeden czy dwa papierosy nie powinny nic zmienić.. w końcu palę codziennie.. ale.. Palenie wywiera wpływ na niektóre parametry. W ciągu godziny od wypalenia od 1 do 5 papierosów obserwuje się wzrost stężenia kwasów tłuszczowych, adrenaliny, wolnego glicerolu, aldosteronu i kortyzolu. Długotrwale palenie wpływa także na różne parametry, obniżając poziom konwertazy angiotensyny, prolaktyny, beta-karotenoidów, selenu i HDL, oraz podwyższając poziom LDL, hematokrytu, MCV, fibrynogenu, miedzi, liczbę erytrocytów i białych krwinek (monocyty, limfocyty, neutrofile), ołowiu, kadmu i CEA (nawet dwukrotnie wyższe niż u osób niepalących). Mechanizm zmian nie został dokładnie wyjaśniony, aczkolwiek upatruje się wytłumaczenia w bezpośrednim lub pośrednim wpływie na różne parametry, pochodnych pirydyny, cyjanowodoru i tiocyjanu, obecnych w dymie papierosowym. Przykładowo, poziom karboksyhemoglobiny u osób palących dużo jest znacznie wyższy od osób niepalących lub palących niewiele [3, 5]. Wypiłem kilka drinków.. Wpływ alkoholu na poziom niektórych parametrów zależy w dużej merze od ilości i czasu trwania spożycia. Metabolizm etanolu związany jest z powstaniem aldehydu octowego, a następnie octanu. Dochodzi do nasilenia powstawania kwasu moczowego. Octan i mleczany obniżają stężenie wodorowęglanów we krwi. Powstaje kwasica metaboliczna. Wysoki poziom mleczanów wpływa redukcyjnie na wydzielanie kwasu moczowego w nerkach, a tym samym podnosi poziom kwasu moczowego w surowicy. Przewlekłe spożycie etanolu skutkuje przede wszystkim wzrostem enzymów wątrobowych. Podnosi się stężenie gamma-glutamylotransferazy, dehydrogenazy mleczanowej, aminotransferazy alaninowej i asparaginianowej. Wynika to głównie z hepatotoksycznego działania etanolu. W rezultacie zahamowania enzymatycznej glikozylacji podczas potranslacyjnej modyfikacji białek w wątrobie może dojść do wzrostu transferryny ubogiej w węglowodany. W przypadku alkoholików obserwuje się upośledzoną degradację trójglicerydów, a tym samym wzrost ich poziomu we krwi. Wśród efektów ostrych spożycia alkoholu wymienia się obniżenie poziomu osteokalcyny, prolaktyny, kortyzolu, cholesterolu oraz podwyższenie poziomu trój glicerydów i aldosteronu. Jako skutki przewlekłe spożycia alkoholu traktuje się spadek LDL i kwasu wanilinomigdałowego oraz wzrost MCV, cholesterolu, trójglicerydów, kortyzolu, aminotransferazy alaninowej i asparaginianowej, estradiolu, adrenaliny, noradrenaliny i gammaglutamylotransferazy [3]. Powszechnie wiadomo, że dieta i głodzenie się wpływa na wyniki badań laboratoryjnych. Należy jednak pamiętać, że palenie papierosów, spożycie kawy i alkoholu nie pozostaje obojętne wobec parametrów biochemicznych organizmu. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Korygowanie liczby retikulocytów Retikulocyty to młode krwinki czerwone, będące formą pośrednią w szlaku erytropoezy. Powstają one w szpiku kostnym z poprzedzających je w szlaku erytropoezy, erytroblastów ortochromatycznych i w ciągu około 4 dni dojrzewają do erytrocytów (70 godzin w szpiku, 45 godzin we krwi). Fizjologicznie retikulocyty przedostają się jako kilkudniowe komórki do krwi obwodowej, gdzie w ciągu doby osiągają dojrzałość. W niektórych przypadkach do krwi obwodowej uwalniane są młodsze retikulocyty. Pobudzenie aktywności erytropoetycznej szpiku powoduje wzrost liczby retikulocytów, natomiast aplazja szpiku lub wybiórcza aplazja układu erytroblastycznego może prowadzić do braku retikulocytów we krwi. Określenie poziomu retikulocytów odgrywa istotna rolę w rozpoznawaniu patogenezy niedokrwistości. Obecnie wykorzystuje się dwa sposoby oznaczania liczby retikulocytów we krwi: metodę manualną oraz oznaczenie przy pomocy analizatorów hematologicznych. Metoda manualna opiera się na wykorzystaniu zdolności do reagowania pozostałości rybosomów i kwasów nukleinowych, obecnych w retikulocytach, z niektórymi barwnikami. Najczęściej wykorzystywany do tego celu jest błękit brylantowo–krezylowy. Przy wykonywaniu badania należy jednak pamiętać, że użyta objętość roztworu barwnika zależy od liczby krwinek czerwonych i powinna być większa w próbkach z wysoką liczbą erytrocytów oraz mniejsza dla niskiej liczby erytrocytów. Po odpowiednim przygotowaniu rozmazu, należy określić liczbę retikulocytów na 1000 krwinek czerwonych (obiektyw immersyjny). Retikulocyty wyróżniają się w wykonanym rozmazie granatowym kolorem ziarnistego i siateczkowatego materiału szukanych komórek. Dojrzałe krwinki czerwone barwią się na kolor niebieskawy. Przy wykorzystaniu analizatorów hematologicznych możliwe jest oznaczenie frakcji retikulocytów w zależności od zawartości RNA. Najstarszą frakcją jest LFR (ang. low fluorescence fraction), najmłodszą HFR ((ang. heavy fluorescence fraction), frakcję pośrednią stanowi MFR (ang. middle fluorescence fraction). Sposób podawania ilości zliczonych retikulocytów zależy w głównej mierze od laboratorium. Najczęściej podaje się wynik w promilach (‰), ale ze względu na konieczność interpretowania wyniku z wartością hematokrytu oraz innymi parametrami morfologii krwi obwodowej, logicznym wydaje się zastosowanie bezwzględnej liczby retikulocytów: Bezwzględna liczba retikulocytów/μl = (retikulocyty (‰) x liczba erytrocytów/μl) / 1000 W przypadku niedokrwistości można zastosować skorygowaną względną liczbę retikulocytów (SWLR) wyliczaną ze wzoru: SWLR = retikulocyty [‰] x hematokryt [%] / hematokryt wzorcowy* [%] (*hematokryt wzorcowy wynosi 42% dla kobiet i 45% dla mężczyzn) Kolejną przyczyną konieczności korygowania retikulocytozy jest istnienie czterech grup retikulocytów (według Heilmeyera i Westhausera, 1932). Komórki grupy IV najszybciej przekształcają się w erytrocyty. Obecność we krwi większej ilości komórek I i II grupy, zwiększa zmierzoną retikulocytozę. Uwzględnienie stopnia dojrzałości retikulocytów jest możliwe przy zastosowaniu wartości hematokrytu. Wg normy CLSI H44-A2 wartość korekcyjna (WK) wynosi przy hematokrycie: HCT 40-50% WK = 1,0 HCT 30-40% WK = 1,5 HCT 20-30% WK = 2,0 HCT 10-20% WK = 3,0 Zgodnie z powyższym, aby obliczyć podwójnie skorygowaną względną liczbę retikulocytów (PSWLR) stosujemy wzór PSWLR = SWLR / WK Przykładowo uzyskaliśmy wynik retikulocytozy 30‰ u dwóch różnych mężczyzn. Pacjent 1 (1) miał wartość hematokrytu 25%, pacjent 2 (2) wartość hematokrytu 10%. Po skorygowaniu liczby retikulocytów otrzymaliśmy następujące wyniki: SLWR1 = 30 x 25/45 = 16,7 ‰ SLWR2 = 30 x 10/45 = 6,7 ‰ Po kolejnym skorygowaniu przy użyciu współczynnika korekcyjnego wartości zmieniają się następująco: PSWLR1 = 16,7/2 = 8,4‰ PSWLR2 = 6,7/3 = 2,2‰ Istnieje jeszcze jedna przydatna wartość wyliczona określająca relację obserwowanej w badaniu produkcji retikulocytów do produkcji prawidłowej — RPI (eng. reticulocyte production index). Jest ona równa wartości PSWLR wyrażonej w %. Prawidłowa produkcję retikulocytów stwierdzamy w przypadku, gdy RPI=1. Kiedy RPI=0,1 produkcja jest dziesięciokrotnie mniejsza w porównaniu do osób zdrowych. RPI = 10 oznacza produkcję dziesięciokrotnie większą. Jako wartości referencyjne retikulocytów podaje się najczęściej zakres od 5 do 15 ‰ lub bezwzględną ilość retikulocytów od 30 000 do 75 000/μl (w zależności od źródła), jednakże zależy ona także od wieku pacjenta. Wartości referencyjne według wieku pacjenta:[1] Noworodki (1 dzień życia) 18-45‰; bezwzględna liczba retikulocytów: 72 000-304 000/μl 1-2 dzień życia 1-9‰; bezwzgl. licz. ret. 4 000-59 000/μl 2-7 dzień życia 1-9‰; bezwzgl. licz. ret. 4 000-57 000/μl 1-2 tydzień życia 3-9‰; bezwzgl. licz. ret. 11 000-56 000/μl 2-4 tydzień życia 3-9‰; bezwzgl. licz. ret. 9 000-49 000/μl 1-2 miesiąc życia 3-22‰; bezwzgl. licz. ret. 8 000-108 000/μl 2-6 miesiąc życia 5-19‰; bezwzgl. licz. ret. 16 000-86 000/ μl 6-12 miesiąc życia 5-15‰; bezwzgl.licz.ret. 19 000-80 000/ μl 1-2 rok życia 5-15‰; bezwzgl.licz.ret. 19 000-80 000/ μl 2-4 rok życia 5-15‰; bezwzgl.licz.ret. 20 000-80 000/ μl 4-6 rok życia 5-15‰; bezwzgl.licz.ret. 20 000-80 000/ μl 6-10 rok życia 5-15‰; bezwzgl.licz.ret. 20 000-76 000/μl 10-12 rok życia 5-15‰; bezwzgl.licz.ret. 20 000-76 000/μl 12-18 rok życia 5-15‰; bezwzgl.licz.ret. 21 000-80 000/μl Powyżej 18 rok życia 5-15‰; bezwzgl.licz.ret. 25 000-77 000/μl Przedstawione przykłady doskonale ilustrują fakt konieczności korygowania retikulocytów w zależności od stanu klinicznego pacjenta. Zwiększona retikulocytoza obserwowana jest przede wszystkim w niedokrwistości hemolitycznej, niedokrwistości z powodu utraty krwi, w stanach nieefektywnej erytropoezy, po skutecznym leczeniu choroby Addisona-Biermera witaminą B12. Stanowi ona jeden z najczulszych i najwcześniejszych wskaźników odnowy krwiotworzenia, zwłaszcza po transplantacji szpiku kostnego. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Dodatni BTA – leki, dziedziczenie U podłoża dodatniego wyniku bezpośredniego testu antyglobulinowego może leżeć niespecyficzne wiązanie IgG, odpowiedź organizmu na środki farmakologiczne oraz pewne predyspozycje genetyczne. Jak zostało dokładnie omówione w części pierwszej, BTA pozwala na wykrycie obecności przeciwciał opłaszczonych na krwinkach in vivo. Świadomość zaistnienia takiej sytuacji może być kluczowa dla zdrowia i życia pacjenta. Leki Uzyskanie dodatniego wyniku BTA powinno skłonić lekarza do uwzględnienia zażywanych środków farmakologicznych jako przyczyny obserwowanej anomalii. W patogenezie polekowego dodatniego BTA można wyróżnić pięć mechanizmów: -autoimmunizację -mechanizm haptenowy -mechanizm receptorowy -mechanizm kompleksów immunologicznych -mechanizm nieimmunologiczny Autoimmunizacja. Przyjmowanie niektórych leków może prowadzić do powstania autoprzeciwciał IgG skierowanych przeciw antygenom układu Rh krwinek czerwonych. U 10% pacjentów leczonych lewodopą wykrywa się dodatni BTA (po 3-12 miesiącach przyjmowania). Około 10 % chorych zażywających metyldopę w dawce 1- 2 g/24 h oraz 36% otrzymujących ponad 2 g/24 h wytwarza autoprzeciwciała. Mechanizm haptenowy Mechanizm haptenowy opiera się na wiązaniu leku lub jego metabolitów z białkami błony krwinki czerwonej. Powstałe kompleksy hapten-białko wyzwalają produkcję przeciwciał. W ten sposób działa penicylina, cefalosporyny i karbromal, prowadząc do niedokrwistości hemolitycznej. Mechanizm receptorowy Mechanizm receptorowy polega na reakcji między przeciwciałami a insuliną związaną przez receptory krwinek czerwonych u pacjentów, którzy wytworzyli przeciwciała antyinsulinowe IgG. Upatruje się znaczenia tego zjawiska w występowaniu niedokrwistości immunohematologicznej u części osób leczonych insuliną oraz zaangażowania w oporność na leczenie cukrzycy insuliną. Mechanizm ‘kompleksów immunologicznych’ Powstanie swoistych dla danego leku przeciwciał jest reakcją organizmu na tworzenie połączeń leku lub metabolitu leku z makrocząsteczkami. Po ponownym zażyciu leku powstają kompleksy immunologiczne lek-przeciwciało, zaabsorbowane na erytrocytach. Wyzwala to reakcję aktywacji układu dopełniacza (dopełniacz wiążą przeciwciała IgM i IgG) i hemolizę wewnątrznaczyniową. W taki sposób funkcjonuje chinina, chinidyna oraz stibofen. Tetracykliny, leki antyhistaminowe oraz sulfonamidy także działają poprzez tworzenie kompleksów immunologicznych, które mają zdolność aktywacji dopełniacza Mechanizm nieimmunologiczny Przypuszcza się, że lek powoduje wiązanie normalnych globulin osocza, stąd także IgG, do powierzchni krwinki czerwonej. Powoduje to uzyskanie dodatniego BTA bez udziału przeciwciał. Powyższy mechanizm pozwala na wytłumaczenie zjawiska silnie dodatniego BTA u 75% chorych leczonych cefalotyną przy równoczesnym braku cech hemolizy. Wśród innych leków powodujących uzyskanie fałszywie dodatniego wyniku BTA należy wymienić cefalorydynę, fenytoinę, chlorpromazynę, , hydralazynę, izoniazyd, rifampicynę, streptomycynę oraz melfalan [1]. Dziedziczenie Okazuje się, że dodatni BTA może podlegać zostać przekazany w rodzinie kolejnym pokoleniom. Udowodniono mianowicie, iż pozytywna reakcja dziedziczy się wraz z pewnym wariantem antygenu N i M. Genetycznie ma ona charakter dominujący. Nie zaobserwowano zaangażowania IgG w reakcję, stąd też wnioskowano o prawdopodobnych zmianach w metabolizmie kwasu sjalowego w krwinkach czerwonych [2]. Kilkadziesiąt lat po pierwszych doniesieniach o wpływie dziedziczenia na pozytywny wynik BTA wciąż trwają badania w tym zakresie. Naukowcy próbują wyjaśnić to zjawisko. Jedna z hipotez wskazuje na fakt posiadania przez wariant antygenu N kilku determinant w taki sposób, że grupa przenosząca białka jest odsłonięta a tym samym zdolna do reakcji w bezpośrednim teście antyglobulinowym [3]. Należy pamiętać o odpowiedniej interpretacji dodatniego BTA, zgodnej ze stanem klinicznym pacjenta. Nie we wszystkich sytuacjach wynik jest alarmujący. Zdarzają się przypadki, w których erytrocyty są pokryte przeciwciałami, ale nie ma widocznych zmian w zdrowiu osoby badanej. Kliniczna istotność zależy, bowiem od: – stężenia przeciwciał – klasy i podklasy przeciwciał – specyficzności przeciwciał – zdolności przeciwciał do aktywacji komplementu – rozłożenia antygenu na powierzchni erytrocytów – mechanizmów kompensacyjnych W dobie postępu medycyny należy pamiętać, iż każda ingerencja w organizm ludzki niesie ze sobą implikacje. Na uzyskanie dodatniego BTA mogą wpływać zażywane środki farmakologiczne a także pewne niespecyficzne reakcje często związane z podstawowym schorzeniem pacjenta. Ponadto istnieją rzadkie przypadki genetycznego podłoża pozytywnego wyniku BTA. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Właściwości interferencyjnych RNA małych Zjawisko interferencji RNA funkcjonujące jako mechanizm regulacji ekspresji genów odkryto niemal dwie dekady temu. RNAi wzbudziło duże zainteresowanie w świecie nauki. Eksperyment z wykorzystaniem syntetycznych siRNA pokazał, że może to być nie tylko jeden z procesów zachodzących w komórkach, ale również metoda dająca nadzieję na wykorzystanie w terapii, gdy pojawiają się trudności ze stosowaniem klasycznych metod leczenia. Wiele przeprowadzonych badań nad RNAi pozwoliło poznać właściwości siRNA. Dzięki temu projektując sekwencje syntetycznych małych interferencyjnych RNA można próbować uniknąć przynajmniej części działań niepożądanych. Jest to bardzo ważny etap na drodze do zastosowania siRNA w medycynie. Mechanizm wyciszania genów z wykorzystaniem interferencyjnego RNA (RNAi) był opisywany na łamach Doliny Biotechnologicznej. Zasadniczo można tu rozróżnić dwa rodzaje RNA biorące udział w wyciszaniu genów: dwuniciowe RNA (dsRNA) oraz mikroRNA (miRNA). W pierwszym przypadku dsRNA może być efektem ekspresji trans genu, lub replikacji wirusowego genomu RNA. Proces związany z interferencją RNA jest w tym przypadku mechanizmem obronnym komórki przed inwazją obcych wirusów czy transpozonów [1]. Z kolei w drugim przypadku komórka w egzonach posiada geny z których polimeraza II RNA transkrybuje prekursory pri-mikroRNA (ok. 70 nukleotydów) o kształcie „spinki do włosów”, które przechodzą proces dojrzewania. Dalszy mechanizm działania jest zbliżony niezależnie od pochodzenia RNA [2,3]. Dwuniciowy RNA jest cięty do krótkich odcinków (od 21 do 23 par zasad) przez wielodomenową nukleazę Dicer. Powstałe w ten sposób produkty hydrolizy są włączane do kompleksu RISC (ang. RNA-induced silencing complex – indukowany przez RNA kompleks wyciszający), który jest kierowany do docelowej sekwencji mRNA. Znajdująca się w RISC endorybonukleaza wykorzystuje antysensowną nić siRNA (małe interferencyjne RNA ang. Small interfering RNA) do odnalezienia komplementarnego do niej fragmentu mRNA. Z tego powodu siRNA bywa nazywany dupleksem kierującym. Specyficzność mechanizmu RNAi opiera się na dokładnym sparowaniu antysensownej nici siRNA z docelowym mRNA. Jeżeli takie sparowanie dojdzie do skutku, endorybonukleaza hydrolizuje komplementarną sekwencję mRNA [4]. W przypadku miRNA sparowanie nie musi być aż tak dokładne. Może opierać się na komplementarności tzw. rejonu seed – nukleotydów w pozycjach 2-8 od końca 5” nici aktywnej (antysensownej). Ponadto w przypadku miRNA hamowanie aktywności genu częściej odbywa się poprzez represję translacji niż degradację mRNA [5]. Przełomowym odkryciem, istotnym dla wykorzystania zjawiska interferencji RNA w terapii, było wprowadzenie do komórki syntetycznego siRNA [6]. Jednak ze skuteczną inkorporacją siRNA do komórki wiąże się szereg wymogów związanych doborem sekwencji docelowej, budową RNA, funkcjonowaniem kompleksów białkowych zaangażowanych w proces wyciszania genów, czy konieczność zabezpieczenia siRNA podczas wprowadzania do komórki przed działaniem nukleaz. Sekwencja docelowa Sekwencja docelowa to miejsce w genie komplementarne dla wybranego siRNA, dzięki czemu krótki RNA będzie mógł zainicjować proces regulacji ekspresji wybranego genu. Sekwencje docelowe mogą znajdować się w niekodujących rejonach mRNA od końca 5’ i 3’ (ang. UnTranslated Region, 5’ i 3’UTR). Mogą też znajdować się w sekwencji kodującej – 70 do 100 nukleotydów od kodonu START translacji. Są to zarazem sekwencje, gdzie liczba nukleotydów G+C mieści się w granicach od 30 do 70%. Ich dostępność jest uzależniona od odległości od kodonu START. Położone blisko niego mogą nie być dostępne dla siRNA ze względu na asocjacje tego regionu z białkami [7]. Budowa siRNA siRNA powstające w wyniku hydrolizy dsRNA przez rybonukleazę Dicer wykazuje się charakterystyczną budową. Obie nici mierzą od 21 do 23 nukleotydów. Tworzą one dupleks na odcinku 19 par nukleotydów, pozostawiając dwa lub więcej wolnych nukleotydów na końcach 3’. Na końcu 3’ znajduje się wolna grupa hydroksylowa, natomiast na końcu 5’ grupa fosforanowa. Obecność grupy fosforanowej na końcu 5’ nici antysensownej ma wpływ na występowanie procesu interferencji RNA. Grupa ta została określona jako punkt odniesienia, od którego mierzone jest miejsce hydrolizy mRNA przez endonukleazę znajdującą się w kompleksie RISC. Warunkiem poprawnego działania siRNA jest jego homologia względem jednego wybranego genu. Nawet częściowa homologia względem innych genów może prowadzić do niespecyficznego i nieplanowanego ich wyciszania, czego skutkiem jest wystąpienie niepożądanych efektów (ang. off-target effects) [8]. Dupleks, który jest homologiczny względem więcej niż jednej sekwencji genowej jest w stanie skutecznie hamować działanie wybranego genu. Może jednak równocześnie częściowo hybrydyzować z innym transkryptem, zgodnie z mechanizmem działania miRNA. Wykorzystuje wówczas komplementarność rejonu seed. Z tego względu należy unikać homologii tego regionu do sekwencji genów innych niż gen docelowy. siRNA może zostać zabezpieczone przed wystąpieniem off-target effects poprzez wprowadzenie modyfikacji chemicznych w pozycji 2 nici antysensownej. Ryc. 1 Struktura klasycznego siRNA. Opracowanie własne. Przeprowadzono badania wskazujące na to, że nie tylko dupleks o klasycznej budowie złożony z dwóch komplementarnych nici 21-nt z dwoma niesmarowanymi nukleotydami na końcach 3’, może wydajnie uczestniczyć w wyciszaniu genów. Ograniczeniem długości jest 30 par zasad. Dupleksy przekraczające rozmiarami tę liczbę mogą wywoływać niespecyficzną odpowiedź komórki. Interferencyjne RNA, którego nici są dłuższe niż 21 nukleotydów staje się substratem dla nukleazy Dicer. Może to zwiększać ich aktywność w procesie interferencji RNA, co związane jest z bezpośrednim przeniesieniem produktu hydrolizy Dicer do kompleksu RISC. W badaniach wykorzystywano również asymetryczne dupleksy o różnej długości nici sensownej i antysensownej. Testowano między innymi układy gdzie nić sensowna mierzyła od 15 do 19nt natomiast nić antysensowna 21nt [9]. Taka konstrukcja dupleksu może stać się zabezpieczeniem przed udziałem nici sensownej w reakcjach niespecyficznych. Ponadto, jeśli nić sensowna nie będzie posiadać dwóch wolnych nukleotydów na końcu 3’ – nie będzie rozpoznawana i kierowana do kompleksu RISC. Co więcej, „tępy” koniec 3′ nici sensownej pomaga w inkorporacji nici antysensownej do kompleksu RISC. Funkcjonalnie można dupleks zbudować z trzech nici. Nić antysensowna pozostaje niezmieniona. Natomiast zamiast jednej nici sensownej opracowano dwie krótkie: 9 i 12 nukleotydów. Powstaje w ten sposób sisiRNA (ang. small internally segmented interfering RNA). Tak skonstruowane RNA może bardzo wydajnie brać udział w procesie wyciszania genów. W badaniach interferencji RNA wykorzystano też zwinięte z jednej nici RNA, aby uzyskać siRNA struktury spinki do włosów (ang. short hairpin – shRNA. Skutecznie zastosowano również nietypowe cykliczne siRNA (ang. dumbbell siRNA), które jak się okazuje również może brać udział w wyciszaniu genów. W przypadku shRNA lub struktury cyklicznej nukleaza Dicer rozpoznaje takie RNA [10], a następnie hydrolizuje je wytwarzając typowe dupleksy siRNA. Zaletą dumbbell siRNA jest wyższa o około 20°C temperatura topnienia, co zwiększa stabilność struktury RNA [11]. Ryc. 2. Przykładowe modyfikacje struktury siRNA. Opracowanie własne. Dużym ułatwieniem dla wszystkich zamierzających projektować siRNA są programy pomagające zaplanować miejsca w wyciszanym genie, jak również proponujące sekwencje nici siRNA [12]. Immunostymulacja Jak już wcześniej zostało wspomniane, długie dupleksy liczące powyżej 30 par zasad mogą w większości komórek somatycznych wywoływać obok interferencji RNA również szereg niespecyficznych odpowiedzi. Odpowiedź interferonowa na tej długości dupleks może prowadzić do śmierci komórki. RNA w cytoplazmie rozpoznawane jest przez immunorecptory TLR (ang. Toll-Like Receptors), kinezę białkową zależną od RNA (PKR, ang. Double-Strand RNA Dependent Protein Kinase) a także helikazy RIG-1 oraz MDA5 [13]. Zostały zidentyfikowane motywy występujące w sekwencji RNA, które działają immunostymulująco. Są to: 5’-UGUGU-3’, 5’-GUCCUUCAA-3’. Wiadomo, że każda sekwencja bogata w uracyl (U) może być rozpoznana przez immunorecptor TLR7. Z kolei wpływ na aktywację helikazy RIG-1 może mieć obecność 5’-trifosforanu lub „tępych” końców dupleksu (jest to sytuacja, gdy obie nici kończą się wspólną parą nukleotydów). W przypadku siRNA zbudowanego z nici mierzących od 23 do 30 par zasad, możliwa jest odpowiedź interferonową. Niektóre metody transefekcji dupleksu do komórki mogą być przyczyną odpowiedzi immunologicznej. Na przykład zastosowanie nośników liposomowych lub specyficznych przeciwciał będzie wywołać taką odpowiedź, podczas gdy elektroporacja jej nie indukuje [14]. Poważnym problemem związanym z inkorporacją siRNA do komórki jest rozpoznanie ich jako cząsteczek nieswoistych. Negatywnie zweryfikowane RNA jest hydrolizowane przez nukleazy znajdujące się w cytoplazmie. Pierwszym sposobem zapobiegania enzymatycznej hydrolizie siRNA jest zastosowanie naturalnie modyfikowanych nukleozydów takich jak pseudourydyna lub 5metylocytydyna. Drugim jest modyfikacja wiązania internukleotydowego (fosfodiestrowego) [15]. Można tego dokonać podmieniając niemostkowany atomu tlenu innym podstawnikiem takim jak atom siarki (tiofosforany), grupę aminową (amidofosofrany) czy borowodorową (boranofosforany) [16]. Zastępienie grupy wodorotlenową w pozycji C2’ pierścienia rybozy przez modyfikacje chemiczne (2’deoksy-, 2’-O-Me, 2’-fluoro- i podobne) również jest sposobem przeciwdziałania odpowiedzi immunologicznej komórki[17]. Ważną pomocą w procesie wyciszania ekspresji genów są programy wspierające projektowanie siRNA Schemat budowy drugorzędowej shRNA. Źródło - opracowanie własne K. Olszak, na podstawie Ziomek K. Kierzek R. Drugorzędowe motywy strukturalne RNA. Postepy Biochem. 1999, 45, 2: 80-7. licencja CC BY 3.0 Wprowadzenie syntetycznych siRNA do komórki dało nadzieję na wykorzystanie interferencji RNA w medycynie. Jednak jak każda metoda również i ta poza zaletami posiada również ograniczenia wynikające z budowy, funkcjonowania i oddziaływań w jakie mogą włączać się małe interferencyjne RNA. Najistotniejszym elementem podczas ich projektowania jest wybór sekwencji i struktury dupleksu. Planując wykorzystanie tych cząsteczek jako narzędzi terapii trzeba pamiętać o ich właściwościach. Można je korzystnie zmienić stosując modyfikacje chemiczne. W efekcie nastąpi poprawa stabilności struktury, wzrośnie odporność na działanie nukleaz, zredukowana zostanie przynajmniej część niepożądanych efektów stosowania tej metody. Piśmiennictwo 1. Olszak K. Zjawisko interferencji RNA u zwierząt i ludzi. Dolina Biotechnologiczna. 03.05.2016 2. Andrzejczak O. MikroRNA w terapii nowotworów (I) — małe cząsteczki o wielkim znaczeniu. Dolina Biote chnologiczna. 21.10.2015 3. Andrzejczak O. MikroRNA w terapii nowotworów (II) — o miRNA i nowotworzeniu. Dolina Biotechnologiczna. 21.10.2015 4. Hannon GJ. RNA interference. Nature, 2002, 418, 6894: 244-51. 5. Birmingham A. Et al. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 2006, 3, 3:199-204. 6. Elbashir S. et al. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev, 2001, 15, 2: 188–200. 7. Hajeri PB, Singh SK. siRNAs: their potential as therapeutic agents–Part I. Designing of siRNAs. Drug Discov Today. 2009, 4, 17-18: 851-8. 8. Jackson AL. et al. Widespread siRNA “off-target” transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity. RNA. 2006, 12, 7: 1179–1187. 9. Chang CI. et al. Asymmetric shorter-duplex siRNA structures trigger efficient gene silencing with reduced nonspecific effects. Mol Ther. 2009, 17, 4:725-32. 10. Siolas D. et al. Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers. Nat Biotechnol. 2005, 23, 2:227-31. 11. Pieczyński M. i wsp. Zastosowanie cząsteczek RNA w modelowaniu ekspresji wybranych genów. Biotechnologia. 2010, 3, 90: 7-28. 12. Fakhr E. et al. Precise and efficient siRNA design: a key point in competent gene silencing. Cancer Gene Ther. 2016, 23, 4:73-82. 13. Schlee M. et al. siRNA and isRNA: two edges of one sword. Mol Ther. 2006, 14, 4: 463-70. 14. Song E. et al. Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors. Nat Biotechnol. 2005 Jun;23(6):709-17. 15. Sierant M. Modyfikowane chemicznie dupleksy siRNA. Biotechnologia. 2010, 3, 90: 146-172. 16. Li ZY. et al. The effects of thiophosphate substitutions on native siRNA gene silencing. Biochem Biophys Res Commun. 2005, 15, 329, 3:1026-30. 17. Prakash TP. et al. Positional effect of chemical modifications on short interference RNA activity in mammalian cells. J Med Chem. 2005, 30, 48, 13:4247-53. Tęcza w próbówce: jak dobierać barwniki sond w reakcjach multiplex? Jeżeli projektujecie reakcje Real-Time PCR (szczególnie pośredniego ilościowania), warto zastanowić się nad wersją multiplex: zastosowanie kilku par starterów i sond jest najwygodniejszym, najszybszym i najbardziej precyzyjnym sposobem na ilościową ocenę kilku transkryptów. Pojawia się jednak istotny problem: jakie barwniki do sond będą najbardziej odpowiednie? Każdy z barwników posiada specyficzne spektrum absorpcji i emisji fali świetlnej. Fluorescencja jest skutkiem wybicia niosącego wysoką energię elektronu z cząsteczki barwnika i emisji części pochłoniętej podczas tego procesu energii. Cząsteczka barwnika pochłania odpowiedni kwant światła o wyższej energii (absorpcja), a po wybiciu elektronu emituje kwant o niższej energii (emisja). Od struktury cząsteczki i rozkładu powłok elektronowych zależy, jak duża porcja energii musi być dostarczona- dlatego różne barwniki wymagają odmiennych długości fali świetlnej (niosących różną energię) do wzbudzenia. Dobór odpowiedniego zestawu barwników, których spektra emisji i absorpcji jak najmniej się pokrywają, jest bardzo istotny: pozwala na minimalizację tła i nie prowadzi do niespecyficznego odczytu fluorescencji. W sieci dostępne jest kilka zestawień, które ułatwiają dokonanie wyboru, jednak w żadnym z nich nie ma pełnej gamy barwników, oferowanej obecnie na rynku. Poniżej przedstawiam kilka takich zestawień. 1. Multiplexing qPCR recomendations, Biosearch Technologies Moja ulubiona aplikacja do wyboru sond. Z jednej strony mamy możliwość przejrzenia tabeli sond oferowanych przez BT, idealnych dla danego termocyklera, z drugiej możemy sami zestawić niemal dowolnie spektra absorpcji i emisji dwudziestu barwników, które zostały wprowadzone do bazy aplikacji „Spectral Overlay Chart„. 2. Qiagen Multiplex Real-Time PCR Resource Center Qiagen opublikował na swojej stronie ciekawe poradniki dot. multiplex RQ-PCRu, jednak najprzydatniejsza jest tabela zestawień barwników w kombinacjach pod dany termocykler. Mamy tu większy wybór niż w przypadku tabeli BT. 3. Zestawienie sond Genomedu Ciekawe zestawienie 74 kombinacji barwnik-quencher, porównujące chyba wszystkie potrzebne nam parametry. Wygodna zakładka w lewym górnym rogu pozwala „odsiać” tylko te sondy, które zawierają interesujący nas barwnik lub quencher. Estetycznie i kolorowo. Wybór sondy do qPCR może być nie lada wyzwaniem, zważywszy na szeroki ich wybór na rynku. Jakie znaczenie ma wybór odpowiednich barwników? Pytanie na pozór proste, wcale takie nie jest. Przede wszystkim musimy wiedzieć, jakie kanały fluorescencji odczytuje nasz termocykler. Ta podstawowa informacja powinna znajdować się w opcjach oprogramowania oraz w instrukcji urządzenia. W starszych termocyklerach mieliśmy do wyboru np. tylko 2 kanały (zielony pod FAM i SYBR i żółty pod JOE). Obecnie większość cyklerów ma możliwość odczytu co najmniej 5 kanałów, co daje nam prawie nieograniczoną dowolność w doborze kolorów. Ważne są także długości fali wzbudzenia i emisji lasera naszego urządzenia. Warto wybierać takie barwniki, których maksima absorpcji/emisji są zbliżone do wartości zdefiniowanych w cyklerze. W tej materii przychodzą nam z pomocą wspomniane wcześniej tabele. Pozostaje jeszcze kwestia quencherów: skąd mamy wiedzieć, jaki „wyciszacz” będzie najlepszy dla sond typu FRET, jeżeli mamy do wyboru kilka z nich? Żeby odpowiedzieć sobie na to pytanie zapoznajmy się ze spektrum absorpcji quenchera i spektrum emisji barwnika fluorescencyjnego. Idealny quencher absorbuje na tych samych długościach fali, na których barwnik emituje. Ostatnia z uwag dotyczących barwników: nie wszystkie barwniki są tak samo wydajne jeśli chodzi o fluorescencję. Np. sondy oparte o FAM w porównaniu z większością „nowoczesnych” barwników (w sondzie o tej samej sekwencji i stęzeniu) mają ponad dwukrotnie niższą fluorescencję. Nie jest to problemem, musimy jednak zoptymalizować tzw. „gain” w opcjach oprogramowania cyklera (dla danego barwnika i dla danej reakcji) który pozwoli nam do pewnego stopnia znormalizować różnice we fluorescencji różnych barwników.
