Wpływ długotrwałego stosowania diety wzbogaconej we flawonoidy

Kamola
Probl
HigDEpidemiol
i wsp. Wpływ
2013,
długotrwałego
94(4): 843-846
stosowania diety wzbogaconej we flawonoidy, karotenoidy ...
843
Wpływ długotrwałego stosowania diety wzbogaconej we
flawonoidy, karotenoidy, wielonienasycone kwasy tłuszczowe
i bakterie probiotyczne na profil limfocytów tkanki jelita
grubego szczurów
Influence of long-term administration of diet enriched with flavonoids, carotenoids, probiotics
and unsaturated fatty acids on mucosal lymphocyte profile of colon tissue in rats
Dariusz Kamola, Adam Prostek, Hanna Kosińska, Michał Jank, Małgorzata Gajewska, Jacek Wilczak
Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie
Wprowadzenie. Wzrost występowania niezakaźnych chorób układu
pokarmowego takich jak rak jelita grubego powoduje, że poszukiwane
są skuteczne metody profilaktyki. Liczne działania niepożądane
chemoprewencji kwasem acetylosalicylowym wymuszają poszukiwanie
alternatywnych metod ochrony organizmu opartych o naturalne substancje
bioaktywne takie, jak: flawonoidy, karotenoidy, wielonienasycone kwasy
tłuszczowe oraz bakterie probiotyczne. Głównym miejscem oddziaływania
składników pokarmowych na układ odpornościowy jest tkanka limfoidalna
związana z błoną śluzową układu pokarmowego (GALT).
Cel badania. Ocena wpływu długotrwałego stosowania diety zawierającej
4 grupy substancji bioaktywnych (karotenoidy, flawonoidy, wielonienasycone
kwasy tłuszczowe i bakterie probiotyczne) na profil limfocytów jelita
grubego szczurów.
Materiał i metody. W badaniu przeprowadzono na 18 szczurach rasy
Sprague-Dowley (Charles River Laboratories, Germany), podzielonych na
2 grupy (kontrolna – Kon i eksperymentalna – Sup). Przez 14 miesięcy
otrzymywały one dietę półsyntetyczną wzbogaconą o badane związki.
Z pobranych w toku sekcji wycinków jelita wyizolowano limfocyty warstwy
nabłonkowej (IELs) i blaszki właściwej (LPLs), które zostały zliczone przy
użyciu techniki cytometrii przepływowej (FACS Aria, BD Biosceiences).
Wyniki. Stosowanie diety wzbogaconej w substancje bioaktywne
spowodowało istotne zwiększenie udziału limfocytów Tc, Th oraz B w ogólnej
populacji IELs (test t-studenta, p≤0,05). W przypadku limfocytów blaszki
właściwej pod wpływem suplementacji statystycznie istotnemu wzrostowi
uległy wszystkie limfocyty Tc, Th i B oraz komórek NK (test t-studenta,
p≤0,05).
Wnioski. Długotrwałe stosowanie diety wzbogaconej w substancje
bioaktywne spowodowało istotny wzrost procentowej zawartości limfocytów B,
Tc Th oraz komórek nK, w obu badanych warstwach w jelita grubego. Efekt ten
może świadczyć o zwiększonym potencjale obronnym organizmu i efektywnej
stymulacji układu GALT przez zawarte w diecie związki bioaktywne.
Słowa kluczowe: GALT, WNKT, kwas eikozanowy, szczur, jelito, limfocyty B,
Tc, Th, komórki NK
© Probl Hig Epidemiol 2013, 94(4): 843-846
www.phie.pl
Nadesłano: 26.07.2013
Zakwalifikowano do druku:13.11.2013
Introduction. An increase in the incidence of non-infectious diseases
of the digestive system, such as colon cancer, drives researchers to
pursue new methods of effective prophylaxis. Numerous side effects of
aspirin chemoprevention points the search towards alternative methods
of protecting the body, based on natural bioactive substances such as
polyphenols, carotenoids, polyunsaturated fatty acids and probiotics. The
Gut Associated Lymphoid Tissue (GALT) is the intestinal tissue through
which nutrients can affect the immune system.
Aim. To evaluate the effects of long-term use of diet supplemented with four
groups of bioactive substances (carotenoids, polyphenols, polyunsaturated
fatty acids and probiotics) on the colon lymphocyte profile in the population
of rats.
Materials & methods. The study was conducted on 18 rats of the
Sprague-Dowley strain (Charles River Laboratories, Germany), divided into
two groups (control – Kon and experimental – Sup). During 14 months
they received a semisynthetic diet enriched with the tested compounds.
During necropsy, samples of colon were obtained and processed to isolate
intraepithelial lymphocytes (IELs) and lamina propria lymphocytes (LPLs).
The isolated cells were counted using the flow cytometry (FACS Aria, BD
Biosceiences).
Results. The use of dietary bioactive substances resulted in a significant
increase of lymphocytes Tc, Th and B in the general IELs count (t-test,
p≤0.05). In the case of lamina propria lymphocytes the supplementation
caused a statistically significant increase of Tc, Th, B as well as NK cells
populations (t-test, p ≤0.05).
Conclusions. Long-term use of dietary bioactive substances caused
a significant increase in the percentage of B ,Th, Tc and NK cells in both
examined layers of the colon wall. This fact may indicate an increased
defensive potential of the body and the effective stimulation of the GALT
by the bioactive dietary compounds.
Key words: GALT, PUFA, eicosanoic acid, rat, intestinal, lymphocyte B, Tc,
Th, NK-cell
Adres do korespondencji / Address for correspondence
Jacek Wilczak
Katedra Nauk Fizjologicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej Szkoły
Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie
ul. Nowoursynowska 159, 02-776 Warszawa
e-mail: [email protected]
844
Wprowadzenie i cel badań
W obszarze przewodu pokarmowego na odcinku
jelit znajduje się największy z elementów tkanki limfatycznej związanej morfologicznie i czynnościowo
z błonami śluzowymi (MALT). Od miejsca występowania jest ona nazywana tkanką limfoidalną związaną
z błoną śluzową układu pokarmowego (GALT). Układ
ten jest jednym z najważniejszych elementów układu
immunologicznego człowieka. Dzięki zdolności do
produkcji immunoglobulin klasy A (IgA) układ GALT
jest również istotnym elementem układu odpowiedzi
humoralnej, w skład którego wchodzą również skupiska grudek limfoidalnych zwanych kępkami Peyera.
Zawierają one naiwne limfocyty B, limfocyty T oraz
komórki M, odpowiedzialne za pobieranie ze światła
jelita patogenów i przekazywanie ich makrofagom
oraz komórkom dendrytycznym w celu prezentacji
limfocytom T. Obecnie do najważniejszych chorób
populacyjnych zalicza się choroby o podłożu dietozależnym, wśród których najpowszechniejszą grupą
chorób są schorzenia układu pokarmowego takie jak
nowotwory jelita oraz nieswoiste zapalenie jelita – występujące u ludzi jako choroba Leśniowskiego-Crohna
– oraz wrzodziejące zapalenie jelita. Bezpośredni kontakt z substancjami w świetle jelita czyni układ GALT
podatnym na modulację przez substancje bioaktywne
znajdujące się w pokarmie. Obecnie popularne jest
łączenie wielu grup związków biologicznie aktywnych
w diecie a nawet w jednym produkcie. Z tego powodu
zasadne jest prowadzenie badań dostarczających informacji o łącznym efekcie działania układów substancji,
także ze względu na nierzadko przeciwstawne lub
konkurencyjne mechanizmy oddziaływania. Jednym
z najpopularniejszych dodatków funkcjonalnych
do żywności są bakterie probiotyczne. Badania kliniczne wykazały, że wzbogacenie diety w bakterie
probiotyczne może być stosowane jako czynnik wspomagający przy leczeniu nieswoistego zapalenia jelita
(IBD) [1]. Ponadto wykazano również zwiększoną
produkcję interferonu gamma (INF- g) u chorych na
raka, którym podawano preparaty symbiotyczne [2].
Popularną grupą dodatków funkcjonalnych są surowce
zawierające związki polifenolowe, wśród których najliczniejszą grupę stanowią flawonoidy. Wykazują one
zdolność do modulacji funkcjonowania układu GALT
poprzez szlaki sygnałowe zależne od NF-kB i MAPK
[3]. Istotna jest także suplementacja diety i wzbogacanie żywności w wielonienasycone kwasy tłuszczowe
z rodziny n-3 (n-3 PUFA), których głównym źródłem
są zimnowodne ryby morskie. Ich niedobór powoduje
upośledzenie humoralnej i komórkowej odpowiedzi
immunologicznej. Kwasy PUFA są niezbędnymi
składnikami ścian komórkowych limfocytów [4]
oraz są substratami do produkcji mediatorów procesu
zapalnego [5]. Powyższe związki bioaktywne zostały
Probl Hig Epidemiol 2013, 94(4): 843-846
dotychczas starannie przebadane. Jednak badany był
jedynie wpływ pojedynczych substancji na organizm
zwierzęcia, brakuje natomiast wyników badań mówiących o łącznym oddziaływaniu wyżej wymienionych
substancji bioaktywnych.
Materiał i metody
Eksperyment został przeprowadzony z wykorzystaniem 8-tygodniowych samców szczurów rasy
Sprague-Dowley (Charles River Laboratories, Germany). Zwierzęta zostały podzielone na 2 grupy: grupa
kontrolna (n=9) i grupa eksperymentalna (n=9).
Zastosowano następujące składniki bioaktywne:
szczepy bakterii probiotycznych pochodzące z Chr.
Hansen (Dania) Lactobacillus acidophilus LA-5 i Bifidobacterium animals ssp. lactis BB-12, puree z dyni
jako źródło karotenoidów i włókna pokarmowego,
wodny wyciąg z kwiatostanu lipy jako źródło flawonoidów oraz olej z łososia jako źródło n-3 PUFA. Po 14
miesiącach stosowania diety szczury zostały poddane
eutanazji, do dalszych analiz zostały pobrane wycinki
jelita. Limofcyty były izolowane z tkanki jelita metodą
zaproponowaną przez Lee [6].
Wyniki i omówienie
Stosowanie diety wzbogaconej w substancje bioaktywne spowodowało istotne zwiększenie udziału
limfocytów Tc, Th oraz B w ogólnej populacji IELs (test
t-studenta, p≤0,05), jedynie komórki NK wykazały
nieistotny statystycznie wzrost udziału w populacji
(test t-Studenta, p≤0,05) (tab. I).
Tabela I. Procentowy udział limfocytów Tc, Th, B oraz komórek NK w ogólnej
puli limfocytów warstwy nabłonkowej jelita grubego szczurów otrzymujących
dietę kontrolna (Kon) i eksperymentalna (Sup)
Table I. Percentage content of lymphocytes Tc, Th, B and NK cells in intraepithelial leukocytes (IELs) subpopulation in control (Kon) and experimental
(Sup) rat groups
Limfocyty warstwy nabłonkowej jelita grubego [% ogólnej populacji]
(średnia ± SEM) /Intraepithelial leukocytes (IELs) [% of total population]
(mean ± SEM)
Dieta kontrolna (Con)
/Control diet (Con)
Dieta eksperymentalna
(Sup) /Experimental
diet (Sup)
Limfocyty Tc
/Lymphocyte Tc
8,142±0,66
15,50±0,81*
Limfocyty Th
/Lymphocyte Th
11,89±1,16
25,16±1,97*
Limfocyty B
/Lymphocyte B
11,15±1,18
20,07±1,15*
Komórki NK
/NK cells
6,326±0,65
8,102±0,85
* oznacza wyniki istotnie statystycznie różne dla testy t-Studenta (p≤0,05)
*– valueses significantly different (t-test, p<0.05)
W przypadku limfocytów blaszki właściwej pod
wpływem suplementacji statystycznie istotnemu
wzrostowi uległy wszystkie badane grupy komórek
Kamola D i wsp. Wpływ długotrwałego stosowania diety wzbogaconej we flawonoidy, karotenoidy ...
odpornościowych tj. limfocyty Tc, Th i B oraz komórki
NK (test t-Studenta, p≤0,05) (tab. II).
Tabela II. Porównanie procentowego udział limfocytów Tc, Th, B oraz
komórek w blaszce właściwej jelita grubego szczurów rasy Sprague-Dowley
otrzymujących dietę kontrolna (CON) i eksperymentalna (SUP)
Table II. Percentage content of lymphocytes Tc, Th, B and NK cells in lamina
propia (LPLs) subpopulation in control (Kon) and experimental (Sup) rat groups
Limfocyty blaszki właściwej jelita grubego [% ogólnej populacji] (średnia ±
SEM) /Lamina propria lymphocytes (LPLs) [% of total population] (mean
± SEM)
Dieta kontrolna (Con)
/Control diet (Con)
Dieta eksperymentalna
(Sup) /Experimental
diet (Sup)
Limfocyty Tc
/Lymphocyte Tc
9,754±0,67
13,14±0,67*
Limfocyty Th /Lymphocyte Th
7,52±1,55
15,36±1,32*
Limfocyty B
/Lymphocyte B
6,869±0,50
41,37±1,47*
Komórki NK
/NK cells
2,42±0,18
3,708±0,61*
* – oznacza wyniki istotnie statystycznie, różne dla testu t-Studenta (p≤0,05)
* – values significantly different (t-test, p<0.05)
Komórki NK są to cytotoksyczne limfocyty
biorące udział w humoralnej odpowiedzi immunologicznej, są one odpowiedzialne za szybką odpowiedź na infekcje wirusowe i komórki nowotworowe.
W prezentowanym eksperymencie nastąpił istotny
statystycznie wzrost zawartości komórek NK w blaszce
właściwej jelita. W przypadku warstwy nabłonkowej
nie zaobserwowano istotnych statystycznie zmian.
Nie udało się odnaleźć informacji dotyczących wpływu zastosowanych substancji bioaktywnych na ilość
komórek NK w tkance jelita. Odmienną funkcję
w organizmie pełnią limfocyty pomocnicze T (Th).
Mają one istotny udział w przejściu pomiędzy klasami
limfocytów B, aktywacji i stymulacji cytotoksyczności
limfocytów T oraz stymulacji fagocytozy przez makrofagi. W prezentowanych badaniach w przypadku
obu populacji (LPLs i IELs) możemy zaobserwować
statystycznie istotny wzrost udziału komórek Th.
Brak dostępnych danych literaturowych dotyczących
wpływu substancji bioaktywnych na ilość limfocytów
845
Th w tkankach. W odniesieniu do pozostałych dodatków tj. związków polifenolowych [7], n-3 PUFA
[8, 9] i bakterii probiotycznych [10] opisany jest ich
hamujący wpływ na komórki Th. Głównymi komórkami docelowymi dla komórek Th są limfocyty B. Pod
wpływem stosowania diety wzbogaconej w substancje
bioaktywne nastąpił statystycznie istotny wzrost
udziału limfocytów B w obu warstwach jelita grubego (LPLs i IELs). Ostatnią badaną grupą limfocytów
w tym eksperymencie są limfocyty T cytotoksyczne
(Tc), ich cechą charakterystyczną jest obecność białka
CD8 na powierzchni komórki. Są one odpowiedzialne
za zabijanie komórek nowotworowych zakażonych
wirusem lub riketsjami. Stosowanie diety wzbogaconej
spowodowało istotny statystycznie wzrost udziału komórek Tc w obu badanych subpopulacjach limfocytów
(LPLs i IELs). Badania Scharek i wsp. z 2005 r. wskazują, że stosowanie bakterii probiotycznych, zwiększa
udział limfocytów CD8+ w IELs przy czym nie wpływa na populację LPLs [11]. Obecne są również dane
wskazujące, że karotenoidy i polifenole zwiększają
ilość limfocytów Tc we krwi [12, 13]. Brak natomiast
informacji o podobny efekcie działania kwasów n-3
PUFA.
Należy zaznaczyć, że wyraźny wzrost udziału
limfocytów w tkance nie był połączony ze wzrostem
poziomu cytokin prozapalnych i białek ostrej fazy
(dane niezałączone). Można założyć, ze wzrost ten
ma charakter zwiększenia potencjału obronnego organizmu, bez konieczności wystąpienia indukującego
produkcję limfocytów stanu zapalnego.
Wnioski
1. Długotrwałe stosowanie diety wzbogaconej w substancje bioaktywne spowodowało istotny wzrost
ilości limfocytów w obu badanych warstwach
w jelita grubego.
2. Efekt długotrwałego stosowania diety wzbogaconej w substancje bioaktywne może świadczyć
o zwiększonym potencjale obronnym organizmu
i efektywnej stymulacji układu GALT przez zawarte w diecie związki bioaktywne.
Piśmiennictwo / References
1. Steed H, Macfarlane GT, Macfarlane S. Prebiotics, synbiotics
and inflammatory bowel disease. Mol Nutr Food Res 2008,
52: 898-905.
2. Roller M, et al. Consumption of prebiotic inulin enriched
with oligofructose in combination with the probiotics
Lactobacillus rhamnosus and Bifidobacterium lactis
has minor effects on selected immune parameters in
polypectomised and colon cancer patients. Br J Nutr 2007,
97: 676-684.
3. Romier B, et al. Dietary polyphenols can modulate the
intestinal inflammatory response. Nutr Rev 2009, 67:
363‑378.
4. Fekete SG, Kellems RO. Interrelationship of feeding with
immunity and parasitic infection: a review. Vet Med-Praha
2007, 52: 131.
5. Dona M, et al. Resolvin E1, an EPA-derived mediator in
whole blood, selectively counterregulates leukocytes and
platelets. Blood 2008, 112: 848-855.
6. Lee J-S, et al. Improved isolation methods for mucosal
leukocytes from small and large intestines in rats. Biosci
Biotechnol Biochem 2009, 73: 1732-1740.
7. Tomita M, et al. Tea pigments inhibit the production of type 1
(TH1) and type 2 (TH2) helper T cell cytokines in CD4+
T cells. Phytother Res 2002, 16: 36-42.
846
8. Arrington JL, et al. Dietary n-3 polyunsaturated fatty acids
modulate purified murine T-cell subset activation. Clin Exp
Immunol 2001, 125: 499-507.
9. Ly LH, Smith R, Chapkin RS, McMurray DN. Dietary n-3
polyunsaturated fatty acids suppress splenic CD4+ T cell
function in interleukin (IL)-10–/– mice. Clin Exp Immunol
2005, 139: 202-209.
10. Kreuzer S, et al. Feeding of the probiotic bacterium
Enterococcus faecium NCIMB 10415 differentially affects
shedding of enteric viruses in pigs. Vet Res 2012, 43: 58.
Probl Hig Epidemiol 2013, 94(4): 843-846
11. Scharek L, et al. Influence of a probiotic Enterococcus faecium
strain on development of the immune system of sows and
piglets. Vet Immunol Immunopathol 2005, 105: 151-161.
12. Mantena SK, et al. Orally administered green tea polyphenols
prevent ultraviolet radiation-induced skin cancer in mice
through activation of cytotoxic T cells and inhibition of
angiogenesis in tumors. J Nutr 2005, 135: 2871-2877.
13. Murata T, et al. Effect of long-term administration of betacarotene on lymphocyte subsets in humans. Am J Clin Nutr
1994, 60: 597-602.