PCR Polymerase Chain Reaction- rodzaje
advertisement
P CR Polymerase Chain Reaction- rodzaje Jest to łańcuchowa reakcja polimerazy to reakcja służąca do amplifikacji (namnożenia) wybranego fragmentu DNA in vitro. Reakcja, ta jest prowadzona w termocyklerach, wymaga: termostabilnej polimerazy DNA (np. polimerazy Taq), wolnych trójfosforanów nukleotydów, jonów Mg2+ oraz primerów. Wyróżnia się następujące rodzaje PCR: Real-Time PCR - (PCR w czasie rzeczywistym) – metoda ilościowego oznaczania DNA. System ten pozwala na monitorowanie reakcji w czasie, w którym ta reakcja właśnie przebiega. W czasie amplifikowania fragmentu DNA można w każdej chwili ilościowo zmierzyć powstały fragment. Jest to metoda szeroko rozpowszechniona ,lecz rzadko wykorzystywana do badan ze względu na mała ilość danych które wnosi. Reakcja ta jest przygotowana jak zwykle, z dodatkiem barwników fluorescencyjnych dsDNA .Po każdym cyklu ,za pomoca czujników jest mierzony poziom fluorescencji, barwnik fluoryzuje tylko gdy wiąże się z dsDNA (tj. produktem PCR). W odniesieniu do standardowego rozcieńczania stężenie produktu PCR- dsDNA może zostać ustalona jego długość.Często jest mylone z RT-PCR. W badaniach, real-time PCR, stosowana jest głównie w celu ustalenia ilościowych pomiarów transkrypcji genów. Technologia ta może być zastosowana do określenia sposobu wyrażania genetycznych zmian dotyczacych genu w czasie, np. w reakcji tkanek i hodowli komórek, progresja różnicowania komórek, lub w odpowiedzi na zmiany warunków środowiskowych . Diagnostyka real-time PCR, stosowana jest do szybkiego wykrywania kwasów nukleinowych, które są wykorzystywane w celach diagnostycznych, na przykład, do badań chorób zakaźnych, nowotorowych i genetycznych nieprawidłowości. Wprowadzenie rzeczywistych testów PCR do laboratorium mikrobiologii klinicznej sprawiło ze znacznej poprawie uległa diagnostyka chorób zakaźnych. Jest stosowane jako narzędzia do wykrywania nowo pojawiających się chorób, takich jak grypa i to ogólnie pojętych ich badań diagnostycznych. RT-PCR- Odwrotna transkrypcja reakcji łańcuchowej polimerazy .Jest oparta na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Można dzieki tej metodzie transkrybowac kwas RNA wyizolowany od retrowirusów w DNA.. Pierwszym krokiem w zazwyczaj dwuetapowym procesie RT-PCR jest odwrotna transkrypcji z RNA i jego uzupełnienie DNA (cDNA). Ponadto, poprzez skopiowanie RNA na DNA, można następnie zwiększać sekwencjie cDNA za pomocą starterów specyficznych dla sekwencji DNA. To wzmocnienie jest drugim i ostatnim ważnym krokiem w dwuetapowym procesie, RT-PCR. Enzymem stosowanym jest odwrotna transkryptaza (odkryta przez Temin’a i Baltimore’a na początku lat 60-tych) jest enzymem używanym przez wszystkie retrowirusy i retrotranspozony, który przepisuje genetyczną informację z wirusa albo retrotranspozonu (z RNA do DNA). Dzięki czemu może zintegrować się z genomem. Eukaryota posiadając linearny DNA używają wariantu odwrotnej trakskryptazy zwanego telomerazą – z szablonem RNA zawartym w samym enzymie. Enzym ten zawiera RNA zależną polimerazę DNA i DNA zależną polimerazę DNA, które pracują razem przeprowadzając transkrypcję w odwrotnym kierunku. RACE PCR- szybka amplifikacja końców cDNA ((ang.) Rapid Amplification of cDNA Ends PCR) Odmiana reakcji PCR, której celem jest poznanie dokładnej sekwencji jednego z końców RNA. W zależności od analizowanego końca stosowana jest metoda 3'RACE lub 5'RACE. PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism)- metoda wykorzystująca enzymy restrykcyjne w celu identyfikacji mutacji w obrębie miejsc cięcia danego enzymu. Pozwala też na wykrycie mutacji prowadzących do powstania nowych miejsc cięcia. Analiza długości fragmentów restrykcyjnych jest metodą inżynierii genetycznej wykorzystującą polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP). W metodzie tej wykorzystuje się trawienie DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych i elektroforezę. Już zmiana pojedynczego nukleotydu w sekwencji rozpoznawanej przez enzym spowoduje, że nie dokona on rozcięcia DNA, co powoduje, że np. u dwóch różnych osób powstanie różna ilość fragmentów DNA, będących produktami rozkładu pierwotnej cząsteczki. Fragmenty te będą się także różnić wielkością. Elektroforeza umożliwi rozróżnienie wielkości tych fragmentów, co będzie widoczne jako różnica w ilości i położeniu poszczególnych prążków na elektroforogramie. RG-PCR ACRS-PCR ARMS-PCR ASA-PCR PCR-ASO PCR-HD PCR-SSCP - w technice tej obie nici poddaje się denaturacji, oraz pozwala im przyjąć właściwe dla sekwencji struktury przestrzenne. Zmiany obserwuje się na żelu. Technika ta może pozwolić na wykrycie różnych alleli danego genu. PCR-DGGE PCR-TGGE inverse PCR (ITCR)- metoda wykorzystuje koliste cząsteczki DNA (powstałe w wyniku cięcia genomowego DNA enzymami restrykcyjnymi i ligowaniu tych fragmentów przez ligazę DNA pochodzącą z faga T4), które stanowią matrycę w reakcji PCR. Uzyskane produkty PCR są mniejsze niż odpowiednie produkty hydrolizy, ponieważ startery zostały zlokalizowane na koncach 5' i 3' sekwencji znanej, która ulega amplifikacji. PCR-OLA PCR-CCM PCR-PTT RAPD-PCR (Losowa Amplifikacja Polimorficznego DNA)- metoda polega na użyciu jednego, krótkiego, losowego startera. Po zakończeniu reakcji i analizie elektroforetycznej otrzymuje się różnej długości prążki będące cechą charakterystyczną danego osobnika (fingerprinting). Niestety przez niską temperaturę łączenia starterów (konieczne by uzyskać wystarczającą ilość produktów) metoda ma niską powtarzalność, i wynik zależy od wielu trudnych do określenia czynników (np. niewielkie wahania temperatury, użyte odczynniki, czasy nagrzewania/chłodzenia) REP-PCR (Repetitive sequence - based PCR)- jest to PCR z wykorzystaniem sekwencji repetytywnych. Metoda polega na wykorzystaniu w reakcji PCR starterów komplementarnych do sekwencji repetytywnych występujących w genomie. Produkty reakcji rozdzielane są na drodze elektroforezy w żelu agarozowym, tworząc swoisty wzór prążków, charakterystyczny dla danego szczepu bakterii. Metoda ma wysoką powtarzalność i ze względu na niski koszt i krótki czas, w porównaniu np. do reakcji Rea-PFGE może być stosowana do badania stopnia pokrewieństwa dużej liczby szczepów. Najczęściej stosowane są startery komplementarne do rodziny sekwencji BOX i ERIC. Enzymy restrykcyjne Restryktazy (enzymy restrykcyjne, endonukleazy restrykcyjne) Są enzymami izolowanymi z bakterii, zdolnymi do rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA i przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA. Zazwyczaj różne restryktazy rozpoznają odmienne sekwencje DNA. Wykryto jednak enzymy, które pomimo, że są różne i wyizolowane z różnych gatunków organizmów, rozpoznają identyczne sekwencje - nazwano je izoschizomerami. Istnieją również takie restryktazy, które rozpoznają różne sekwencje DNA, ale tną z utworzeniem takich samych lepkich końców. Daje to liczne możliwości w dziedzinie inżynierii genetycznej, np. przenoszenie fragmentów DNA pomiędzy różnymi cząsteczkami. Poznane dotychczas enzymy restrykcyjne podzielono na trzy główne grupy. Enzymu klasy I są najbardziej skomplikowane pod względem budowy. Cecha charakterystyczna jest to, że po rozpoznaniu specyficznej dla siebie sekwencji enzymy te dokonują hydrolizy w pewnej odległości od rozpoznanego miejsca. Może to być nawet 1000 pz. Najbardziej przydatne w badaniach biologii molekularnej enzymy klasy II są jednostkami stosunkowo prostymi w budowie i hydrolizują nić DNA w miejscu rozpoznanej przez siebie sekwencji. Enzymy restrykcyjne typu II wymagają jako substratu dwuniciowej cząsteczki DNA, zawierającej, co najmniej jedną sekwencję rozpoznawaną przez dany enzym, oraz jonów magnezu. DNA zostaje przecięte w obrębie lub w okolicy sekwencji rozpoznawanej. Enzymy klasy III po rozpoznaniu miejsca specyficznego dla siebie dokonują cięcia w odległości około 25 pz od rozpoznanej sekwencji. Izoschizomery – enzymy pochodzące z różnych szczepów, ale rozpoznające te same sekwencje DNA. Na przykład sekwencję CCGG rozpoznają enzymy HpaII, HapII, MspI, BsnF. Z kolei enzymy, który rozpoznaje tą sama sekwencję, ale tną ją w różnych miejscach, zwane są neoschizomerami. Izoschizomery to specyficzny podtyp neoschizomerów. Nazewnictwo opiera się na literowych skrótach , w których pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii , a druga i trzecia od gatunku. Następna litera oznacza szczep lub lub typ a kolejne enzymy z danego szczepu lub typu otrzymują litery rzymskie. Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość , która trawi kompletnie 1mg DNA faga l (około 50 kb) w czasie 1 godz. w temperaturze 37°C. Podział restryktaz według rodzaju wytwarzanych końców : tępe końce - nici rozcięte naprzeciwko siebie - wszystkie nukleotydy są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu lepkie końce - 3` lub 5` ssDNA (jednoniciowe) ogony na obu końcach utworzone przez niesymetryczne cięcie , komplementarne do podobnych tworzonych w innych cząsteczkach DNA przez te same enzymy restrykcyjne niezależnie od źródła DNA , co pozwala na ligowanie DNA nawet bardzo różniących się gatunków czyli formowanie chimerycznych molekuł. Modyfikacje końców : tępych , poprzez dołączenie adaptorów (krótkich fragmentów DNA zakończonych z jednej strony na tępo z drugiej na lepko , specyficznie dla danej restryktazy) lub linkerów (krótkich fragmentów DNA zawierających określone miejsce restrykcyjne , zakończonych na tępo) , przed dołączeniem tych ostatnich należy zmetylować genomowy DNA odpowiednią metylazą a po ligacji strawić DNA daną restryktazą uzyskując lepkie końce lepkich , które mają cofniętą nić 3` Można je wypełnić przy pomocy fragmentu Klenowa polimerazy DNA E.coli i kompletu nukleotydów. lepkich , które mają cofniętą nić 5` Można je wytępić obcinając wysunięty jednoniciowy odcinek DNA przy użyciu nukleazy S1 lub polimerazy I E.coli wykorzystując jej aktywność egzonukleolityczną 3`(R)5`. Podział restryktaz według sekwencji rozpoznawanej : czwórkowe , rozpoznają sekwencję DNA złożoną z czterech nukleotydów. Statystycznie w dowolnym DNA takich miejsc jest dużo - co 256 bp. Restryktazy takie mogą strawić DNA na bardzo małe kawałki. szóstkowe , rozpoznają sekwencję DNA złożoną z sześciu nukleotydów. Dowolne miejsce restrykcyjne złożone z sześciu nukleotydów występuje statystycznie co około 4096 bp w DNA , w którym ilości poszczególnych nukleotydów są równe. Proporcje te zmieniają się w zależności od organizmu , dlatego dobór enzymu szóstkowego i warunki należy ustalić eksperymentalnie. ósemkowe , stosowane niezbyt często. Tną DNA bardzo rzadko. RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA Random Amplification Polymorphic DNA ,Polimorfizm losowo wybranych fragmentów DNA.Jest to metoda losowej amplifikacji polimorficznych fragmentów DNA, wykorzystywana w analizie podobieństwa szczepów drobnoustrojów. Jest to rodzaj reakcji PCR, ale segmentów DNA, które są wzmacniane są przypadkowo. W metodzie tej stosuje się jeden losowo dodany starter oligonukleotydowy (10 lub 20 nukleotydowy, o dużej ilości zasad Guaniny i Cytozyny, ok. 50 -60%. W tej metodzie istotny jest fakt iż amplifikowane SA losowo wybrane fragmenty cząsteczki DNA. Z tego samego DNA uzyskujemy różne wyniki. Co charakteryzuje RAPD niską powtarzalnościa dla różnych prób przeprowadzanych dla tego samego fragmentu czasteczki DNA. Istotny aspektem jest też stosowanie do tego badania niskich temperatur annilingu. Dwa pierwsze cykle amplifikacji przeprowadza się w stosunkowo niskiej temperaturze przyłączania startera (Ta = 35-45stC), co umożliwia hybrydyzację startera do sekwencji matrycowych, nie będących w 100% homologicznymi. Kolejne cykle amplifikacji (ok. 30-40) zachodzą przy właściwej dla startera Ta. Sekwencje startera nr 7: 5’CAGCACCCAC3’ Sekwencje startera nr 8 :5’ACGCGCATGT 3’ My do badania użyliśmy dwie polimerazy Taq ,Dream Taq Polimerase. Ponieważ DNA różnych szczepów różni się między sobą, po rozdzieleniu na żelu uzyska się wzór prążków charakterystycznych dla każdego ze szczepów analizowanych. Podobieństwo wzorów uzyskanych w tym teście pozwala na ocenę pokrewieństwa badanych szczepów. Do analizy należy oczyścic produkt z pozostałości czyli białek, startery, składniki wchodzące w skład PCR czy buforu.RAPD służy głównie do wstępnych analiz molekularnych do poznania genomu nieznanego jeszcze gatunku.Jest to stosunkowo nie droga metoda badan. RFLP-PCR- Restriction Fragments Length Polymorphism – polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych. Wykorzystujemy do badań enzymy restrykcyjne- restryktazy. Jest wykorzystywany w technice, w której organizmy mogą być różnicowane poprzez analizę wzorów pochodzących z pocięcia ich DNA. Tą techniką wykrywa się różnice pomiędzy rozmiarami fragmentów DNA pociętych restryktazami. Różnice długości fragmentów DNA powstają w wyniku mutacji, które tworzą lub eliminują miejsca rozpoznawane przez te enzymy. Sekwencje polimorficzne RFLP, które wykrywa się tą metodą, są używane jako znaczniki zarówno w mapach fizycznych jak i genetycznych. Jest to metoda, która pozwala na wykazanie powiązań rodzinnych poprzez porównywanie charakterystycznych wzorów polimorficznych, które są otrzymywae, gdy określone regiony łańcucha DNA są powielane (szczególnie przy użyciu techniki PCR) i pocięte przez określone enzymy restrykcyjne.RFLP jest kluczowym narzędziem w rozpoznawaniu DNA, określaniu obecności różnych alleli u osobników. Mapowanie polimorficznych długości fragmentów restrykcyjnych jest także używane w hodowli roślin po to, by wykazać czy cecha taka jak np. odporność na choroby, została odziedziczona. Podobnie jeżeli polimorfizm zostaje wykryty w pobliżu miejsca gdzie występuje defekt genetyczny, RFLP jest wartościowym znacznikiem pokazującym drogę dziedziczenia tego defektu. W szczególności dana osoba może być zidentyfikowana dzięki tej metodzie przy badaniu pozostałości krwi, włosów i nasienia i w związku z tym RFLP jest szeroko używana w kryminalistyce. Z wyjątkiem bliźniąt jednojajowych metoda ta pozwala na niemalże pewne odróżnianie poszczególnych osób. Jednak nawet w przypadku identycznych bliźniąt pojawiły się doniesienia o możliwości stosowania tej analizy DNA do ich rozróżnienia ANALIZA MARKERÓW MIKROSATELITARNYCH Określenie "marker genetyczny" dotyczy polimorficznych cech jakościowych organizmu, które charakteryzuje proste dziedziczenie mendlowskie oraz które można dokładnie identyfikować metodami analitycznymi. Polimorficznosc oznacza występowanie w tym samym lokus kilku lub kilkunastu różnych sekwencji DNA. Markery genetyczne dzielimy na dwie klasy; klasa I są to geny kodujące cechy jakościowe organizmu, natomiast markerami genetycznymi klasy II są niekodujące sekwencje DNA. Do markerów genetycznych klasy I zalicza się: antygeny erytrocytarne, czyli mówimy tu o układach grupowych krwi, antygenowe determinanty białek surowicy krwi, czyli allotypy immunoglobulin, czy też allotypy lipoprotein, białka polimorficzne występujące w osoczu krwi, erytrocytów, mleka, białka jaj ptaków, antygeny leukocytarne oraz powierzchniowe komórek jądrzastych, czyli antygeny głównego układu zgodności tkankowej (Major Histocompatibility Complex - MHC). Markery genetyczne klasy tej identyfikuje się metodami serologicznymi lub metodami elektroforetycznymi. Natomiast markery genetyczne klasy II identyfikowane są przy użyciu technik analizy molekularnej. Gdzie na pierwszy plan wysunęła się łańcuchowej reakcja polimerazy, (Polymerase Cham Reaction - PCR) wraz z metodami elektroforetycznymi i hybrydyzacji z sondą molekularną. Markerami genetycznymi klasy II, czyli odcinkami niekodującymi są: Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych DNA (Restriction Fragment Length Polymorphisms - RFLP), Minisatelitarny polimorfizm DNA w postaci zmiennej liczby tandemowych powtórzeń (Variable Number of Tandem Repeats - VNTR), Mikrosatelitarny polimorfizm DNA w postaci krótkich tandemowych powtórzeń (Short Tandem Repeats - STR), Polimorfizm losowo amplifikowanych fragmentów DNA (Random Amplifield Polymorphic DNA - RAPD). Mikrosatelitarny polimorfizm DNA Najpopularniejsze są w badaniach odcinki mikrosatelitarnego DNA. Sekwencje mikrosatelitarne są to proste, tandemowe powtórzenia składające się z dwu-, trzy- lub czteronukleotydowych sekwencji zwanych motywami. Najczęściej są to jednak dwunukleotydowe motywy powtórzeń. Często motyw taki może być, regularnie przerywany inną sekwencją. Jako odcinki niekodujące ulokowane są zazwyczaj w intronach jednak czasami znajdujemy je również eksonach w postaci mniejszej liczby powtórzeń. Dzięki dużemu zróżnicowaniu ilości powtórzeń motywu podstawowego jego polimorfizm jest ogromny, co w połączeniu z prostym mendlowskim dziedziczeniem tworzy idealny obiekt badań, co jeszcze potęguje równomierność rozmieszczenia w genomach. Polimorfizm jest tak wielki, że poziom heterozygotyczności w lokus mikrosatelitarnych wynosi przeciętnie 80%. Frekwencję mutacji w takich, loci szacuje się na około 0,001 w lokus na pokolenie. Także i tu pomocna staje się łańcuchowa reakcja polimerazy, (Polymerase Cham Reaction PCR), dzięki znajomości fragmentów flankujących identyfikuje obecne w genomie fragmenty. Po rozdziale na żelu lub po hybrydyzacji ze znana sondą dowiadujemy się, jakiej długości mikrosatelita występuje u badanego osobnika pod względem analizowanego loci. Jeżeli zastosujemy metodę multiplex PCR otrzymamy cały zestaw prążków do przeanalizowania. Tę metodę identyfikacji mikrosatelitów wykorzystuje się często w kontroli pochodzenia zwierząt, gdy chcemy sprawdzić poprawność zapisów do procesu szacowania wartości hodowlanej czy też sprawdzić pochodzenie szczególnie cennych osobników, jak na przykład psy z rodowodem. Przykładowy motyw powtórzeń sekwencji mikrosatelitarnej może mieć postać; CATA Allel 1. CATACATACATACATACATACATACATACATACATACATACATACATA Allel 2. CATACATACATACATACATACATACATACATACATACATACATA Allel 3. CATACATACATACATACATACATACATACATACATACATA itd. Sekwencje mikrosatelitarne są równomiernie rozsianymi elementami w genomie. Dzięki temu znalazły wiele praktycznych zastosowań między innymi w poszukiwaniu genów cech ilościowych QTL oraz przy tworzeniu map genetycznych.
