Zmienność alleli puroindolinowych i ich wpływ na twardość ziarna w

Zmienność alleli puroindolinowych i ich wpływ na twardość
ziarna w wybranych odmianach Triticum aestivum L.
Przyborowski Mateusz1, Gasparis Sebastian1, Kała Maciej1, Orczyk Wacław2, Nadolska-Orczyk Anna1
1Zakład
Genomiki Funkcjonalnej, 2Zakład Inżynierii Genetycznej
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin – Państwowy Instytut Badawczy Radzików, 05-870 Błonie, Polska
Wstęp:
Twardość ziarna pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.) jest czynnikiem wpływającym na wartość przemiałową, wypiekową, wielkość cząstek mąki
i zdolność do absorbcji wody, w związku z tym decyduje o właściwościach technologicznych mąki. Mąka z ziarna miękkiego wykorzystywana jest do
wyrobu ciast i ciastek. Mąka z twardych odmian pszenicy przeznaczana jest do produkcji pieczywa. Twardość ziarna jest determinowana przez
zmienność w obrębie dwóch genów puroindolowych Pina-D1 i Pinb-D1 znajdujących się na krótkim ranieniu chromosomu 5D. Allele typu dzikiego,
Pina-D1a i Pinb-D1a (Rys. 1) warunkują występowanie ziarna miękkiego. Mutacja w jednym lub obydwu genach Pin powoduje zwiększenie twardości
ziarna. Do tej pory opisano 11 alleli genu Pina oraz 26 alleli genu Pinb. Ze względu na twardość ziarna pszenicę możemy podzielić na trzy grupy:
pszenice miękkie (SKCS <40 ), średnio twarde (SKCS 40 - 60) oraz twarde (SKCS >60).
Materiały i metody:
Przebadano 120 odmian pszenicy zwyczajnej dostarczonych przez Danko Hodowla
Roślin Sp. z o.o., Hodowla Roślin Smolice Sp. z o.o. oraz Hodowla Roślin Strzelce
Sp. z. o. o.
Z 5 dniowych siewek pszenicy ekstrahowano DNA zmodyfikowaną metodą CTAB
[1]. Sekwencje kodujące genów Pin zostały zamplifikowane w reakcji PCR,
a następnie oczyszczone i zsekwencjonowane. Do porównania sekwencji użyto
programu MegAlgin (DNASTAR). W celu potwierdzenia poprawności
sekwencjonowania wykonano analizę restrykcyjną, a następnie przeprowadzono
rozdział elektroforetyczny w żelu agarozowym (Rys. 2). Twardość ziarniaków została
oznaczona metodą SKCS (ang. Single Kernel Characterization System).
Celem badania była analiza częstości występowania mutacji w obu genach Pin
oraz ich wpływu na twardość ziarna pszenicy w odmianach dostarczonych przez
polskie hodowle roślin.
Wyniki:
Wszystkie przebadane odmiany posiadały allel typu dzikiego – Pina-D1a.
Zmienność alleli miała miejsce w przypadku genu Pinb. W 19 (16%) odmianach
występował allel typu dzikiego (Pinb-D1a). W 63 (53%) odmianach występowała
mutacja Pinb-D1b. Allel Pinb-D1c posiadło 15 (13%) odmian. Mutacja Pinb-D1d
została wykryta u 19 (16%) odmian. Natomiast 4 odmiany przebadane były
heterozygotami względem alleli genu Pinb (Rys. 3). Po przeprowadzeniu pomiarów
SKCS 19 odmian zakwalifikowano jako odmiany miękkie, 47 jako odmiany średnio
twarde oraz 54 jako odmiany twarde. Zestawienie liczebności odmian o miękkim,
średnim i twardym ziarnie w stosunku do występującego allelu genu Pinb
przedstawiono na Rys. 4. Wyniki pomiarów twardości w stosunku do allelu Pinb
zestawiono na wykresie (Rys. 5). W zestawieniach nie brano pod uwagę zmienności
w obrębie genu Pina, ponieważ wszystkie badane odmiany posiadały allel typu
dzikiego.
35
32
30
M
Ś
T
28
25
Rysunek 1. Porównanie sekwencji nukleotydowych występujących alleli genu Pinb w badanych odmianach.
Sekwencje zostały ograniczone do miejsc w których występują mutację punktowe.
20
15
MbiI
PvuII
MnlI
13
10
8
8
9
6
5
4
3
3
2
0
0
Pinb-D1a
M
A
B
C
D
H
P
M
A
B
C
D
H
P
M
A
B
C
D
H
P
M
Rysunek 2. Elektroforeza zamplifikowanych fragmentów zawierających gen Pinb po trawieniu enzymami
restrykcyjnymi. M- marker molekularny 100 bp plus; A – Pinb-D1a; B – Pinb-D1b; C – Pinb-D1c; D – Pinb-D1d;
H – przykład heterozygoty względem genu Pinb; P – produkt PCR.
Pinb-D1b
Pinb-D1c
Pinb-D1d
Rysunek 4. Zestawienie liczebności odmian o miękkim (M), średnim (Ś) i twardym (T) ziarnie w grupach
zawierających określony allel genu Pinb.
80
70
60
60%
53%
50
50%
40
40%
30
30%
20%
20
16%
10
16%
13%
10%
0
Pinb-D1a
3%
0%
Pinb-D1a
Pinb-D1b
Pinb-D1c
Rysunek 3. Udział procentowy poszczególnych alleli genu Pinb.
Pinb-D1d
Inne
Pinb-D1b
Pinb-D1c
Rysunek 5. Zestawienie pomiarów twardości (SKCS) w stosunku do allelu Pinb.
skrajne.
Pinb-D1d
– wartości średnie; – wartości
Podsumowanie:
• Zmienność genetyczna w obrębie Pina nie występuje, natomiast w obrębie Pinb jest ograniczona jedynie do 4 alleli z bardzo dużą liczebnością Pinb-D1b.
• Wykryto trzy rodzaje mutacji punktowych: Pinb-D1b - tranzycja guaniny w pozycji 233 na adeninę, Pinb-D1c – tranzycja tyminy w pozycji 266 na cytozynę oraz PinbD1d - transwersja tyminy w pozycji 217 na adeninę.
• Allele Pin nie są jedynym czynnikiem wpływającym na twardość ziarna pszenicy zwyczajnej ponieważ w niektórych odmianach posiadających allele typu dzikiego
(Pina-D1a i Pinb-D1a) pomiary SKCS wskazywały na odmianę twardą. I analogicznie, pojedyncze odmiany z mutacją punktową w allelu Pinb można by było zaliczyć
do odmian o ziarnie typu miękkiego.
• W większości przypadków obecność dowolnej mutacji w genie Pin powodowała zwiększenie twardości ziarna.
Literatura:
[`] Murray, M. G., and W. Fm Thompson. "Rapid isolation of high molecular weight plant DNA." Nucleic acids research 8.19 (1980): 4321-4326.
Badania finansowane przez Ministerstwo Rolnictwa i Rozwoju Wsi, grant PW zad. 2.1