Klonowanie molekularne Kurs doskonalący

Klonowanie molekularne
Kurs doskonalący
Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP
Etapy klonowania molekularnego
1. Wybór wektora i organizmu gospodarza
Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane czy nie]? Do
innych celów, np. do dalszego klonowania? Do produkcji białka
rekombinowanego? Do transfekcji hodowli komórkowych? Czy białko fuzyjne?).
2. Przygotowanie wektora
Miejsce klonowania, restrykcja, żel, oczyszczenie.
3. Przygotowanie wstawki
Co chcę sklonować? Jak duże? Jakie musi mieć końce (przygotowanie
starterów)? PCR lub reverse transcription-PCR, żel, oczyszczenie, restrykcja,
oczyszczenie.
4. Ligacja.
5. Transformacja (selekcja biało-niebieska, jeśli możliwe).
6. Hodowla bakterii.
7. Oczyszczanie DNA z bakterii (mini-, midi-, maxi-prep) LUB białka z bakterii
albo hodowli komórkowej.
8. Analiza restrykcyjna (dotyczy DNA).
Wybór wektora
T
A
T
A
Do klonowania produktów PCR do wektorów typu A-T – koniecznie użyć polimerazy
Taq lub innej polimerazy, która na końcach produktu dodaje bez matrycy jeden
deoksyrybonukleotyd, zwykle A!!!!. Lub dodać takie końce po zakończeniu PCR
Wykonanego z polimerazą dającą tępe końce – poprzez dodatkową inkubację
z polimerazą Taq.
Wybór wektora
Ekspresja białek rekombinowanych
Zawiera silny promotor, pod który klonujemy sekwencję kodującą
białko. Wybór promotora zależy od rodzaju komórek, w których
będziemy robić ekspresję (promotor prokariotyczny – bakterie lub
wirusowy/eukariotyczny – komórki eukariontów).
Wybór wektora
Ekspresja białek rekombinowanych – fuzyjnych
(nowe białko składa się z dwóch wyjściowych białek lub ich części)
Należy tak wklonować własny gen, by nie zmieniła się ramka
odczytu, czyli by po kodonach kodujących białko fluorescencyjne
(lub jakiekolwiek inne białko) szły kodony „naszego białka”.
Wybór wektora
Ekspresja białek rekombinowanych – fuzyjnych
(nowe białko składa się z dwóch wyjściowych białek lub ich części)
Należy tak wklonować własny gen, by nie zmieniła się ramka
odczytu, czyli by po kodonach kodujących „nasze białko”, szły kodony
białka fluorescencyjnego (lub jakiekolwiek innego białka).
Wybór wektora
Badanie aktywności promotorów
Wektor zawiera gen reporterowy, ale trzeba wklonować badany
promotor lub jego fragment.
Przygotowanie wektora
Multiple cloning site (miejsce klonowania wstawki)
W zależności od celu klonowania, wybieramy enzymy, którymi
przetniemy wektor. Końce wektora i wstawki muszą być
kompatybilne (odwrotnie komplementarne). Są to najczęściej takie
enzymy, którymi przecięte będą również końce wstawki!!! Trzeba
pamiętać o orientacji wstawki: czasami nie ma znaczenia, w którą
stronę będzie wklonowana, ale jeśli mamy produkować białko, to
tylko jedna orientacja jest prawidłowa.
BamHI
BamHI
BamHI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
Restrykcja (trawienie) DNA
!
Restrykcja (trawienie) DNA
Powszechnie używane enzymy restrykcyjne rozpoznają w DNA
konkretne sekwencje o określonej długości. Niektóre
rozpoznają sekwencje krótkie (4 pary zasad, np. GTAC),
niektóre (najczęściej używane) – 6 (np. GAATTC), inne 8 lub
więcej. Miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne
najczęściej tworzą palindromy (identyczne sekwencje na
obydwu niciach czytane od 5’ do 3’, mają „oś symetrii” z
lustrzanym odbiciem).
„lepkie” końce
„tępe” końce
Restrykcja (trawienie) DNA
Czasami trzeba „stępić” końce, czyli po restrykcji która zostawia
lepkie końce produkt poddaje się działaniu enzymu Klenowa,
który „dodaje” do tego, co wystaje.
Żel i oczyszczanie DNA z żelu
Elektroforeza i wycięcie
odpowiedniego
prążka z żelu
Przygotowanie wstawki
1. Wycięcie z innego wektora/DNA.
2. Namnożenie w reakcji PCR z matrycy DNA lub z cDNA
(matrycą jest RNA poddane procesowi odwrotnej transkrypcji).
odwrotna transkrypcja
PCR
PCR
Amplifikacja ekspotencjalna może nastąpić tylko w początkowych
etapach PCR, kiedy występuje nadmiar starterów, dNTP, itd.
W następnych fazach namnażania proporcje DNA – odczynniki
zmieniają się, a reakcja nie jest już tak wydajna. Detekcja DNA
na żelu możliwa jest najczęściej wtedy, gdy reakcja wejdzie
w fazę plateau.
PCR
PCR może być dwufazowy
(denaturacja + hybrydyzacja i wydłużanie razem)
Projektowanie starterów
1. Można użyć darmowego programu komputerowego.
2. Można zaprojektować samemu:
• Minimalna długość startera 17 (raczej więcej),
• Para starterów musi mieć zbliżone temperatury topnienia Tm;
gruba metoda liczenia Tm: na każdą A lub T – po 2oC, na każdą
C lub G – po 4oC,
• Na końcu 3’ powinny być (ale nie muszą) G lub C,
• Zawartość G i C powinna wynosić 40-50% (ale nie zawsze jest to
możliwe – nie jest kluczowe),
• Startery mogą być zaprojektowane tak, by wprowadzić do DNA
miejsce restrykcyjne!!! (tak zwykle przygotowuje się startery
przed późniejszym klonowaniem do wektora!!!) albo mutację.
Przygotowanie wstawki: restrykcja produktu PCR
Należy pamiętać, że enzymy restrykcyjne niewydajnie tną sekwencje
na końcach DNA!!! Konieczne jest dodawanie „ogonków”
na końcach 5’ starterów.
x
GCGCGCnnn….nnnCTCGAG
x
TAGCTGCGCGCnnn….nnnCTCGAGCAATG
Następnie elektroforeza i oczyszczanie z żelu!!!
Ligacja DNA
Ligacja DNA
Zwykle wektor i wstawkę tniemy tymi samymi enzymami. Można to też ciąć
używając enzymów pozostawiających komplementarne końce, ale po ligacji
miejsce restrykcyjne jest stracone (bo powstaje sekwencja inna od wyjściowych).
Można też „stępiać” końce – również utrata miejsca restrykcji, ale zwykle nie jest
to już ważne.
Transformacja bakterii
biało-niebieska selekcja
pozytywnych transformantów
Oczyszczanie DNA z bakterii
Analiza restrykcyjna
X
Enzym i enzym dadzą dwa prążki.
Enzym da trzy prążki.
O ściśle określonej wielkości!!! Konieczne jest puszczenie również
markera wielkości by bez wątpliwości określić wielkość prążków
po restrykcji.
Jeśli ma być produkowane białko rekombinowane, albo
wprowadzono celowo mutację, to konieczne jest sekwencjonowanie!!!