Ćwiczenie III

Ćwiczenie 5
Analiza restrykcyjna in silico
Strona główna NEBCUTTER 2.0
http://tools.neb.com/NEBcutter2/
1. Pod adresem http://serwisy.umcs.lublin.pl/andrzej.mazur w folderze Podstawy
Bioinformatyki/sekwencje znajduje się plik (6000.txt) - skopiuj sekwencję DNA, którą zawiera.
2. Wklej zawartą w nim sekwencję w okienko główne i wybierz z pola „enzymes to use” „all
commercially available specifities” i naciśnij „submit”.
3. Otrzymasz mapę restryktycjną sekwencji z zaznaczonymi ORF większymi niż 100 aa.
4. Sprawdź podobieństwo ORF nr 3 (najdłuższej z wykrytych), kliknij na ramkę otworzy się w nowym
okienku, pod sekwencją uruchom narzędzie BLAST
5. Obejrzyj wynik dopasowania sekwencji aa za pomocą narzędzia BLAST, wybierając najlepsze
dopasowanie.
Problem do rozwiązania:
Chcesz zbadać aktywność promotora genu, którego podobieństwo ustaliłeś powyżej, korzystając z wektora z
bezpromotorowym genem reporterowym np. lacZ (dla uproszczenia przyjmijmy że będzie to jedna z wersji
wektora pUC).
Zadanie będzie polegało do wybraniu odpowiednich miejsc restrykcyjnych, w które będzie można wstawić
fragment obejmujący promotor badanego genu w taki sposób by kierunek jego transkrypcji był zgodny z
kierunkiem transkrypcji genu lacZ wektora pUC.
Rozwiązanie:
Najpierw należy ustalić przypuszczalną lokalizację promotora ORF3
1. Uruchom stronę Promoter Prediction http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html
2. wklej ze schowka sekwencję 6000 pz, wybierz opcje poszukiwania promotorów u bakterii, na jednej
nici DNA, przy współczynniku podobieństwa > 0.8.
3. Na podstawie uzyskanych wyników zaplanuj doświadczenie ze sklonowaniem odpowiedniego
fragmentu DNA obejmującego hipotetyczny promotor ORF3.
Jak i do której wersji wektora pUC sklonować promotor ORF3?
Należy znaleźć fragment DNA obejmujący region powyżej ORF3 i początek ORF3, który dałoby się
sklonować do wektora typu pUC, używając dwóch różnych enzymów restrykcyjnych generujących lepkie
końce
1. Jakie miejsca restrykcyjne do klonowania dostępne są w wektorze typu pUC?
2. Z otwartego okna NEB cutter wróć do strony głównej i wbierz „new DNA”, wpolu „Standard
sequences” wybierz– pUC18, a następnie„all commercially available specifities” i wciśnij
„submit” otrzymasz mapę restrykcyjną wektora
3. W polu „main options” wybierz "view sequence” (otworzy się w nowym oknie) i odczytaj miejsca
restrykcyjneg MCS pUC18: “HindIII-SphI-PstI-SalI-XbaI-BamHI-SmaI-KpnI-SacI-EcoRI”
4. Nie zamykając okna z pUC18, wróć do głównej strony programu i w polu „earlier projects”
wybierz „no name” (zawiera mapę sekwencji 6000 pz), a następnie wybierz „custom digest”a z
menu „all enzymes” wybierz enzymy restrykcyjne pUC18 MCS i naciśnij „digest” (aby obejrzeć
listę rozpoznawanych miejsc wybieramy „enzymes and sites” z okna „list”. Aby obejrzeć
podsumowanie dotyczące powstających fragmentów wybieramy „fragments” z okna „list”)
5. na mapie wyszukujemy najkrótszy możliwy fragment wycinany przez dwa różne enzymy
(oczywiście wewnątrz tego fragmentu nie może być innych miejsc tego samego rodzaju) –klikając
na nazwę enzymu wyświetlimy podsumowanie jego właściwości – sprawdzamy czy enzym daje po
trawieniu lepkie końce; np. BamHI - SacI
6. wybieramy polecenie „new custom digest” i zaznaczamy enzymy BamHI i SacI oraz polecenie
„digest”
7. wyświetli się nowa mapa restrykcyjna, na której ilość miejsc została zawężone tylko do 2
interesujących nas enzymów
8. możemy obejrzeć jak będzie wyglądać rozdział produktów trawienia tymi dwoma enzymami
wybierając polecenie „view gel” – wyświetli się „wirtualny żel agorozowy” (program umożliwia
również wybór stężenia żelu i typ markera wielkości) - typ i wielkość fragmentu podświetlają się po
„najechaniu” nań wskaźnikiem
9. upewnij się czy da sie wyizolować taki fragment DNA, jeśli nie, powtórz analizę z użyciem innych
enzymów np. BamHI-PstI (fragment długość 1100pz)