KREW I HEMOPOEZA

Krew jest tkanką płynną,
ponieważ płynna jest
istota międzykomórkowa
(osocze)
KREW
I
HEMOPOEZA
Komórki (erytrocyty i
leukocyty) i fragmenty
komórek (płytki krwi) to
elementy morfotyczne
Funkcje krwi:
• transport tlenu i substancji odżywczych do komórek
• transport CO2 i metabolitów wydalanych przez komórki
• transport komórek i czynników uczestniczących w procesach
obronnych
• transport substancji regulacyjnych (np. hormonów) do komórek
• udział w utrzymywaniu homeostazy ustrojowej (równowaga
wodno-jonowa, buforowanie płynów ustrojowych, termoregulacja)
• krzepnięcie
Skład osocza krwi
Wskaźnik
hematokrytu
elementy morfotyczne
osocze
Woda
erytrocyty
Białka: albuminy, globuliny α, β, γ (immunoglobuliny), fibrynogen
7 – 8%
Inne substancje:
1 – 2%
jony
leukocyty i płytki
Hct =
91 – 92%
objętość elementów morfotycznych
(Na+,
K+ ,
Ca++,
Mg++,
Cl-,
HCO3
-,
PO4-3,
SO4-2 )
produkty przemiany materii (mocznik, kwas moczowy,
kreatynina, sole amonowe)
objętość krwi pełnej
substancje odżywcze (glukoza, aminokwasy, lipidy)
mężczyźni
kobiety
gazy (tlen, dwutlenek węgla, azot)
0.4 – 0.5
0.35 – 0.45
substancje regulacyjne (hormony, enzymy, witaminy)
Na wartość wskaźnika hematokrytu największy wpływ ma
ilość krwinek czerwonych
Rozmaz krwi (barwienie
Romanowsky’ego)
Surowica: osocze pozbawione fibrynogenu i czynników krzepnięcia
Elementy morfotyczne krwi
Erytrocyty (krwinki czerwone)
4 500 000 - 5 000 000 /mm3
Leukocyty (krwinki białe)
5 000 - 8 000 /mm3
Trombocyty (płytki krwi)
200 000 - 300 000 /mm3
granulocyty
agranulocyty
Neutrofile
55 - 65 %
(obojętnochłonne)
Eozynofile
2 - 4%
(kwasochłonne)
Bazofile
(zasadochłonne)
0.5 - 1 %
Limfocyty
25 - 35 %
Monocyty
4 - 8%
1
Erytrocyty
(krwinki czerwone)
• średnica 7,5 µm
• brak jądra
• brak organelli
• hemoglobina
• gruby glikokaliks
Spośród wszystkich elementów morfotycznych, tylko erytrocyty
i płytki krwi pełnią swoje funkcje w obrębie łożyska naczyniowego leukocyty przewędrowują przez ściany naczyń do tkanek (głównie
tkanki łącznej), które są terenem ich działania
Erytrocyty utrzymują kształt dzięki obecności
wewnętrznego szkieletu błonowego
retikulocyt (1-2 %)
Cukrowce glikokaliksu erytrocytów są
antygenami układu AB0
Białka transportowe błony:
• białko III szczytu – transporter anionowy (Cl- / HCO3-)
• pompa sodowo-potasowa
Trzy parametry morfologii krwi określają
kondycję układu czerwonokrwinkowego:
1.
2.
3.
całkowita zawartość erytrocytów /mm 3
wskaźnik hematokrytu
zawartość hemoglobiny
norma:
12-16 g/dl u kobiet
14-18 g/dl u mężczyzn
Zmniejszenie liczby krwinek czerwonych bądź
zmniejszenie zawartości hemoglobiny nosi nazwę
niedokrwistości (anemia)
Przykład:
anemia mikrocytarna
– z niedoboru żelaza
prawidłowy
anemia
LEUKOCYTY
GRANULOCYTY
AGRANULOCYTY
(neutrofile, eozynofile, bazofile)
(limfocyty, monocyty)
• zawierają dużą ilość
ziarn azurochłonnych *
i swoistych
• zawierają niewielką ilość
ziarn azurochłonnych
• jądro segmentowane,
• nie dzielą się
• jądro niesegmentowane
• mogą się dzielić i
różnicować,
• krótki czas życia (dni)
• długi czas życia
(tygodnie – lata)
* szczególna forma
pęcherzyków hydrolazowych
2
Neutrofile fagocytują i zabijają bakterie
Ziarna neutrofila i ich zawartość (wybrane składniki)
Ziarna azurochłonne
• kwaśne hydrolazy
• mieloperoksydaza
• lizozym
• defenzyny
• średnica ok. 12 µm
• segmentowane jądro
• ubogie organelle
• bardzo liczne
ziarnistości
Ziarna swoiste
• lizozym
• laktoferryna
• kolagenaza
• fosfolipaza
Zdolne do:
• ruchu pełzakowatego
• fagocytozy
• zabijania bakterii
• produkcji mediatorów
regulujących reakcje
immunologiczne
Ziarna gelatynazowe
• gelatynaza
• arginaza
• lizozym
Neutrofile są głównymi komórkami ostrego stanu zapalnego
Ruch pełzakowaty
Pod wpływem czynników chemotaktycznych produkowanych przez
bakterie i/lub komórki uczestniczące w procesach obronnych
neutrofile (i inne leukocyty) przechodzą przez ścianę naczynia,
a następnie migrują do źródła czynników chemotaktycznych.
W przechodzeniu przez śródbłonek istotną rolę odgrywają cząsteczki
adhezyjne błony komórkowej leukocyta i komórki śródbłonkowej.
Fagocytoza:
• głównie bakterii
• szczególnie intensywna
po opłaszczeniu bakterii
przeciwciałami i/lub
składnikami dopełniacza
(mechanizm receptorowy)
Etapy migracji leukocytów przez ścianę naczynia
Zabijanie i trawienie bakterii
• „wybuch tlenowy”
• fuzja ziarn z fagosomem
• zabicie bakterii
• trawienie bakterii
System zabijania bakterii:
Czynniki tlenozależne
• NADPH-oksydaza:
tworzenienie O2¯ i H 2O2
• mieloperoksydaza: H2O2 + jony
chlorkowe i jodkowe = HOCl, HOI
(chlorowanie i jodowanie)
• jony ponadtlenkowe
i rodniki hydroksylowe
(utlenianie, hydroksylacja)
Czynniki tlenoniezależne
• lizozym - trawi ściany kom.
bakterii
• laktoferryna (wiąże Fe, hamuje
metabolizm bakterii)
• defenzyny – ‘dziurawią’ błony
kom. bakterii
3
Eozynofile zabijają larwy pasożytów i współpracują
z mastocytami w reakcjach alergicznych
W trakcie zabijania i trawienia bakterii neutrofile giną.
Jeżeli proces zapalny jest bardzo intensywny, szczątki
neutrofili i bakterii tworzą wydzielinę ropną
Podwyższona liczba neutrofili w krwi obwodowej
najczęściej świadczy o toczącym się procesie zapalnym
wywołanym zakażeniem bakteryjnym
• średnica ok. 15 µm
• dwusegmentowe jądro
• ubogie organelle
• kwasochłonne ziarna
swoiste, zawierające:
- MBP (główne białko zasadowe)
- ECP (białko kationowe eozynofili)
- EDN (eozynofilową neurotoksynę)
- eozynofilową peroksydazę
- enzymy hydrolityczne
Funkcje eozynofili
• zabijanie pasożytów (poprzez wydzielanie zawartości ziarn)
• współpraca z mastocytami i bazofilami, neutralizacja czynników
prozapalnych (w tym w alergii)
• działanie immunoregulacyjne
• słaba zdolność do fagocytozy
• słabe własności bakteriobójcze i guzobójcze
Bazofile są podobne morfologicznie i czynnościowo
do mastocytów, ale stanowią odrębną populację komórek
Podwyższona liczba eozynofili (eozynofilia) w krwi
obwodowej jest wskaźnikiem chorób pasożytniczych
i alergicznych
Limfocyty odpowiadają za reakcje
immunologiczne
• średnica 8 i 12-15 µm („małe” i „duże”)
• duże kuliste jądro
• ubogie organelle
• średnica ok. 10 µm
• jądro segmentowe lub nie
• zasadochłonne ziarna
swoiste zawierające:
- histaminę
- siarczan chondroityny
- czynnik chemotaktyczny
dla eozynofili
• receptory dla IgE
Limfocyty B – humoralna odpowiedź immunologiczna
Limfocyty T – komórkowa odpowiedź immunologiczna
Limfocyty NK – zabijanie „antygenowo nieprawidłowych” komórek
Wygląd dużych limfocytów mają również krążące w krwi komórki macierzyste
4
Monocyty migrują do tkanek, gdzie przekształcają się
w makrofagi lub komórki prezentujące antygen
Płytki krwi inicjują proces krzepnięcia krwi
• średnica 2-4 µm
• brak jądra
• strefa obwodowa (hialomer)
• średnica 15-20 µm
• nerkowate jądro
• dobrze rozwinięte
organelle
• ziarna azurochłonne
• zdolność do fagocytozy
- mikrotubule
- filamenty aktynowe
- otwarty system kanalikowy
(wpuklenia błony kom.)
- zamknięty system kanalikowy
(magazynuje jony Ca2+ )
• strefa centralna (granulomer)
- organelle i ziarna
- glikogen
• gruby glikokaliks
Płytki krwi są bezjądrzastymi fragmentami większych komórek prekursorowych
Twory pęcherzykowe obecne w granulomerze:
Nazwa
Zawartość
ziarna α
czynniki krzepnięcia,
tromboplastyna, trombospondyna,
płytkowy czynnik wzrostu
ziarna δ
(ciałka gęste)
ATP, ADP, Ca2+, histamina,
serotonina, pirofosfataza
pęcherzyki hydrolazowe
(ziarna λ)
enzymy hydrolityczne
peroksysomy
enzymy peroksysomowe
Płytki agregują w miejscu uszkodzenia ściany naczyniowej
i wydzielają substancje uruchamiające proces krzepnięcia krwi
• kontakt z uszkodzonym
miejscem
• przyleganie
• uwalnianie zawartości
ziarn
• agregacja
• utworzenie „czopu
płytkowego”
Szpik krwiotwórczy miejsce hemopoezy
Substancje uwalniane
z płytek oraz inne czynniki
krzepnięcia (osoczowe,
tkankowe) doprowadzają
do wytworzenia skrzepu
5
Przedział naczyniowy
Cienkościenne naczynia zatokowe
(odmiana naczyń włosowatych):
• śródbłonek
• brak blaszki podstawnej
• komórki przydankowe (odmiana
perycytów)
Komórki śródbłonkowe
budujące ścianę naczynia
tworzą doraźnie tzw. pory
migracyjne dla komórek
szpikowych przechodzących
do krwi
Przedziały:
• naczyniowy
• hemopoetyczny
• rusztowanie z tkanki łącznej
siateczkowatej: włókna srebrochłonne
i komórki zrębowe (fibroblasty,
makrofagi, mezenchymatyczne kom.
macierzyste)
• w jego obrębie grupy dojrzewających
komórek krwi i nieliczne adipocyty
jednopęcherzykowe
Komórki przydankowe
regulują ten proces poprzez
„odsłanianie” fragmentów
ściany naczynia
Wszystkie komórki
krwi wywodzą się
z jednej komórki
macierzystej
Przedział
hemopoetyczny
Komórki o podobnej
morfologii
Rozmaz krwi
Rozmaz szpiku
Komórki różniące się morfologicznie
Mielogram:
• linia rozwojowa
erytrocytów: 20%
• linia rozwojowa
granulocytów: 65%
• pozostałe linie: 15%
6
Powstawanie erytrocytów (linia erytropoezy)
Powstawanie granulocytów
(linia granulopoezy)
rybosomy
mieloblast
proerytroblast
retikulocyty
erytroblast
zasadochłonny
promielocyt
(wytwarzanie ziarn azurochłonnych)
erytroblast
polichromatofilny
(wielobarwliwy)
mielocyty
(wytwarzanie
ziarn swoistych)
- erytrocyty zawierające
skupiska rybosomów;
wcześniejsza utrata
jądra i przejście do
krążącej krwi
erytroblast
kwasochłonny
metamielocyty
(wytwarzanie ziarn
gelatynazowych
w linii neutrofili)
- specjalne barwienia
hemoglobina
Czynnik pobudzający – erytropoetyna (produkowana głównie w nerkach)
Powstawanie płytek krwi (linia trombopoezy)
megakarioblast
(endomitozy)
“młody” neutrofil
(forma pałeczkowata)
Megakariocyt
• duży (do 100 µm)
• DNA do 64N
• płatowate jądro
• obszary:
- okołojądrowy (organelle)
- pośredni (błony demarkacyjne)
- zewnętrzny (mikrofilamenty)
promegakariocyt
(endomitozy)
megakariocyt
uwalnianie płytek krwi
błony demarkacyjne (głębokie
wpuklenia błony komórkowej)
Struktury histologiczne są optycznie obiektami fazowymi
– nie zmieniają ani amplitudy fali światła (obiekty nie są
ciemniejsze ani jaśniejsze), ani jej długości (barwa), a
jedynie powodują przesunięcie fazy …
Techniki histologiczne –
barwienie
… oko ludzkie nie jest w stanie zarejestrować tej zmiany
– stąd konieczność uwidocznienia struktur.
W technikach mikroskopowych jest to realizowane przez
barwienie preparatów.
Stosując różne techniki barwienia jesteśmy w stanie
uwidocznić konkretne składniki komórkowe lub
tkankowe
7
Cząsteczka barwnika posiada:
grupę chwytną
grupę barwną
Większość metod barwienia oparta jest na chemicznym
wiązaniu cząsteczki barwnika ze składnikami tkankowymi.
Łączenie barwnika z substratem tkankowym najczęściej oparte
jest na tworzeniu różnorodnych oddziaływań chemicznych:
- oddziaływania elektrostatyczne
- wiązania kowalencyjne
- oddziaływania van der Waalsa
- wiązania wodorowe
Czasami występuje konieczność wcześniejszej modyfikacji
chemicznej tkanek, co dopiero umożliwia wiązanie cząsteczki
barwnika – taki proces nazywa się bejcowaniem
W zależności od zdolności wiązania barwnika z określonymi
strukturami mówimy o swoistości barwienia. Barwienia
histologiczne (strukturalne) cechują się raczej niewielką
swoistością.
błękit alcjanowy
Rodzaje hematoksylin
Wybrane metody barwienia
– najczęściej stosowane: hemalauny
– konieczność utlenienia hematoksyliny
– barwienie progresywne / regresywne
Barwienie rutynowe – hematoksylina eozyna
Barwienia trójbarwne (np. AZAN)
Impregnacja solami srebra
– np. włókna srebrochłonne
8
Barwienia rozmazów i wymazów
Giemsa / May Grünwald
Przygotowanie skrawków do barwienia HE:
- odparafinowanie (ksylen)
- nawodnienie (alkohol etylowy)
- barwienie w hematoksylinie
- płukanie i utlenienie (woda bieżąca)
- barwienie w eozynie
- płukanie (krótko)
Papanicolau
Zamykanie:
- odwadnianie (alkohol)
- prześwietlanie (ksylen)
- zamykanie w żywicy
Barwienie (barwniki klasyczne, np.
hematoksylina i eozyna) – barwnik
wiąże się ze strukturami zawierającymi
wiele różnych związków chemicznych –
niska swoistość barwienia
Wybarwienie struktur zawierających
tylko określony rodzaj substancji
chemicznej – wysoka swoistość
barwienia
Metody o wysokiej swoistości pozwalają
na uwidocznienie w preparacie
mikroskopowym (in situ) konkretnych
związków chemicznych i umożliwiają
określenie ich lokalizacji w strukturach
komórkowych i tkankowych
REAKCJA HISTOCHEMICZNA:
substancja wykrywana (w preparacie mikroskopowym)
+ swoisty(e) substrat(y) – w roztworze, zanurzamy w nim
preparat
= produkt
- widoczny (barwny, fluoryzujący, lub elektronowo gęsty)
- nierozpuszczalny (gromadzący się w miejscu powstania)
Reakcje histochemii
klasycznej wykrywają:
• różne klasy białek
• różne klasy cukrowców
• różne klasy lipidów
• DNA i RNA
• niektóre substancje
niskocząsteczkowe
METODY O WYSOKIEJ
SWOISTOŚCI
•
•
•
•
•
•
•
histochemia klasyczna
histochemia enzymów
immunohistochemia
histochemia lektyn
histochemia powinowactwa
hybrydocytochemia
znakowanie białkami fluoryzującymi
autoradiografia
Typy reakcji histochemicznych
• jednoetapowe
• wieloetapowe
Mechanizmy reakcji histochemicznych:
• reakcja chemiczna z tworzeniem nowych związków
(produktów)
• wiązanie barwników na drodze oddziaływań
elektrostatycznych
• wiązanie barwników na drodze oddziaływań
stereospecyficznych
(barwnik i wykrywana w preparacie substancja „pasują”
do siebie przestrzennie i wytwarzają wiązania)
• wiązanie barwników na drodze ich selektywnej
rozpuszczalności
Przygotowanie materiału:
• utrwalanie: „celowane”, niekiedy materiał nieutrwalony
• zamrożenie lub zatopienie w parafinie
9
Wykrywanie białek
Reakcje uwidaczniające
określone aminokwasy.
Obecnie rzadko stosowane,
zastąpione przez znacznie
bardziej swoiste metody
immunocytochemiczne
Wykrywanie cukrowców
Reakcja P.A.S.:
(1) Utlenianie w kwasie
nadjodowym
(2) Odczynnik Schiffa
Reakcja P.A.S. wykrywa
polisacharydy obojętne
Glikogen w komórkach
wątrobowych
Metachromazja
Barwienie
błękitem alcjanowym:
wykrywa polisacharydy
kwaśne
Śluz w komórkach
kubkowych
Struktury barwią się na kolor
odmienny niż kolor barwnika
w roztworze
Cząsteczki barwnika wiążą się
z regularnie i gęsto rozmieszczonymi
grupami anionowymi i tworzą polimer
Barwienie błękitem toluidynowym
- mastocyty
monomer
niebieski
polimer
fioletowy
Chrząstka szklista
Wykrywanie lipidów
• barwniki niepolarne (rozpuszczalne w lipidach, ale nierozpuszczalne
w wodzie), np. Sudan III, czerwień oleista, wybarwiają wszystkie lipidy
Metachromazja wykrywa
polisacharydy kwaśne
Wykrywanie
kwasów nukleinowych
Reakcja Feulgena (DNA):
1. Kontrolowana hydroliza
w HCl
2. Odczynnik Schiffa
Komórki tkanki tłuszczowej żółtej barwione Sudanem III
10
Metoda Bracheta: bawienie
zielenią metylową (barwi DNA)
i pyroniną (barwi RNA)
Wykrywanie DNA barwnikami
fluorescencynymi
• DAPI
• jodek propidyny
• bromek etydyny
• Hoechst 33342, 33258
Błękit pruski – żelazo
Fluorescencyjne wykrywanie amin biogennych
(metoda FIF)
1. Liofilizacja
2. Utrwalanie w parach
formaldehydu
3. Zatopienie w parafinie
Wykrywa: adrenalinę,
noradrenalinę, dopaminę,
serotoninę
Czerwień Kongo – złogi amyloidu
Histochemiczne wykrywanie enzymów
(barwienie histoenzymatyczne)
(wykrywana jest aktywność danego enzymu)
Wykrywany enzym (w preparacie)
+ swoisty(e) substrat(y) - w roztworze
+ czynniki optymalizujące reakcję
(koenzymy, jony, pH) – w roztworze
= produkt (widoczny, nierozpuszczalny)
• Utrwalanie lub zatapianie materiału może
zahamować aktywność badanego enzymu.
• Reakcję najczęściej przeprowadza się
na skrawkach mrożeniowych.
• Niekiedy trzeba przeprowadzić reakcję
na materiale nieutrwalonym i utrwalić go
po reakcji.
• Reakcję przeprowadza się w warunkach
optymalnych dla wykrywanego enzymu
11
Niektóre z enzymów są charakterystyczne dla wybranych organelli
lub komórek, dlatego metody histoenzymatyczne mogą być stosowane
do ich identyfikacji
Rekacje histochemiczne – uwagi:
• Podbarwienie tła
• Reakcje kontrolne
• Czułość metody
• Ocena ilościowa
Fosfataza kwaśna
(enzym lizosomowy) - makrofagi
12