cwiczenie 2

ĆWICZENIE II
PREPARATY MIKROSKOPOWE I BARWIENIE DROBNOUSTROJÓW
1. Preparaty przyżyciowe
a) bezpośrednie
b) bezpośrednie w kropli wiszącej
2. Preparaty utrwalone
a) trwałe
b) półtrwałe
3.
a)
b)
•
•
•
Barwienie preparatów
preparaty przyżyciowe
preparaty utrwalone
barwienie pozytywowe
barwienie negatywowe
barwienie pozytywowo – negatywowe
Część praktyczna ćwiczenia II
1. Barwienie drobnoustrojów
a) BARWIENIE WOLUTYNY METODĄ ALBERTA W MODYFIKACJI LAYBOURNA
ODCZYNNIKI:
- barwnik Alberta: błękit toluidyny 0,15 g, zieleń malachitowa 0,20 g, kwas octowy
lodowaty 1cm3, alkohol etylowy (96%) 2 cm3, woda destylowana do 100 cm3.
POSTĘPOWANIE:
• utrwalić preparat w płomieniu palnika
• barwić 5 minut barwnikiem Alberta
• wysuszyć bez płukania wodą (w skośnym położeniu)
• barwić przez 1 minutę płynem Lugola,
• spłukać krótko wodą z kranu
• wysuszyć i oglądać
WYNIK BARWIENIA:
Ziarna metachromatyczne – ciemnogranatowe, ciało komórki – jasnozielone
b) BARWIENIE GLIKOGENU W KOMÓRKACH DROŻDŻY (BARWIENIE
PRZYŻYCIOWE)
ODCZYNNIKI:
- płyn Lugola
POSTĘPOWANIE:
• w kropli płynu Lugola, umieszczonej na środku szkiełka przedmiotowego, rozprowadzić
badane drożdże
• przykryć preparat szkiełkiem nakrywkowym i po 2-3 minutach oglądać pod mikroskopem
WYNIK BARWIENIA:
Protoplazma komórki jasnożółta, glikogen brunatny.
c) BARWIENIE TŁUSZCZU
ODCZYNNIKI:
- czerń Sudanu B, alkohol etylowy (50%)
POSTĘPOWANIE:
• przygotować rozmaz i wysuszyć go w powietrzu
• pokryć rozmaz roztworem czerni Sudanu B i barwić przez 30 minut
• zlać barwnik i osuszyć
• spłukać 50% wodnym roztworem alkoholu etylowego
• przepłukać wodą, wysuszyć i oglądać
WYNIK BARWIENIA:
Granulki tłuszczu są niebiesko – szare, a cytoplazma komórki jasno różowa.
d) PRZYŻYCIOWE BARWIENIE WAKUOLI
ODCZYNNIKI:
- czerwień obojętna
POSTĘPOWANIE:
• umieścić badane drożdże w kropli barwnika
• przykryć preparat szkiełkiem nakrywkowym
• natychmiast oglądać
WYNIK BARWIENIA:
Wodniczki czerwono – purpurowe (UWAGA! Po 15 – 20 minutach barwnik blaknie –
ponieważ jest wydalany z wakuol i zabarwia cytoplazmę na kolor brązowo – różowy).
e) BARWIENIE JĄDRA METODĄ PIEKARSKIEGO – ROBINOWA
ODCZYNNIKI:
- 70% alkohol metylowy, 1 N HCl, barwnik Giemsy: 1-2 krople barwnika na 1 cm3 0,01 M
buforu fosforanowego o pH 7,0
POSTĘPOWANIE:
• rozmaz wysuszony na powietrzu utrwalić alkoholem metylowym przez 3-5 minut
• po upływie tego czasu preparat wysuszyć i hydrolizować go 1 N HCl w temp. 60 0C przez
5 – 10 minut (usunięcie RNA maskującego DNA)
• przemyć preparat kilkakrotnie wodą bieżącą
• barwić rozcieńczonym barwnikiem Giemsy w temp. 37 0C przez 5-15 minut
• preparat spłukać wodą, wysuszyć i oglądać pod mikroskopem
WYNIK BARWIENIA:
Jądro fioletowo – niebieskie. Zaobserwować różne stadia podziałowe jądra oraz jego kształt,
wielkość i położenie w komórce.
f) PRZYŻYCIOWE BARWIENIE MITOCHONDRIÓW
ODCZYNNIKI:
- zieleń Janusowa B 0,1% roztwór wodny
POSTĘPOWANIE:
• przygotować w trzech probówkach umiarkowanie gęstą zawiesinę drożdży
Saccharomyces cerevisiae w sterylnej wodzie jałowej w ilości: a) 9 cm3, b) 9,5 cm3, c) 9,9
cm3. Przed wykonaniem preparatu do probówek dodać kolejno: 1 cm3, 0,5 cm3 i 0,1 cm3
barwnika. Końcowe stężenie zieleni Janusowej B w poszczególnych probówkach wynosi
odpowiednio: a) 0,01%, b) 0,005%, c) 0,001%.
• pobrać ezą na szkiełka podstawowe zawiesiny drożdży z poszczególnych probówek
• przykryć preparaty szkiełkami nakrywkowymi i oglądać pod imersją
WYNIK BARWIENIA:
Mitochondria zielonawoniebieskie (barwna reakcja wywołana jest obecnością w
mitochondriach oksydazy cytochromowej, która utrzymuje barwnik w obrębie mitochondrium
w jego barwnej postaci utlenionej. Zaobserwować kształt, ilość i położenie mitochondriów w
komórce drożdży.
2. Opracowanie wyników
Obserwacje, rysunki i wnioski należy przedstawić w formie sprawozdania.
3. Materiały i sprzęt badawczy
•
•
•
•
Mikroskopy
Wanienki do barwienia
Szkiełka podstawowe i nakrywkowe
Mikroorganizmy z kolekcji KTF i MT
Literatura:
1. Gołębiowska J., Kaszubiak H., Pędziwilk Z., Kaczmarek W.: Ćwiczenia z mikrobiologii,
Poznań 2001
2. Ilczuk Z.: Ćwiczenia z mikrobiologii przemysłowej, UMCS, Lublin, 1997.