Bakterie rodzaju Bacillus, dzięki możliwości tworzenia
advertisement
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 3 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ MORFOLOGIA BAKTERII Małe zróżnicowanie kształtów, wyróżniamy 3 zasadnicze kształty: kulisty, cylindryczny (wydłużony) i nitkowaty. 1. Formy kuliste, noszą nazwę ziarniaków (coccus) i mogą tworzyć układy (jeśli po podziale komórki się nie rozłączają) - ziarniak micrococcus, - dwoinka diplococcus, - czwórniak, czworak tetracoccus (tetragenes), - pakietowiec (sześcianka) sarcina, - paciorkowiec streptococcus, - gronkowiec staphylococcus. 2. Formy cylindryczne - laseczka bacillus (dłuższe), - pałeczka bacterium (krótsze), 3. Inne formy - maczugowiec corynebacterium, - przecinkowiec vibrio, - śrubowiec spirillum - krętek spirochaeta - formy nitkowate np. promieniowce mają komórki podobne do strzępek grzybów ziarniak dwoinka czwórniak pakietowiec paciorkowiec gronkowiec laseczka pałeczka maczugowiec śrubowiec Krętek przecinkowiec Formy przetrwalne różnią się od komórek wegetatywnych budową i składem chemicznym. Wykazują odporność na szkodliwe działanie czynników zewnętrznych, m.in. wysoką temperaturę (ważna rola w skażeniach żywności). Wytwarzane są przez laseczki (tlenowe Bacillus i beztlenowe Clostridium), promieniowce, bakterie śluzowe. Pałeczki nie wytwarzają przetrwalników. Większość bakterii nie przekracza 2 m średnicy i 3-5 m długości, z wyjątkiem form nitkowatych osiągających kilkadziesiąt mikrometrów. Obserwacje bakterii prowadzi się w http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 1 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 3 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ badaniach mikroskopowych, w preparatach przyżyciowych, częściej jednak martwe komórki barwione w preparatach utrwalonych. PREPARATY MIKROSKOPOWE I BARWIENIE DROBNOUSTROJÓW Małe wymiary komórek mikroorganizmów nie pozwalają na ich obserwację okiem nieuzbrojonym. Do badania morfologii, oceny liczebności czy żywotności drobnoustrojów stosuje się obserwacje mikroskopowe preparatów wykonanych bezpośrednio z materiału badanego (np. preparaty odciskowe) lub z hodowli. Przygotowane preparaty można oglądać bezpośrednio pod mikroskopem lub dodatkowo je wybarwić. Celem barwienia jest: odróżnienie bakterii od składników otoczenia, umożliwienie obserwacji cech morfologicznych i diagnostycznych (m.in. kształt, wielkość, wzajemny układ komórek w hodowli, tzn. występowanie komórek pojedynczo lub w różnych układach, obecność otoczek, zdolność ruchu, ilość i rozmieszczenie rzęsek/wici, sposób rozmnażania się – przez podział, tworzenie pączków, zarodników i form przetrwalnych) w celu rozróżnienia poszczególnych grup drobnoustrojów między sobą i odróżnienia pewnych szczegółów w budowie, wykazanie zmian czynnościowych w komórce, ułatwienie liczenia drobnoustrojów (żywych, martwych). Barwienie drobnoustrojów jest procesem fizykochemicznym, który polega na wniknięciu barwnika do wnętrza komórki i utworzeniu barwnego kompleksu z cytoplazmą. Barwniki – substancje organiczne naturalnego pochodzenia lub też związki sporządzone syntetycznie, które adsorbują się lub rozpuszczają w substratach, dając trwałe połączenia barwne. Związki stosowane do barwienia mają w swoim składzie grupę chromoforową (barwną) i grupę auksochromową. Intensywność zabarwienia zależy od liczby i pozycji grup chromoforowych barwnika, a także od obecności grup auksochromowych grupy chromoforowe azowa –N=Nkarbonylowa –C=O nitrowa –NO2 nitrozowa –NO etylenowa –C=Cnitrylowa –C=N- grupy auksochromowe aminowa –NH2 hydroksylowa –OH sulfonowa –SO3H karboksylowa –COOH Barwienie bakterii zależy: - od stanu fizykochemicznego barwnika i odbarwiacza, - natury barwionych drobnoustrojów, - zewnętrznych czynników natury fizycznej i chemicznej wspierających proces barwienia. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 2 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 3 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Do barwienia mikroorganizmów najczęściej stosuje się zasadowe barwniki (błękit metylenowy, safranina, zieleń malachitowa, fuksyna zasadowa, czerwień obojętna, fiolet krystaliczny, goryczkowy i metylowy), gdzie jonem barwnym jest kation, wykorzystując jego powinowactwo do powierzchni komórki, kwaśnej cytoplazmy komórkowej i kwasów nukleinowych. Rzadziej używane są barwniki kwaśne (fuksyna kwaśna, eozyna, erytrozyna, zieleń jasna, barwnik Kongo i nigrozyna) z barwnym anionem lub obojętne mieszaniny barwników kwaśnych i zasadowych (np. barwnik Giemsy). Sporządzanie barwnika następuje poprzez przygotowanie roztworów macierzystych (nasyconych roztworów alkoholowych w stosunku 1:10), np. na 1 gram barwnika daje się 10 ml 96% spirytusu. Rozczyn ten pozostawia się na 3-5 dni w cieplarce w temp. 37ºC, często mieszając. Po tych dniach zlany roztwór znad osadu rozcieńcza się wodą destylowaną i taki roztwór używamy do barwienia, np. fuksyna alkoholowo-wodna zawiera 90 ml wody destylowanej i 10 ml macierzystego roztworu, a błękit metylenowy wg Löfflera zawiera 30 ml macierzystego roztworu i 100 ml 0,01% wodnego roztworu KOH. W zależności od sposobu barwienia wyróżniamy barwienia przyżyciowe i barwienie preparatów utrwalonych. 1 . Przygotowanie preparatów przyżyciowych Preparaty przyżyciowe służą do obserwacji ruchliwości, żywotności, sposobu rozmnażania, a czasami do wykrywania substancji zapasowych. Najczęściej prowadzi się obserwacje drożdży i pleśni ze względu na ich budowę i rozmiar. Obserwacja bakterii, ze względu na małe rozmiary, ogranicza się jedynie do oceny ich ruchliwości. Preparaty przyżyciowe wykonuje się na szkiełku podstawowym (w kropli spłaszczonej), a w przypadku badania ruchliwości bakterii lub prowadzenia obserwacji nad sposobem rozmnażania drożdży preparaty wykonujemy na szkiełku z wgłębieniem zwanym komorą Lindnera (w kropli wiszącej). Wykonywanie preparatu w kropli spłaszczonej Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym (wyjęte z alkoholu, dokładnie wytarte i trzykrotnie przeciągnięte nad płomieniem palnika) umieszcza się kroplę płynnej hodowli drobnoustrojów i nakrywa szkiełkiem nakrywkowym, opuszczając je ukośnie w celu wyeliminowania pęcherzyków powietrza (rys). Nadmiar płynu osusza się bibułą filtracyjną. Przy sporządzaniu preparatu z hodowli na podłożu stałym lub z produktów o konsystencji mazistej należy nanieść na szkiełko najpierw kroplę jałowej wody destylowanej, a następnie pobrany za pomocą ezy materiał rozprowadzić w tej kropli. Całość nakryć szkiełkiem nakrywkowym. Preparaty przyżyciowe należy oglądać bezpośrednio po przygotowaniu, żeby nie dopuścić do przeschnięcia materiału. Najlepszą jakość uzyskuje się przy preparatach cienkich, blisko brzegu kropli. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 3 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 3 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Schemat wykonania preparatu przyżyciowego Wykonywanie preparatu w kropli wiszącej (w komorze Lindnera) Komora Lindnera to szkiełko podstawowe z wgłębieniem. Brzegi wgłębienia komory Lindnera smaruje się wazeliną (1). Na środku odtłuszczonego szkiełka nakrywkowego umieszcza się kroplę badanej hodowli (2), szkiełko szybko odwraca się i przykleja do brzegów wgłębienia w ten sposób, aby kropla wisiała w powietrzu mniej więcej na środku wgłębienia (3). Lekko docisnąć szkiełko, wazelina uszczelnia i spowalnia wysychanie preparatu (rys). Najlepiej oglądać preparat blisko brzegu kropli gdzie jest najcieńszy. Preparat w komorze Lindnera Barwienie preparatów przyżyciowych Preparat przyżyciowy może być barwiony lub nie barwiony. Chcąc wykonać barwienie obok kropli z materiałem badanym umieszcza się kroplę barwnika, miesza ezą i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym. Stosowane barwniki nie mogą być toksyczne i muszą się charakteryzować wysoką kontrastowością. Mimo że używa się ich w bardzo dużym rozcieńczeniu i tak wywołują zahamowanie rozmnażania. Przykłady: barwienie błękitem metylenowym (rozcieńczenie 1:10 000) pozwala ocenić żywotność drożdży; barwnik przenika do wnętrza martwej komórki, która barwi się na ciemnoniebiesko, barwienie płynem Lugola umożliwia wykrycie w komórce drożdży substancji zapasowej – glikogenu, który barwi się na brunatno, a cytoplazma komórki na jasnożółto, http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 4 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 3 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ barwienie bakterii płynem Lugola pozwala u gatunków beztlenowych wykryć granulozę – cukier stanowiący substancję zapasową tych bakterii. Mechanizm barwienia przyżyciowego może być różny i nie jest on jeszcze do końca poznany. Prawdopodobnie jest wynikiem: - chemicznego wiązania ze składnikami komórki, - elektroadsorpcji barwnych anionów i kationów, - rozpuszczania się barwnika w określonych składnikach chemicznych komórki. 2. Wykonanie preparatów utrwalonych Preparaty utrwalone możemy podzielić na: Trwałe – mogą być używane wielokrotnie przez długi czas, Półtrwałe – jednorazowego użytku. Preparaty półtrwałe Preparaty półtrwałe uzyskuje się przez wykonanie rozmazu drobnoustrojów na szkiełku podstawowym, a następnie utrwalenie i wybarwienie (rys). Nie zatapia się ich w balsamie. Wykonanie rozmazu Technika zależy od konsystencji badanego materiału. Jeśli mamy do czynienia z pożywką płynną, to sporządzenie rozmazu polega na rozprowadzeniu kropli cienką warstwą na środku odtłuszczonego szkiełka podstawowego. Rozmaz wykonuje się ezą, suszy na powietrzu. Jeśli materiał pochodzi z hodowli stałej należy najpierw na szkiełku umieścić kroplę wody i następnie – pobrany ezą materiał – rozprowadzić w tej kropli. Z mięsa i produktów mięsnych, ryb, żółtego sera wykonuje się preparaty bezpośrednio z badanych próbek. W tym celu wycięty jałowym skalpelem kawałek (np. mięsa, sera twardego, wędliny) przenieść jałową pincetą na szkiełko podstawowe i odcisnąć na nim wyraźny ślad, cienki i bez wolnych przestrzeni. Po wykonaniu rozmazu preparaty zostawiamy do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Technika wykonywania preparatu bakteriologicznego (rozmaz) 1. odtłuścić szkiełko podstawowe (wyjąć z alkoholu, dokładnie wytrzeć i trzykrotnie przeciągnąć nad płomieniem palnika) 2. przy pomocy ezy nanieść na środek 1-2 kropli płynu fizjologicznego (lub wody) 3. przenieść niewielką ilość materiału bakteriologicznego do płynu fizjologicznego i sporządzić zawiesinę, 4. wykonać rozmaz (rozprowadzić po całej powierzchni szkiełka), 5. wysuszyć na wolnym powietrzu, 6. trzymając szkiełko w szczypcach Cornetta, utrwalić rozmaz przesuwając go trzykrotnie przez płomień palnika, 7. ostudzić szkiełko i ewentualnie dalej wykonać barwienie. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 5 rozmaz MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 3 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Schemat wykonania preparatu półtrwałego Utrwalanie preparatów Utrwalenie przerywa zachodzące w komórkach procesy fizjologiczne i pozwala zachować strukturę komórek, zapobiegając zmianom pośmiertnym. Ma na celu: zabicie komórek drobnoustrojów; przyklejenie się komórek do powierzchni szkiełka – nie spłukuje ich barwnik ani woda; odsłonięcie w ścianach komórkowych martwych mikroorganizmów związków, z którymi łączy się barwnik. Utrwalanie możemy wykonywać metodą: termiczną – wyschnięty preparat przeprowadzamy 3-krotnie w pozycji poziomej (rozmazem do góry) przez płomień palnika (część nie świecącą) chemiczną – do badania struktur komórkowych, przy użyciu 60–70% alkoholu, 10% formaliny, sublimatu lub mieszaniny eteru i alkoholu (1:1). W tym celu na wysuszony rozmaz nalewa się odpowiedni odczynnik. Po 5–10 min zlewa się utrwalacz, suszy na powietrzu i barwi jedną z podanych metod. Używając sublimatu lub formaliny należy preparat dobrze przemyć wodą i wysuszyć. Preparaty utrwalone barwi się, co pozwala na określenie kształtu drobnoustrojów, a także obserwację układów komórek i struktur komórkowych. Barwienia preparatów utrwalonych W mikrobiologii mają zastosowanie następujące sposoby barwienia: barwienie proste – gdzie używamy jednego roztworu barwnika, preparat zalewa się barwnikiem na kilka sekund do kilkunastu minut, barwnik zlewa się, spłukuje wodą, alkoholem lub acetonem i osusza bibułą; stosowane w celu ustalenia kształtu i układu komórek, np. barwienie fioletem krystalicznym lub błękitem metylenowym http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 6 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 3 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ barwienie złożone – stosowane znacznie częściej, z użyciem co najmniej 2 roztworów barwników, barwienie albo w ściśle określonej kolejności albo ich mieszaniną; np. barwienie metodą Grama W zależności od stosowanych barwników, można wyróżnić 3 sposoby barwienia: barwienie pozytywowe (pozytywne) – polegające na zabarwieniu komórek, podczas gdy tło zostaje bezbarwne; może być proste lub złożone, barwienie negatywowe (negatywne) – uzyskanie kontrastu między ciemnym tłem a nie zabarwionymi komórkami; stosowane jest zwykle do barwienia krętków i otoczek bakterii; wykorzystuje się roztwór nigrozyny, tuszu chińskiego lub cyjanochiny, rozmaz wykonuje się z zawiesiny komórek zmieszanych z barwnikiem, nie utrwala się, tylko od razu po wysuszeniu ogląda pod mikroskopem, może być proste lub złożone, barwienie pozytywowo-negatywowe – połączenie powyższych metod, najpierw wykonuje się barwienie negatywowe, a po wyschnięciu dobarwia się barwnikiem pozytywowym. Preparaty trwałe Przygotowanie preparatów trwałych obejmuje kilka etapów, z których najistotniejsze to: utrwalenie, barwienie i zatopienie preparatu. Utrwalenie materiału na szkiełku podstawowym można dokonać za pomocą czynników fizycznych (ogrzewanie szkiełka z rozmazem zawiesiny drobnoustrojów w płomieniu palnika) lub chemicznych (etanol, metanol, formalina, kwas pikrynowy, dwuchromian potasu). Po wyschnięciu preparat barwi się, a następnie pokrywa balsamem kanadyjskim. Po przykryciu szkiełkiem nakrywkowym, lekko ogrzewa do rozpuszczenia balsamu, dociska szkiełko i usuwa nadmiar balsamu. Tak przygotowany preparat może być przechowywany przez długi czas. Barwienie błękitem metylenowym Jest to barwienie proste, które stosujemy w celu ustalenia kształtu i układu komórek. Na utrwalony preparat, umieszczony w kuwecie do barwienia, nakrapia się błękit metylenowy według Löfflera (5 min), po czym preparat spłukuje się wodą, suszy i ogląda pod immersją. Wykonać preparat z wybranej koloni z posiewów z poprzednich ćwiczeń. Barwienie fioletem krystalicznym Jest to barwienie proste. Na utrwalony preparat, umieszczony w kuwecie do barwienia, nakrapia się fiolet krystaliczny (2 min), po czym preparat spłukuje się wodą, suszy i ogląda pod immersją. Wykonać preparat z wybranej koloni z posiewów z poprzednich ćwiczeń. Barwienie negatywne Polega na uzyskaniu kontrastu między ciemnym tłem a nie zabarwionymi komórkami. Stosowane jest zwykle do barwienia krętków i otoczek bakterii; wykorzystuje się roztwór nigrozyny, tuszu chińskiego lub cyjanochiny. Rozmaz wykonuje się z zawiesiny komórek zmieszanych z barwnikiem, nie utrwala się, tylko od razu po wysuszeniu ogląda pod mikroskopem, może być proste lub złożone. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 7 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 3 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ W barwieniu negatywnym bakterie gramdodatnie (Bacillus, Sarcina, Staphylococcus) wykazują zjawisko atrakcji barwnika, polegające na większym skupieniu (zagęszczeniu) się cząstek barwnika w bezpośrednim otoczeniu, na obwodzie lub na zewnątrz niezabarwionej komórki. Bakterie gramujemne, np. pałeczki nie wykazują zjawiska atrakcji barwnika, tło preparatu jest równomiernie wybarwione, natomiast w wielu wypadkach można zaobserwować w środku niewybarwionych komórek, delikatną smugę lub punkcik, co tłumaczy się większą przepuszczalnością błony komórkowej u bakterii gramujemnych w porównaniu z gramdodatnimi. Protokół barwienia negatywowego 1. na szkiełko podstawowe nanieść zawiesinę komórek bakteryjnych, 2. dodać barwnik (kroplę) np. nigrozynę lub tusz, 3. wykonać rozmaz (drugim szkiełkiem podstawowym), 4. suszyć na powietrzu, nie utrwalać termicznie! 5. preparat jest gotowy do oglądania po wyschnięciu. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 8
