Barwienie rozmazów krwi met. Papenheima
advertisement
Barwienie rozmazów krwi met. Papenheima (met. May Grünwalda – Giemsy, MGG) Zasada barwienia: Klasyczne barwienie metodą May – Grünwalda, bardzo dobrze wybarwiało ziarnistości granulocytów, uwidoczniało polichromazję erytrocytów, jednak słabo wybarwiało jądra komórkowe. Barwienie metodą Giemsy, dzięki wykorzystaniu azuru II bardzo dobrze ukazywało jądra komórkowe i ziarnistości azurochłonne, jednak ziarnistości obojetnochłonne w granulocytach pozostawały niewdoczne. Na początku XX w. Papenheim połączył obie metody, tworząc uniwersalną metodę barwienia szpiku i rozmazów krwi. Alkoholowe roztwory barwnika są nieaktywne, dopiero dodatek wody powoduje uzyskanie ładunków jonowych przez cząsteczki barwnika, jak i wybarwianych komórek i selektywne wybarwianie poszczególnych struktur odpowiednimi składnikami barwników. Z tego względu ważne jest pH wody używanej do rozcieńczania i spłukiwania barwników. Powinno się ono zawierać w granicach 6,8-7,2 (optymalnie 7,03). W przypadku gdy roztwór barwnika jest zbyt kwaśny, barwienie odbywa się poniżej punktu izoelektrycznego jąder komórkowych, które zaczynają reagować zasadowo i słabo się wybarwiają. W przypadku wody zbyt alkalicznej, erytrocyty zaczynają się barwić na niebiesko i nie można uchwycić subtelnych zmian w ich barwliwości, wynikających z różnego stopnia wysycenia hemoglobiną. Optymalne pH wody uzyskuje się na dwa sposoby: dodając do wody odpowiedniego buforu, lub używając do barwienia świeżo przegotowanej wody destylowanej (w celu usunięcia dwutlenku węgla, który obniża jej pH). Najlepsze wyniki barwienia uzyskuje się, gdy rozmazy są dobrze wysuszone (co najmniej 2 godziny po wykonaniu rozmazu, lepiej 4-5). Podczas barwienia rozmazu słabo wysuszonego, mogą następować zmiany kształtu krwinek czerwonych, sugerujące ich nieprawidłową budowę. Najlepsze rozmazy uzyskuje się z krwi natywnej. We krwi wersenianowej już po 2 godzinach następują zmiany w budowe leukocytów t.j. pojawienie się wakuoli w cytoplazmie granulocytów, zmiany kształtu jąder limfocytów. Procedura barwienia: 1. Pokryć wysuszony rozmaz 1 ml roztworu barwnika May – Grünwalda (podczas tego kroku następuje utrwalenie rozmazu) i pozostawić na 3 minuty. 2. Na szkiełko dodać 1 ml wody destylowanej (lub buforu), lekko kołysząc wymieszać z barwnikiem i pozostawić na 1 minutę. 3. Spłukać szybko rozmaz wodą destylowaną (lub buforem). 4. Barwić przez 15 minut rozcieńczonym roztworem Giemsy (1 ml stężonego roztworu Giemsy i 20 ml wody destylowanej lub buforu – mieszanina jest nietrwała, należy ją sporządzać bezpośrednio przed barwieniem). Preparaty podejrzane o białaczkę barwić 20 minut. 5. Spłukać szybko szkiełko wodą destylowaną i dokonać oceny preparatu pod immersją. Wyniki barwienia: Ocenę rozmazu należy dokonywać w miejscu, gdzie krwinki czerwone leżą obok siebie, lecz odległości pomiędzy komórkami nie są zbyt duże. Rozmaz należy przeglądać ruchem meandrowym, przez całą szerokość preparatu, gdyż limfocyty częściej gromadzą się na środku rozmazu, a duże komórki (granulocyty, monocyty) na jego brzegach. Jądra komórkowe – chromatyna: fioletowe do czerwonofioletowych Granulocyty: cytoplazma bez RNA lekko błękitna ziarnistości obojętnochłonne fioletowo – różowe Limfocyty Monocyty: ziarnistości kwasochłonne pomarańczowo – czerwone ziarnistości zasadochłonne granatowe lub fioletowe cytoplazma z RNA ciemnobłękitna cytoplazma bez RNA szara lub jasnobłękitna ziarnistości azurochłonne czerwonofioletowe cytoplazma szaroniebieska z fioletowymi ziarnistościami azurochłonnymi Erytrocyty różowoczerwone, komórki zawierające mniej hemoglobiny barwią się na fioletowoczerwono Trombocyty hialomer niebieski granulomer czerwony Składniki: Barwnik May – Grünwalda 100 ml Nr kat. 1028 Barwnik Giemsy 100 ml Nr kat. 1019 500 ml Nr kat. 1056 Składniki opcjonalne: Bufor rozcieńczający barwnik Giemsy stęż. 10x KOLCHEM 93-259 Łódź, ul. Gersona 5A. Tel. 42 207 78 50, 695 238 149
