Potencjalne zastosowania terapeutyczne edycji genów systemem
advertisement
Potencjalne zastosowania terapeutyczne edycji genów systemem CRISPR-Cas9 Coraz częściej w fachowej literaturze biotechnologicznej pojawia się enigmatyczny akronim „CRISPR”. Najnowsze doniesienia bardzo entuzjastycznie opisują kolejne zastosowania rewolucyjnej metody edycji DNA, opartej o białko Cas9 i pewne nietypowe sekwencje palindromowe, szerzej znane właśnie jako „CRISPR”. Na czym polega owa metoda i jaki jest potencjał dla medycyny? Kilka słów o edycji genów Koncepcja edycji genów jest prawie tak stara, jak reakcja PCR. Celowe wprowadzanie konkretnych zmian sekwencji nukleotydowej służyło początkowo naukom podstawowym – eksperymentowano na hodowlach bakteryjnych przy wykorzystaniu zmienionych ex vivo wektorów plazmidowych i/lub bakteriofagów. Taka forma edycji genów nosiła miano ukierunkowanej mutagenezy (ang. sitedirected mutagenesis) i została opisana w 1975 roku [1]. Wprowadzanie zmian było przez dziesięciolecia procesem żmudnym i mało wydajnym. Dynamiczny rozwój technik edycji genów nastąpił w ciągu ostatnich 5 lat, wraz z opracowaniem technologii edycji przy pomocy „talenów” (TALn) [2], a następnie systemu CRISPR. System CRISPR-Cas9: wydajny i dokładny sposób wprowadzania zmian w sekwencji nukleotydowej Akronim CRISPR oznacza w wolnym tłumaczeniu “regularnie zgrupowane, oddzielone, krótkie sekwencje palindromowi” (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Rozwinięcie skrótu dobrze opisuje naturę tych fragmentów DNA – zostały one scharakteryzowane u E. coli a następnie u innych bakterii i ze względu na wyjątkową budowę i zakonserwowany charakter zwróciły uwagę badaczy. Ich funkcja okazała się ciekawa i budziła skojarzenia z interferencją RNA u eukariotów- jest to podobnie jak RNAi element „komórkowego układu immunologicznego”. Broni on gospodarza przed obcym, wirusowym materiałem genetycznym, niszcząc go przy współudziale enzymów nukleolitycznych Cas (najbardziej użyteczna dla nauki dla okazała się być nukleaza Cas9). Najważniejszymi cechami systemu CRISPR-Cas9, które czynią go wyjątkowym narzędziem dla biologii molekularnej, są: -Programowalność -Łatwość ich zastosowania in vitro -Wysoka specyficzność -Duża wydajność transformacji -Brak homologii z genami komórek eukariotycznych -Możliwość zastosowania wielu celów w jednym eksperymencie „Programowalność” sprawia, że odpowiednio zaprojektowany CRISPR potrafi rozpoznać niemalże dowolny fragment DNA i doprowadzić do jego przecięcia. Specyficzność sprawia, że bardzo rzadko enzym Cas9 zbacza z trasy i dokonuje niepożądanego cięcia w innym miejscu, niż zadane. Wydajność cięcia jest bardzo wysoka, sięga ponad 70% [3]. CRISPR-Cas9 cechuje minimalizm- oczyszczony enzym Cas9 i pojedyncza cząsteczka syntetycznego RNA są w stanie dokonać cięcia w próbówce. Wprowadzając kilka RNA jednocześnie można wykonać kilka cięć. Brak homologii z komórkami eukariotycznymi eliminuje ryzyko interferencji z natywnymi, podobnymi białkami ssaczego gospodarza. Od cięcia do edycji genów Przecięcie DNA to oczywiście dopiero połowa sukcesu. Generowane przez CRISPR dwuniciowe pęknięcia są przez natywne, eukariotyczne systemy naprawy DNA eliminowane, głównie na drodze tzw. „naprawy sterowanej przez homologię” (ang. homology driven repair, HDR). W komórce diploidalnej nietknięta nić stanowi matrycę do naprawy nici uszkodzonej. Przecięta przez Cas9 nić DNA jest poddawana obróbce enzymatycznej, polegającej na usuwaniu kilku nukleotydów z miejsca cięcia, generowaniu lepkich końców a następnie odbudowie brakującego fragmentu na drodze homologii. Jest jeszcze druga obiecująca możliwość, polegająca na wycinaniu całych egzonów lub jeszcze większych fragmentów genomu- zastosowanie dwóch typów CRISPR naraz, nacelowanych na leżące blisko siebie sekwencje DNA pozwala na całkowite usunięcie obszaru leżącego między nimi i sklejenie nici w mechanizmie niehomologicznego łączenia końców [4]. System CRISPR-Cas9 i inne formy edycji genów jako najbardziej obiecująca forma terapii genowej Główną trudnością, z którą borykają się badacze terapii genowych, jest transformacja komórek somatycznych, które nie są aktywne replikacyjnie i zwykle nie integrują konstruktów syntetycznych zawierających „lecznicze” sekwencje DNA. CRISPR jest pod tym względem wyjątkowy, ponieważ bazuje na mechanizmach naprawy DNA, które są aktywne także w komórkach znajdujących się w fazie G0 cyklu komórkowego. System CRISPR-Cas9 to wydajny i dokładny sposób wprowadzania zmian w sekwencji nukleotydowej Źródło Wikimedia Commons, autor Thomas Splettstoesser, licencja CC BY-SA 3.0 Fakt ten został potwierdzony empirycznie- u myszy z uszkodzonym genem dystrofiny udało się „wyleczyć” 62% komórek mięśniowych, co wystarczyłoby do częściowej regeneracji mięśni i zahamowania procesu chorobowego [5]. Pomysłów na terapeutyczne wykorzystanie systemu CRISPR-Cas9 jest bez likupocząwszy od leczenia wspomnianych defektów w genie dystrofiny (dystrofia mięśniowa Duchenne), poprzez korekcję mutacji prowadzących do dystrofii siatkówki [6], aż po leczenie nowotworów [7]. Terapie te są wciąż w fazie badań podstawowych ze względu na konieczność zastosowania wektora wirusowego w celu dostarczenia do organizmu pacjenta całej „maszynerii” CRISPR-Cas9. Już teraz jednak w domenę medycyny eksperymentalnej wkroczyły modyfikacje (przy pomocy TALenów) komórek pacjenta ex-vivo. W październiku ogłoszono sukces terapii u rocznej dziewczynki, chorej na oporną postać ostrej białaczki limfoblastycznej. Procedura DLI (infuzja limfocytów dawcy) została wykonany w oparciu o zmodyfikowane limfocyty T donora, w których syntezowane były zmienione antygeny, tzw. UCART19, rozpoznające komórki białaczkowe. O ile sam pomysł nie jest nowy, to wykorzystanie edycji genów było nowatorskie i pozwoliło na zwiększenie skuteczności procedury tam, gdzie zawiodły wszelkie inne formy leczenia [7]. Tak szybkie zastosowanie medyczne tej wciąż nowej i raczkującej technologii daje nadzieję na dynamiczny rozwój innych terapii opartych na edycji genów. Piśmiennictwo: 1. Flavell RA., Sabo DL., Bandle EF. et al. Site-directed mutagenesis: effect of an extracistronic mutation on the in vitro propagation of bacteriophage Qbeta RNA.Proc Natl Acad Sci U S A. 1975; 72, 1: 367–371. 2. Moscou MJ., Bogdanove AJ. A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors. Science, 2009; 326, 5959: 1501. 3. In Vitro Cleavage Efficiency of sgRNAs Correlates with Functional Genome Editing inTarget Cells, TAKARA& CLoneTech TECH NOTE TAKARA & CLoneTech, 4. AddGene CRISPR guide 5. Ousterout DG., Kabadi AM., Thakore PI. et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 2015; 6: 6244. 6. Bakondi B., Lv W., Lu B. et al. In Vivo CRISPR/Cas9 Gene Editing Corrects Retinal Dystrophy in the S334ter-3 Rat Model of Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa. Mol Ther, online publication 19 January 2016. 7. Qasim W, Persis PJ, Samarasinghe S. et al. First Clinical Application of Talen Engineered Universal CAR19 T Cells in B-ALL. 57th Annual American Society of Hematology Meeting, Orlando 2015. . Żele agarozowe i poliakylamidowe: jak je przechować na później? Wielu z nas korzysta w rutynowej pracy z klasycznych żeli PA i agarozowych. Jeżeli często puszczamy elektroforezę, warto się zastanowić, czy każdorazowe przygotowywanie żelu przed elektroforezą to nie strata czasu. Żele można bowiem do tygodnia, a nawet dłużej, składować w lodówce bez straty ich parametrów! Oto bardzo łatwy sposób na przechowanie żelu: 1. Przygotuj woreczki strunowe i szczelny pojemnik plastikowy na żywność. 2. Upewnij się, że masz nadmiar buforu do elektroforezy na podorędziu. 3. Potrzebna będzie także folia aluminiowa lub stretch spożywczy. Żel nie może wyschnąć, a w przypadku dodatku bromku etydyny nie może on też być eksponowany na światło. Warto także pamiętać, że bromkofobom nie spodoba się obecność żelu w ogólnodostępnej lodówce. Dlatego pojemniki, w których przechowywać będziemy nasączone bromkiem agarozy powinny być szczelne i dobrze myte. Układamy żel na folii aluminiowej, w kuwecie lub w plastikowym pojemniku. Następnie skrapiamy go buforem na którym został zrobiony i zawijamy w folię. Do kuwety/pojemnika wlewamy cieniutką warstewkę tegoż buforu a następnie zamykamy w takim pojemniku żel. Nie moczmy żelu w wodzie, powinien on pozostać wilgotny i przebywać w mokrej komorze, ale zbyt duża ilość płynu spowoduje wypłukanie z niego bromku. Komorę z żelem umieszczamy w lodówce, podpisujemy datą produkcji i nie zapominamy zużyć go w ciągu najbliższego tygodnia. Przed wykorzystaniem żelu sprawdzamy, czy jego brzegi nie są zmarszczone i przesuszone, bo taki żel nie nada się do doświadczeń. Uwaga: żeli poliakrylamidowych nienatywnych, z domieszką formamidu, formaldehydu, SDS, czy też enzymów (DNAza) i sond, a także żeli gradientowych nie należy przechowywać, gdyż zmogą zmienić one swoje parametry! Ta metoda ma zastosowanie wyłącznie do żeli natywnych! Ćwiczenia fizyczne obniżają metylację DNA w komórkach mięśniowych „Ruch to zdrowie” – przekonują lekarze i dietetycy. Jest to truizm, ale czy ktoś zastanawiał się, jak to się właściwie dzieje na poziomie komórki, że wysiłek fizyczny jest dla niej korzystny? Uczeni europejscy pod kierunkiem prof. Barresa z Kopenhagi przyjrzeli się temu zagadnieniu od strony epigenetycznej: udało im się zaangażować 14 ochotników, deklarujących „siedzący” tryb życia. Ochotnicy zostali poddani biopsji mięśni poprzecznie prążkowanych przed wysiłkiem, następnie ostremu, jednorazowemu „wyciskowi fizycznemu” i ponownie biopsji mięśnia. W badanych próbkach oznaczono ogólny profil metylacji i jak się okazało – różnił się on znacząco pomiędzy stanem przed wysiłkiem i po wysiłku. Badania przeprowadzono także na większej grupie zwierząt laboratoryjnych, co potwierdziło uzyskane u ludzi wyniki. Co ciekawe, podobny rezultat zaobserwowano także po podaniu myszom wysokiej dawki kofeiny. Uczeni wysnuli przypuszczenie, że obniżenie metylacji genomu może mieć związek z regulacją natężenia mechanizmu transportu wapnia pomiędzy kompartmentami komórki. Obserwowano już wyniki przeciwstawne do uzyskanych przez zespół Barresa u osób z obniżoną wrażliwością komórek na insulinę – pojawiła się więc hipoteza, że tak jak podwyższenie metylacji może powodować zaburzenia metabolizmu w komórkach mięśniowych i prowadzić do cukrzycy, tak obniżenie metylacji, jako zjawisko przeciwstawne może świadczyć o dobroczynnym wpływie ruchu na miocyty. Naukowcy planują rozszerzyć badania i sprawdzić, jak wpływa systematyczna aktywność fizyczna na epigenom i na jak długo zmiany metylacji utrzymują się w komórkach. Niestety na takie badania, z wielokrotnym pobieraniem wycinka mięśni, prawdopodobnie nie zapisze się żaden ochotnik, więc można je będzie przeprowadzić tylko na zwierzętach laboratoryjnych. System CRISPR-Cas9 to wydajny i dokładny sposób wprowadzania zmian w sekwencji nukleotydowej Źródło Wikimedia Commons, autor Thomas Splettstoesser, licencja CC BY-SA 3.0 Źródło: Scientific American Marzena Pieronkiewicz Oczyszczanie oligonukleotydów: odsalanie, elektroforeza czy HPLC? Gdy zamawiamy oligonukleotydy, stajemy przed wyborem metody ich oczyszczenia. Do wyboru zwykle są opcje odsalania i HPLC, chociaż niektóre firmy oferują także mniej wydajną od HPLC chromatografię odwróconej fazy lub sprawdzenie wydajności syntezy poprzez elektroforezę PAGE. Najtańsze jest odsalanie, czy jednak jest ono wystarczające? Którą opcję wobec tego wybrać? Oligonukleotydy są syntezowane automatycznie przez syntetyzery sterowane komputerowo. Nić DNA jest w nich „produkowana” w kierunku 3’ ⇒ 5’, każda zasada dołączana jest poprzez serię następujących po sobie reakcji chemicznych. Musimy wiedzieć, że jak to w chemii bywa, żadna synteza nie jest w 100% wydajna. Dlatego otrzymany oligonukleotyd o zadanej długości to tylko jeden z produktów końcowych- synteza powoduje też powstanie niedokończonych, krótszych oligo. Zwykle na każdym etapie przyłączania nukleotydu do rosnącego łańcucha ok. 1% reakcji przebiega nieprawidłowo. W związku z tym produkt syntezy 30-merowego oligonukleotydu w efekcie stanowi mieszaninę poprawnie zsyntezowanych łańcuchów (54%-74%), a resztę stanowią produkty uboczne reakcji : 29-merowe, 28-merowe itd. Im dłuższy łańcuch, tym mniejsza zawartość prawidłowego produktu syntezy. Produkty uboczne reakcji mogą współzawodniczyć z pełnymi oligonukleotydami o matrycę reakcji, obniżając wydajność amplifikacji lub skutkując niespecyficzną amplifikacją. Dlatego właśnie czasami niezbędne jest dobre oczyszczenie oligonukleotydu, jeżeli korzystamy np. z czułych metod allelospecyficznych, albo jeżeli potrzebne nam są sondy molekularne, lub długie oligo (>40pz). Istnieje pięć głównych metody oczyszczania: odsalanie, chromatografia odwróconej fazy („Cartdridge”) , wysokoprężna chromatografia cieczowa (HPLC), oczyszczanie żelowe na akrylamidzie (PAGE), oraz filtracja żelowa * Podczas odsalania roztwór oligonukleotydu jest przepuszczany przez prostą kolumnę chromatograficzną, z której odpłukiwane są sole, natomiast produkty uboczne syntezy nie są usuwane. Odsalanie jest standardowym wyborem dla starterów tradycyjnych PCR, oraz dla większości starterów do reakcji qPCR. * Metoda chromatografii odwróconej fazy w kardridżu wymywa oprócz soli także część produktów niespecyficznych, pozwalając na otrzymanie frakcji ok. 80-90% żądanego oligonukleotydu. Ustępuje skuteczności HPLC, zapewnia też niższy odzysk oligonukleotydu więc jest dobra tylko dla małych skal syntezy. Metoda nie ma zastosowania dla bardzo długich oligo (>50nt). * Wspomniana już wyżej technika HPLC to najwydajniejsza metoda oczyszczania (ale też najdroższa). Pozwala ona na oczyszczenie nawet dużych ilości oligonukleotydów w najwyższej skali syntezy, o dużej czystości (90-97%). Metoda tak jak poprzednia, nie ma zastosowania dla bardzo długich oligo (>50nt). * Rozdział żelowy PAGE jest jedynym skutecznym sposobem oczyszczania długich oligonukleotydów, którym nie podoła HPLC. Pozwala otrzymać bardzo czyste (do 99% czystości) oligonukleotydy, jednakże ma poważną wadę: niski odzysk z żelu znacząco zmniejsza ilość końcową czystego oligo. Tak oczyszcza się aptamery i krótkie konstrukty syntetyczne. * Sączenie żelowe jest metodą z wyboru dla konstruktów zawierających fofotioniany (tzw. s-oligo) w badaniach nad antysensem. Ma także zastosowanie dla wszelkich oligonukleotydów podawanych do hodowli komórkowych, ponieważ zapewnia najlepsze odpłukanie śladowych zanieczyszczeń chemicznych. Filtracja żelowa pozwala podobnie jak PAGE na oczyszczenie dużych fragmentów DNA. Jest wykorzystywana np. podczas oczyszczania sond do techniki FISH, doskonale wymywając niezwiązany z sondą barwnik. Marzena Wojtaszewska System CRISPR-Cas9 to wydajny i dokładny sposób wprowadzania zmian w sekwencji nukleotydowej Źródło Wikimedia Commons, autor Thomas Splettstoesser, licencja CC BY-SA 3.0 Źródło: Life Technologies SigmaAldrich Zjawisko interferencji RNA u zwierząt i ludzi Współczesny „Świat RNA” to nie tylko mRNA, tRNA oraz rybosomy. To również inne rodzaje RNA, które biorą udział w różnych procesach zachodzących w żywej komórce. Jednym z mechanizmów, w którym bierze udział RNA jest wyciszanie genów. Dzisiaj jest to nie tylko jeden z procesów toczących się w żywych komórkach, ale również metoda dająca nadzieję na wykorzystanie w terapii, gdy pojawiają się trudności ze stosowaniem klasycznych metod leczenia. Początków badań nad mechanizmem regulującym poziom RNA w komórce należy szukać w końcu lat 90. XX wieku. Najpierw trudne do wytłumaczenia zmiany poziomu mRNA zaobserwowano podczas prób wyhodowania nowej odmiany petunii ogrodowej (Petunia hybryda). Zaobserwowane wówczas zjawisko nazwano kosupresją [1]. Podobne zjawisko zaobserwowano u grzyba Neurospora Crassa. W tym przypadku wprowadzenie do genomu grzyba fragmentów genów biosyntezy karotenoidów albino-1 oraz albino-2 powodowało wyciszenie aktywności odpowiednich genów endogennych. W efekcie działania transgenów otrzymywano formę albinotyczną z niezabarwionymi na pomarańczowo konidiami [2]. Kolejny krok nastąpił gdy opisany został nowy, dodatkowy mechanizm potranskrypycjnej regulacji RNA w komórkach Caenorhabditis elegans. Do komórek nicienia wprowadzono dwuniciowy dsRNA. Jedna z jego nici była komplementarna względem fragmentu mRNA wybranego genu. W efekcie poziom tego mRNA w komórce spadał, a związany z nim gen ulegał wyciszeniu. Oznacza to wyciszenie genu zapisanego w tym mRNA. W przypadku Caenorhabditis elegans badano aktywność genu unc-22, kodującego białko miofilamentowe komórek mięśniowych. Obniżenie poziomu tego białka powoduje powstanie fenotypu, którego cechą charakterystyczną jest skurczone ciało (ang. twitching phenotype). Całkowity brak owego białka powoduje uszkodzenie aparatu kurczliwego komórek mięśniowych i ogranicza możliwości ruchu zwierzęcia. Wprowadzenie do organizmu poprzez jelito dwuniciowych dsRNA o długości 742 nukleotydów, odpowiadających segmentowi kodującemu mRNA genu unc-22 powodowało w następnym pokoleniu na około 200 złożonych jaj pojawienie się koło 100 osobników z fenotypem twitching [3]. Zjawisko to nazwano interferencją RNA. W przypadku roślin można mówić o potranskrypcyjnym wyciszaniu genów (ang. post-transcriptional gene silencing – PTGS) lub o kosupresji. W przypadku grzybów proces nazwano tłumieniem genów (ang. gene quelling). Wszystkie te mechanizmy występujące u roślin, grzybów i zwierząt mają bardzo podobny sposób działania, którego podstawowym elementem są krótkie dupleksy RNA zwane siRNA (ang. small interfering RNA). Ze względu na duże podobieństwo uznano, że są to odmiany starego mechanizmu obronnego pierwszych eukariontów pozwalającego na kontrolę inwazji obcych kwasów nukleinowych do wnętrza komórki. Po rozejściu się dróg ewolucyjnych eukariontów, mechanizm u każdego z nich ewoluował wraz z rozwojem roślin, grzybów czy zwierząt (bezkręgowców i kręgowców) [4]. Za odkrycie interferencji RNA Andrew Z. Fire oraz Craig C. Mello w 2006 roku otrzymali nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny i fizjologii. Mechanizm działania interferencji RNA Komórki eukariotyczne zabezpieczone są przed inwazją obcych wirusów czy transpozonów. Pojawienie się dwuniciowego RNA (dsRNA) może być efektem ekspresji trans genu, lub replikacji wirusowego genomu RNA. Gdy w komórce znajdzie się dwuniciowy RNA jest uruchamiany obronny mechanizm enzymatyczny złożony z rybonukleazy Dicer specyficznej względem dsRNA oraz kompleksu nukleazowego RISC. Zaproponowano dwa mechanizmy działania. W pierwszym z mechanizmów dsRNA jest cięty przez wielodomenową nukleazę Dicer do krótkich odcinków liczących sobie od 21 do 23 par zasad. Następnie powstałe w ten sposób produkty hydrolizy są włączane do kompleksu RISC (ang. RNA-induced silencing complex – indukowany przez RNA kompleks wyciszający), który jest kierowany do docelowej sekwencji mRNA. Znajdująca się w RISC endorybonukleaza wykorzystuje antysensowną nić siRNA do odnalezienia komplementarnego do niej fragmentu mRNA. Z tego powodu siRNA bywa nazywany dupleksem kierującym. Specyficzność mechanizmu RNAi opiera się na dokładnym sparowaniu antysensownej nici siRNA z docelowym mRNA. Jeżeli takie sparowanie dojdzie do skutku endorybonukleaza degraduje komplementarną sekwencję mRNA [5]. Ryc. 1 Mechanizm działania RNAi. Opracowanie własne. Drugi mechanizm oparty jest na tak zwanym „degradacyjnym PCR”. Jest to próba wyjaśnienia katalitycznego charakteru RNAi u wspomnianego już nicienia Caenorhabditis elegans. Ciekawą właściwością RNAi u tego nicienia jest przenoszenie inaktywacji genu do nietrasfekowanych komórek i tkanek oraz utrzymywanie się tego zjawiska mimo występujących podziałów komórkowych także w kolejnych pokoleniach. Został zaproponowany mechanizm, w którym polimeraza zależna od RNA (RdRp – RNA-dependent RNA polymerase) na matrycy mRNA syntetyzuje nić komplementarną, budując nowy dwuniciowy RNA. Jest on rozpoznawany i hydrolizowany przez rybonukleazę Dicer. W ten sposób powstaje kolejna generacja siRNA. Starterem reakcji jest antysensowna nić siRNA z grupą hydroksylową na końcu 3’. Brak lub modyfikacja tej grupy blokują proces amplifikacji dsRNA [6]. Mechanizm oparty na „degradacyjnym PCR” nie został zaobserwowany w komórkach muszki owocówki (Drosophila melanogaster), jak też w ssaczych. W przypadku ssaków RNAi nie jest uznawany za naturalny mechanizm hamowania ekspresji genów. Udowodniono natomiast, że syntetyczne siRNA mogą bardzo udanie naśladować produkty hydrolizy rybonukleazy Dicer. Dzięki temu są rozpoznawane przez kompleks RISC i mogą wpływać na wyciszanie wybranych genów. Zauważono, że długie dupleksy liczące powyżej 30 par zasad mogą w większości komórek somatycznych wywoływać obok interferencji RNA również szereg niespecyficznych odpowiedzi. Wyjątkiem są komórki rozrodcze, embriony oraz komórki somatyczne pozbawione systemu odpowiedzi immunologicznej. Tych cech nie wykazują krótsze liczące 21-23 nukleotydy dupleksy, również otrzymane syntetycznie [7]. Budowa siRNA siRNA powstające w wyniku hydrolizy dsRNA w komórce przez Rybonukleazę Dicer wykazują się charakterystyczną budową. Obie nici mierzą do 21 do 23 nukleotydów. Tworzą dupleks na odcinku 19 par nukleotydów pozostawiając dwa lub więcej wolnych nukleotydów na końcach 3’. Na końcu 3’ znajduje się wolna grupa hydroksylowa natomiast na końcu 5’ grupa fosforanowa. Obecność grupy fosforanowej na końcu 5’ nici antysensownej ma wpływ na występowanie procesu interferencji RNA. Grupa ta została nawet określona jako punkt odniesienia od którego mierzone jest miejsce hydrolizy mRNA przez endonukleazę znajdującą się w kompleksie RISC [8]. Kompleks RISC wybiera na nić kierującą tą, której 5′koniec jest słabiej zaangażowany w wiązania typu Watsona-Cricka z drugą nicią budującą dupleks siRNA. Białka uczestniczące w RNAi Pierwszym białkiem jest rybonukleaza Dicer. Należy ona do rodziny RNazIII, które z kolei dzielą się na trzy klasy. Białka należące do każdej z tych klas posiadają przynajmniej dwie domeny: RNazyIII oraz domenę wiążącą dsRNA. Charakterystyczną cechą białek z klasy trzeciej jest występowanie domeny PAZ. Posiadają ją nukleazy Dicer u muszki owocówki oraz u ludzi. Domena PAZ zbudowana jest ze 110 aminokwasów, rozpoznaje i wiąże się z niesparowanymi końcami 3’ dsRNA. Rozpoznanie końca 3’ odbywa się poprzez dopasowanie przestrzenne [9]. Kompleks RISC (ang. RNA-induced silencing complex – indukowany RNA kompleks wyciszający) grupuje białka, z których najważniejsze jest białko z rodziny Argonaute (Argonaute2 – Ago2). Ago2 należy do rodziny konserwatywnych białek występujących u eukariotów oraz u części organizmów prokariotycznych. Białka z tej rodziny posiadają domeny N-terminalną, PAZ, domenę środkową zbliżoną do Lac-Z, oraz PIWI. W obrębie domeny PAZ zidentyfikowana została kieszeń wiążąca fragmenty RNA złożone z dwóch nukleotydów znajdujących się na’ końcu 3′. Domena PIWI posiada aktywność katalityczną zbliżoną do RNazy H. Podobnie też jak RNaza H, do aktywności katalitycznej wymaga obecności dwuwartościowych jonów metali [10]. W obrębie domeny PIWI zidentyfikowana została kieszeń wiążąca grupę 5′ fosforanową nici kierującej siRNA. Region 5′ nici kierującej siRNA jest niezbędny do precyzyjnego odmierzenia miejsca hydrolizy w nici mRNA. Przecięcie mRNA następuje w miejscu znajdującym się na przeciwko wiązania pomiędzy dziesiątym i jedenastym nukleotydem nici kierującej. Białko Ago2 wraz z odpowiednio dobranym siRNA może prowadzić do wyciszenia genu [11]. Poza tym, w kompleksie RISC można też znaleźć białko VIG, które wiąże RNA, występują też białka o aktywności helikalnej, Tudor-SN. Wykorzystanie siRNA w medycynie Krótkie odcinki RNA wyciszające ekspresję wybranych genów wydają się być przydatnym narzędziem terapeutycznym. Szczególnie mogą one być przydatne w tych przypadkach, gdzie można wyciszyć gen przenoszący niebezpieczną mutację. Stąd też wiele badań prowadzonych jest pod kątem wykorzystania interferencji RNA w chorobach nowotworowych poprzez ograniczenie produkcji białek powodujących namnażanie wirusów takich jak HIV, zapalenia wątroby typu B i C, czy wirusa grypy typu A [12]. W przypadku wirusa HIV projektuje się siRNA mające służyć degradacji mRNA receptorów CD4 [13] i CCR5 [14], dzięki którym wirus wnika do komórek gospodarza. Kolejną grupą chorób, gdzie pojawiają się nadzieje na wykorzystanie siRNA w terapii są choroby autoimmunologiczne, neurodegeneracyjne i nowotworowe. Zastosowanie RNAi w nowotworach polegałobyna wyciszaniu genów wpływających na niekontrolowany wzrost komórek. Terapie stosowane w chorobach nowotworowych celowane są na geny, które w wyniku mutacji punktowych nie spełniają swojej fizjologicznej roli: geny ras oraz p53. RNAi stosowane jest też do badań procesu angiogenezy. Z dostępnych danych wynika, że maksymalne działanie siRNA w komórkach obserwowano po 36-48 godzinach od momentu wprowadzenia do nich interferencyjnego RNA. Natomiast po 96 godzinach działanie siRNA zanikało. Oznacza to konieczność dość częstego wprowadzania do organizmu kolejnych porcji siRNA, aby utrzymać wyciszanie wybranego genu [15]. Najdłużej utrzymujący się efekt wyciszenia genów związany z wprowadzeniem syntetycznego siRNA był obserwowany w niedzielących się komórkach neuronalnych i wynosił 21 dni [16]. Nadzieją na wydłużenie tego procesu jest opracowanie wektorów zapewniających stabilna i bezpieczną dla pacjenta ekspresję siRNA w jego organizmie. Istotnym problemem jest wprowadzenie krótkich RNA do komórki. W przypadku doświadczeń in vitro siRNA wprowadzane są do komórek w kompleksach z lipofilowymi odczynnikami polikationowymi, lub z kapsydowymi białkami wirusowymi. W badaniach klinicznych siRNA podawane są domiejscowo – na przykład do oka lub nosa (aerozole), ale również systemowo – dożylnie lub podskórnie [17]. Zastosowanie nanocząsteczek opłaszczonych ligandami receptorów powierzchniowych specyficznych dla poszczególnych typów komórek jest interesującym pomysłem, który ma szanse zostać wykorzystanym w podawaniu siRNA ogólnoustrojowo [18]. System CRISPR-Cas9 to wydajny i dokładny sposób wprowadzania zmian w sekwencji nukleotydowej Źródło Wikimedia Commons, autor Thomas Splettstoesser, licencja CC BY-SA 3.0 Interferencja RNA jest ciekawym procesem regulacji ekspresji genów, polegającym na degradacji mRNA indukowanej przez krótkie dupleksy RNA pochodzenia endogennego lub egzogennego. Odkrycie tego zjawiska słusznie zostało uhonorowane nagrodą Nobla. Odkryto bowiem nie tylko kolejny mechanizm regulacyjny występujący w komórce, ale także potencjalnie narzędzie dla nauki i medycyny. Wysoka specyficzność siRNA budzi nadzieje na wykorzystanie RNAi zarówno w analizie funkcji poszczególnych genów jak i w specjalistycznych terapiach. Można się spodziewać, że w najbliższych latach prowadzone obecnie badania zakończą się wprowadzeniem do powszechnego użytku leków opartych o mechanizm RNAi. Piśmiennictwo 1. Napoli C. et al. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell, 1990, 2, 4: 279-289. 2. Romano N. et al. Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol Microbiol, 1992, 6, 22: 3343-53. 3. Fire A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998, 391: 806-811. 4. Szweykowska-Kulińska Z. i wsp. RNAi, PTGS i quelling – trzy wariacje na jeden temat? Biotechnologia, 2003, 2, 61: 54-66. 5. Hannon GJ. RNA interference. Nature, 2002, 418, 6894: 244-51. 6. Lipardi C. et al. RNAi as random degradative PCR: siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate new siRNAs. Cell, 2001, 107, 3: 297-307. 7. Elbashir S. et al. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev, 2001, 15, 2: 188–200. 8. Sierant M, Nawrot B. Krótkie interferencyjne RNA jako narzędzia do sekwencyjno-specyficznego wyciszania ekspresji genów. Biotechnologia, 2003, 2, 61: 84-103. 9. Agrawal N. et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev, 2003, 67, 4: 657-85. 10. Liu J. et al. Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science. 2004, 305, 5689: 1437-41. 11. Rivas FV. et al. Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC. Nat.Struct.Mol.Biol. 2005, 12, 340-349. 12. Uprichard SL. The therapeutic potential of RNA interference. FEBS Lett. 2005, 579, 26: 5996-6007. 13. Ahlenstiel Ch. et al. Controlling HIV-1: Non-Coding RNA Gene Therapy Approaches to a Functional Cure. Front Immunol. 2015, 6: 474. 14. Zhou J, Rossi JJ. Current progress in the development of RNAi-based therapeutics for HIV-1. Gene Ther. 2011, 18, 12: 1134–1138. 15. Ryther RC. et al. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Ther. 2005, 12, 1:5-11. 16. Omi K. et al. Long-lasting RNAi activity in mammalian neurons. FEBS Lett. 2004, 558, 1-3:89-95. 17. Sipa K, Nawrot B. Mechanizm interferencji RNA i wykorzystanie RNAi dla celów terapeutycznych. Farmakoterapia w Psychiatrii i Neurologii. 2008, 1: 7-18. 18. Kubiak K, Nawrot B. RNAi w terapii. Biotechnologia, 2009, 1, 84: 132-151. Trójwymiarowa katalitycznego DNA struktura Naukowcy z Max Planck Institute for Biophysical Chemistry w Niemczech uzyskali pierwszą trójwymiarową strukturę katalitycznego DNA. Kataliza w biologii jest ograniczona do enzymów RNA oraz enzymów białkowych, niemniej jednak katalizatorami może być także DNA czy syntetyczne molekuły. Rola DNA nie ogranicza się wyłącznie do pełnienia funkcji nośnika informacji genetycznej. Istnieją jednoniciowe fragmenty DNA, wykazujące cechy enzymatyczne – deoksyrybozymy. Substratami reakcji przez nie katalizowanych są zwykle kwasy nukleinowe. Znane są jednak deoksyrybozymy z aktywnością fosfatazy oraz kinazy, które modyfikują aminokwasy czy sprzyjają wiązaniom między dwoma atomami węgla. Dzięki katalitycznym właściwościom powstała także możliwość użycia światła do rozbicia dimerów pirymidynowych, powstających na skutek ekspozycji na UV. Niektóre deoksyrybozymy mają zdolności autokatalityczne, na co wskazuje reakcja autofosforylacji, autoadenylacji z wytworzeniem wiązania 5’,5’-trifosforanowego oraz autodepurynacji. Mimo tego, że chemicy wyizolowali deoksyrybozymy prawie 20 lat temu, aż do tej pory nie było możliwości powiązania ich aktywności katalitycznej ze strukturą trójwymiarową, która zapewnia im takie właściwości. W eksperymencie naukowcy eksponowali badane DNA na promieniowanie Rentgenowskie w synchrotronie SLS (ang. Swiss Light Source), co doprowadziło do uzyskania modelu komputerowego struktury krystalicznej „enzymatycznego DNA”. Dzięki temu po raz pierwszy można było zobaczyć, że DNA wykazuje zdolność do przybierania tak złożonych form jakie posiadają białka czy rybozymy. Co więcej, naukowcy przełamali paradygmat „sztywności” dwuniciowej struktury DNA – molekuła przyjmując złożoną strukturę 3D wykazała większą elastyczność niż przypuszczano. Zwizualizowana w badaniu struktura deoksyrybosomu to 9DB1, która jest odpowiedzialna za katalizowanie ligacji RNA. Zaobserwowane zmiany w sekwencji nukleotydowej DNA dostarczyły wiedzy na temat podstaw regioselektywności ligacji i pozwoliły na manipulacje w sferze rozpoznawania substratu i szybkości reakcji. System CRISPR-Cas9 to wydajny i dokładny sposób wprowadzania zmian w sekwencji nukleotydowej Źródło Wikimedia Commons, autor Thomas Splettstoesser, licencja CC BY-SA 3.0 Odkrycie może pozwolić na lepsze zrozumienie właściwości molekularnych odpowiednich reakcji oraz porównać różnice i podobieństwa między katalistami DNA i RNA.Rozpoczęto już badania kliniczne wykorzystania trójwymiarowej struktury deoksyrybozymów w medycynie. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: Ponce-Salvatierra A. et al. Crystal structure of a DNA catalyst. Nature 529: 231–234. Oferta pracy dla doktoranta w Heddle Lab Otwarto konkurs na stanowisko DOKTORANTA w znakomitej, międzynarodowej grupie badawczej – Heddle Laboratory – w Małopolskim Centrum Biotechnologii UJ w ramach projektu SYMFONIA. Deadline 10.12.2016. Wybrany kandydat dołączy do wielodyscyplinarnego zespołu wyspecjalizowanego w projektowaniu i produkcji nowych zespołów sztucznego białka oraz będzie miał ważne zadanie zaprojektowania i testowania in silico nowych rodzajów zespołów białkowych. Idealny kandydat powinien: 1) Posiadać stopień magistra biofizyki, modelowania molekularnego lub w pokrewnej dziedzinie. 2) Posiadać doświadczenie/wiedzę w in silico w modelowaniu białek lub innych cząsteczek. 3) 4) Posiadać doświadczenie w programowaniu w językach Python oraz C++. Posiadać pewne doświadczenie w projektowaniu białek in silico (np. oprogramowanie Rosetta) lub gotowość i zdolność do nabycia takich umiejętności. 5) Posługiwać się językiem angielskim w stopniu zaawansowanym umożliwiającym prowadzenie konwersacji oraz przygotowanie publikacji naukowych. 6) Posiadać dobre kwalifikacje i umiejętności w zakresie zarządzania pracą i eksperymentalnej ewidencji. 7) Mieć możliwość pracy w wielu dyscyplinach oraz być gotowym do zdobycia doświadczenia w ramach nowych dziedzin. 8) Posiadać umiejętność współpracy z innymi członkami zespołu badawczego. 9) Posiadać status doktoranta (lub wyrażać gotowość do uzyskania statusu doktoranta) w dniu rozpoczęcia pracy. Stanowisko: DOKTORANT Jednostka: Małopolskie Centrum Biotechnologii UJ Termin składania dokumentów: 10.12.2016 Data wytworzenia: 01.12.2016 Szczegóły ogłoszenia w załączniku. System CRISPR-Cas9 to wydajny i dokładny sposób wprowadzania zmian w sekwencji nukleotydowej Źródło Wikimedia Commons, autor Thomas Splettstoesser, licencja CC BY-SA 3.0 Nadtlenek septyczny wodoru a wstrząs Nowe odkrycie naukowców wskazuje, że toksyczne produkty uboczne przemiany materii mogą mieć kluczowe znaczenie w patogenezie wstrząsu septycznego. W publikacji, która ukazała się w majowym wydaniu magazynu Word Journal of Critical Care Medicine, naukowcy sugerują, że wstrząs septyczny jest zaburzeniem metabolicznym wynikającym z nadmiernej akumulacji nadtlenku wodoru we krwi. Wstrząs septyczny jest stanem zagrażającym życiu, który jest związany z ogólnoustrojową odpowiedzią organizmu na zakażenia drobnoustrojami. Wstrząs septyczny jest najczęstszą przyczyną zgonów na szpitalnych oddziałach intensywnej terapii, a w przypadku rozwinięcia się niewydolności wielonarządowej, umieralność może sięgać 80%. Z tego powodu naukowcy ponownie przyjrzeli się jej mechanizmowi. Dotychczas za wstrząs septyczny obwiniana była nadmierna reakcja układu odpornościowego na czynnik zakaźny. Jednakże przeprowadzono liczne badania, które wskazywały, że odpowiedź immunologiczna w trakcie wstrząsu septycznego nie różni się specjalnie od tej, której przyczyną są oparzenia, czy ciężkie urazy. Jedyna różnica polega na czasie trwania i intensywności zapalenia ogólnoustrojowego. Wywołuje to poważne wątpliwości, co do roli układu odpornościowego w rozwoju szoku septycznego. Objawami sepsy między innymi są tachykardia, trwale utrzymująca się wysoka gorączka, przyspieszony oddech, a także zwiększona synteza białek. Konsekwencją tego jest między innymi wzmożony metabolizm komórkowy, co generuje dużą ilość toksycznych dla organizmu produktów ubocznych, takich jak nadtlenek wodoru (H2O2). Nadtlenek wodoru jest ubocznym produktem normalnego metabolizmu komórkowego, jednak jego nadmierna akumulacja we krwi może spowodować uszkodzenie naczyń włosowatych. Konsekwencją tego są charakterystyczne dla wstrząsu septycznego zaburzenia – dysfunkcja mikrokrążenia, mikroangiopatia zakrzepowa i oporne na leczenie niedociśnienie. W rezultacie dochodzi do niewydolności wielonarządowej, która jest najczęstszą przyczyną śmierci pacjenta. Teorię naukowców potwierdza wysoki poziom nadtlenku wodoru zmierzony w surowicy i moczu pacjentów ze wstrząsem septycznym. System CRISPR-Cas9 to wydajny i dokładny sposób wprowadzania zmian w sekwencji nukleotydowej Źródło Wikimedia Commons, autor Thomas Splettstoesser, licencja CC BY-SA 3.0 Ten nowy pogląd na patogenezę wstrząsu septycznego może przyczynić się do powstania terapii, która mogłaby zapobiegać i odwracać skutki zdrowotne związane z zakażeniem ogólnoustrojowym. Obecnie naukowcy pracują nad protokołem badań klinicznych i maja nadzieję na dofinansowanie ich wstępnych dokonań, których rezultaty mogą uratować życie milionom ludzi na całym świecie. Piśmiennictwo: Pravda J. Metabolic theory of septic shock. World J Crit Care Med 2014; 3, 2: 454. Opracowano metodę analizy DNA z materiałów zdegradowanych DNA organizmów przechowywanych w muzeach i zielnikach może powiedzieć wiele np. o ewolucji gatunków. Z czasem ulega ono degradacji i wykorzystanie tej informacji staje się coraz trudniejsze. Naukowcy znaleźli metodę na szybkie i tanie wyłowienie fragmentów zniszczonego DNA i namnożenie ich. Dzięki niej odczytają np., jak klimat kształtował rozmieszczenie gatunków na Ziemi. W zielnikach i zbiorach muzealnych na całym świecie znajdują się miliony okazów zwierząt, grzybów i roślin. Zbierane przez stulecia często pochodzą z bardzo odległych i trudno dostępnych rejonów świata. Zawierają też np. okazy przedstawicieli gatunków wymarłych w naturze. „W naszym Instytucie mamy około miliona opisanych, zabezpieczonych obiektów biologicznych, które są przechowywane w zielnikach. Potencjalnie mogą być one dostępne do badań” – mówi PAP dr hab. Michał Ronikier z Instytutu Botaniki im. W. Szafera Polskiej Akademii Nauk. Zgromadzone w ten sposób zbiory mogą stanowić cenne źródło informacji np. o ewolucji gatunków, biogeografii czy historycznych procesach zachodzących w populacjach. Jednak badanie materiału genetycznego z takich muzealnych okazów długo było dla naukowców sporym problemem. „DNA zawarte w takich obumarłych komórkach z czasem podlega degradacji. Pierwotnie długie molekuły nieuchronnie rozpadają się na mniejsze fragmenty. Wskutek tego zmniejsza się zarówno stężenie DNA w takim obiekcie i ciągłość dostępnej informacji, która jest w DNA zapisana. To mniej więcej tak, jak z niektórymi starymi księgami, w których z czasem kartka papieru rozpada się na drobniutkie kawałki. Im drobniejsze są te kawałki, tym trudniej wyciągnąć z nich później sensowną informację” – opisuje rozmówca PAP. Metody analiz DNA od ponad 30 lat podlegają jednak ciągłej ewolucji. „W ostatnich latach w tej dziedzinie nastąpił nieprawdopodobny jakościowy skok. Jest on związany z powszechnym wprowadzeniem tzw. technologii sekwencjonowania nowej generacji. W klasycznym sekwencjonowaniu, które jest stosowane od dziesiątków lat, możliwe jest uzyskanie sekwencji pojedynczych fragmentów DNA z genomu i to pod warunkiem występowania w próbce znacznej liczby niezdegradowanych kopii oczekiwanego fragmentu. Sekwencjonowanie nowej generacji pozwala natomiast na uzyskanie informacji z setek tysięcy albo milionów miejsc w genomie, a nawet sekwencjonowania całego genomu dowolnego gatunku czy osobnika” – opisuje dr Ronikier. Naukowcy z krakowskiego Instytutu wspólnie z grupą badawczą dr. N. Alvareza z Uniwersytetu w Lozannie opracowali nową metodę badania zmienności genomu o nazwie hyRAD (hybridization RAD). Umożliwia ona analizę DNA genomowego zarówno w materiałach niezdegradowanych, jak i zdegradowanych oraz – jak podkreśla dr Ronikier – jest stosunkowo niedroga. „Poprzez możliwość wykorzystania w badaniach materiałów muzealnych na szeroką skalę nasza metoda pozwala na uzyskanie informacji unikatowych, które niezwykle trudno byłoby uzyskać innymi metodami i na podstawie innych źródeł. Kompleksowa analiza zmienności DNA na dużym materiale biologicznym umożliwia zdobycie informacji o historii ewolucyjnej badanych gatunków czy ich biogeografii, czyli powstawaniu i dynamice zmian zasięgów geograficznych. Mając te dane możemy zrozumieć, jak ewoluowały gatunki, jak na ich rozmieszczenie na Ziemi wpływały zmiany klimatu. W naszym projekcie zajmujemy się roślinami, grzybami i owadami, ale metodę hyRAD można zastosować dla wszelkiego typu organizmów” – mówi dr Ronikier. Punktem wyjścia do badań z wykorzystaniem nowej metody jest izolacja niezdegradowanego DNA ze „świeżych” prób badanego gatunku. Ten zbiór fragmentów DNA stanowi tzw. bibliotekę genomową – punkt odniesienia do badań materiału muzealnego. Takie fragmenty naukowcy przekształcają później w tzw. sondy molekularne. „Pozwolą nam one na selektywne wyłapanie oczekiwanych przez nas fragmentów z tego mocno zdegradowanego genomu, bez jego wcześniejszej znajomości” – opisuje dr Ronikier. System CRISPR-Cas9 to wydajny i dokładny sposób wprowadzania zmian w sekwencji nukleotydowej Źródło Wikimedia Commons, autor Thomas Splettstoesser, licencja CC BY-SA 3.0 W drugiej fazie eksperymentu modyfikowane są niewielkie, zdegradowane fragmenty DNA wyselekcjonowane z prób muzealnych. Na obydwu końcach tych fragmentów naukowcy dołączają w szeregu reakcji dodatkowe kawałki DNA, które pozwolą im później powielić te fragmenty genomu. „W trzeciej fazie prowadzimy hybrydyzację – do roztworu z naszymi sondami molekularnymi dodajemy zmodyfikowane – zdegradowane DNA z prób muzealnych. Wszystkie fragmenty DNA, które będą pasowały do naszych sond będą przez nieaktywnie wyłapane, na zasadzie naturalnego powinowactwa nici DNA, nawet jeśli znajdą się w roztworze w bardzo niewielkim stężeniu. Potem złapane fragmenty możemy choćby z pojedynczych nici DNA namnożyć i sekwencjonować. Taka procedura pozwala nam w różnych próbach, o różnym stopniu degradacji DNA, uzyskać zbliżone, porównywalne zestawy fragmentów do sekwencjonowania, obchodząc niejako szereg dotychczasowych zasadniczych problemów metodycznych” – mówi naukowiec. Choć metoda wymaga wykorzystania DNA gatunku żyjącego obecnie, to umożliwia też prowadzenie badań z wykorzystaniem okazów gatunków wymarłych. „Jako źródła fragmentów referencyjnych możemy w takiej sytuacji użyć możliwe najbliższego, najbliżej spokrewnionego gatunku żyjącego obecnie. Na tej bazie możemy wyciągnąć fragmenty homologiczne, z gatunku spokrewnionego” – podkreśla. Badania Instytutu Botaniki im. W. Szafera PAN i Uniwersytetu w Lozannie prowadzono w ramach projektu Polsko-Szwajcarskiego Programu Badawczego. Ich głównym wykonawcą był dr Tomasz Suchan, który zrealizował część swojego doktoratu właśnie w ramach tej polsko-szwajcarskiej współpracy. Jest to etap prac poświęconych ewolucji i biogeografii organizmów siedlisk arktyczno-alpejskich z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania nowej generacji. Najważniejszym gatunkiem, który badają naukowcy jest dębik ośmiopłatkowy – jeden z kluczowych gatunków tworzących ekosystemy arktyczne i alpejskie. „Badamy system ekologiczny: powiązany z dębikiem ośmiopłatkowym gatunek grzyba i motyla. Staramy się poznać historyczne powiązania ewolucyjne między nimi i sprawdzamy m.in. czy migrowały one spójnie, czy ich zasięg zmieniał się w powiązaniu ze sobą” – wyjaśnił dr Ronikier. Publikacja na temat nowej metody badania zmienności genomu ukazała się w prestiżowym amerykańskim czasopiśmie PLOS ONE. Źródło: www.naukawpolsce.pap.pl
