Interferencja RNA – nowe narzędzie w leczeniu

zakażenia 1/2009
zakażenia wirusowe
Interferencja RNA
– nowe narzędzie w leczeniu
infekcji HCV
Rafał Krygier
RNA interference (RNAi) – exciting new technology
for the treatment of HCV infections
Streszczenie
RNAi to zjawisko wyciszania ekspresji genu przez dwuniciowy RNA o budowie i sekwencji zbliżonej do
sekwencji DNA wyłączanego genu. Już w 2004 roku rozpoczęto badania kliniczne z siRNA (small
interfereing RNA). Z dotychczasowych doświadczeń wynika, że każdy etap badań nad wynalezieniem
leku opartego na siRNA jest dużo krótszy niż w przypadku tradycyjnych preparatów. Niesie to nadzieję na wytworzenie skutecznych leków przeciwko wielu chorobom nowotworowym, autoimmunologicznym, nurodegradacyjnym oraz wirusowym. Dzięki pozakomórkowemu systemowi służącemu do
hodowli i namnażania HCV w laboratoriach biotechnologicznych rozpoczęto projektowanie cząsteczek
krótkiego dwuniciowego RNA (siRNA), pobudzających kompleks białkowy o aktywności endorybonukleazy (RISC − RNA induced silencing complex) do degradacji mRNA HCV niosących informacje
z określonego genu. Na podstawie doświadczeń ustalono, że optymalna długość siRNA wynosi 21−23
par zasad. Poszukiwanymi docelowymi miejscami terapii wykorzystującej RNAi były regiony genomu
HCV jak najbardziej konserwatywne a jednocześnie ważne w cyklu życiowym wirusa. W latach
2005–2006 znaleziono kilka takich miejsc, np. w regionie IRES od 330 do 349 oraz od 340 do 359
pary zasad. Ponadto podjęto badania nad wpływem RNA i na ekspresję cyklofiliny B (CyPB) i regionu NS5B. Wirus HCV, replikujący w cytoplazmie komórek bez integracji z genomem gospodarza,
stanowi dobry cel terapii wykorzystującej RNAi. Jest to wirus jednoniciowy, dlatego zniszczenie RNA
powoduje ograniczenie nie tylko syntezy białek, ale także replikacji wirusa. Produkcja interferonów,
będąca częstym skutkiem ubocznym działania RNAi, może pomagać w leczeniu infekcji HCV. Mimo
trudności w syntezie i konstrukcji wektorów, problemów ze stabilnością siRNA w osoczu oraz zmiennością wirusa HCV terapia przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu C za pomocą interferencji RNA okaże się w najbliższych latach skuteczną strategią.
Summary
RNA interference (RNAi) is a phenomenon in which small double-stranded RNA molecules induce sequence-specific degradation of homologous single-stranded RNA. In plants and insects, RNAi activity plays a role in host-cell protection from viruses and transposons. Hepatitis C virus (HCV) replicates
in the cytoplasm of liver cells without integration into the host genome. Because the HCV genome is
a single-stranded RNA that functions both as a messenger RNA and as a viral replication template,
destruction of HCV RNA could eliminate not only virally directed protein synthesis, but also viral
replication. Multiple siRNAs targeting evolutionarily restricted HCV RNA sequences may limit the
emergence of escape mutants. Recently developed stable RNAi silencing vectors can be used to generate cell lines that constitutively express high levels of siRNAs that target HCV.
Słowa kluczowe/Key words
interferencja RNA ➧ HCV ➧ leczenie
RNA interference (RNAi) ➧ HCV ➧ treatment
Stary ewolucyjnie i szeroko rozpowszechniony wśród organizmów system regulacji
pracy genów zwany interferencją RNA
(RNAi) przez wiele lat pozostawał tajemnicą.
Dopiero w czasie badań nad petunią ogrodową (Petunia hybryda, 1990 r.) oraz nicieniem
(Caenorhabditis elegans, 1998 r.) odkryto
mechanizm wyciszania genów na poziomie
ich mRNA (informacyjnego RNA). RNAi to
zjawisko wyciszania ekspresji genu przez
dwuniciowy RNA o budowie i sekwencji
zbliżonej do sekwencji DNA wyłączanego
genu.
Wyłączanie może się odbywać przez:
degradację mRNA;
blokowanie translacji mRNA;
prawdopodobnie również przez indukcję
epigenetycznego wyciszenia genu.
Za degradację mRNA odpowiedzialne są
oligonukleotydy, tzw. siRNA − małe interferujące RNA, charakteryzujące się stuprocentową homologią sekwencji do ich celu. W kon­
sekwencji degradacji mRNA odpowiedni gen
jest wyciszany, bo nie powstaje kodowane
przez niego białko. W przypadku mechanizmu
interferencji z translacją mRNA mediatorami
© Twoje Zdrowie Sp. z o.o.
73
lek. med. Rafał Krygier
Oddział Obserwacyjno-Zakaźny
Wojewódzkiego Szpitala
Zespolonego w Koninie
Adres do korespondencji:
Rafał Krygier
Wojewódzki Szpital Zespolony
Oddział Obserwacyjno-Zakaźny
ul. Wyszyńskiego 1
62–510 Konin
e-mail: [email protected]
zakażenia wirusowe
zakażenia 1/2009
i zmniejszenie w nim gęstości małych naczyń
in vivo [1]. Już wkrótce należy się spodziewać
na rynku odpowiednich preparatów.
Projektowanie siRNA
yc. 1. Schemat regulacji
R
genów za pomocą interferencji RNA.
yc. 2. Przykładowe
R
sekwencje siRNA działające na genom wirusa
HCV [5].
są tzw. mikro-RNA (miRNA). Już w 2004
roku rozpoczęto badania kliniczne z siRNA.
Dotychczasowe doświadczenia wykazują,
że każdy etap badań nad rozwojem leku opartego na siRNA (głównie faza przedkliniczna) jest dużo krótszy niż w wypadku małych
cząsteczek chemicznych, czyli tzw. tradycyjnych leków. Z tym wiąże się nadzieja na wytworzenie skutecznych środków przeciwko
wielu chorobom nowotworowym, autoimmunologicznym, nurodegradacyjnym oraz wirusowym. Są już prowadzone badania drugiej
fazy klinicznej, dotyczące leków opartych na
siRNA. Przykładem mogą być prace nad
VEGF (vascular endothelial growth factor),
który ma wpływ na progresję raka pierwot­
nego wątroby (HCC). Wyciszenie VEGF za
pomocą siRNA powoduje zmniejszenie pro­
liferacji komórek nabłonka naczyniowego
in vitro, a także spowolnienie wzrostu guza
74
Po kilku latach pracy nad modelem badawczym, stanowiącym podstawę doświadczeń na
wirusach, w 2005 roku został opracowany pozakomórkowy system służący do hodowli
i namnażania HCV – hodowla in vitro w komór­
kach ludzkiego raka wątroby (głównie transferowane linie Huh 7 i HepG2). Badaczom udało
się uzyskać zarówno ekspresję białek w wirusach, jak i syntezę wirionów. W laboratoriach
biotechnologicznych rozpoczęto projektowanie
cząsteczek krótkiego dwuniciowego RNA, tzw.
siRNA (small interfering RNA), takich, które
pobudzają kompleks białkowy o aktywności
endorybonukleazy (RISC − RNA-induced silencing complex) do degradacji mRNA niosących informacje z określonego genu. Na podstawie doświadczeń ustalono, że optymalna
długość siRNA wynosi 21−23 par zasad [2].
Cechy genomu HCV
Genom HCV zbudowany jest z jednoniciowego, dodatnio spolaryzowanego RNA o długości około 9500 nukeotydów. Większą jego
część stanowi pojedyncza długa ramka odczytu (ORF), kodująca prekursorową poliproteinę
złożoną z 3010−3011 aminokwasów. Na końcu
3' i 5' znajdują się niekodujące fragmenty powtórzone (NCR − non coding repeats). Fragment NCR na końcu 5’ zawiera sekwencję
IRES (internal ribosome entry site), która, łącząc się z rybosomem, może służyć jako inicjator translacji [3, 4]. Region 340 nukleotydów
końca 5’, obejmujący domeny rdzenia, jest silnie konserwatywny (powyżej 85% podobieństwa między różnymi podtypami wirusa HCV),
i ta właściwość została wykorzystana w syntezie starterów stosowanych w diagnostyce molekularnej.
Wirus HCV należy do silnie mutujących
wirusów, czego efektem jest pojawianie się
form rzekomych (quasi-species), będących mutantami pierwotnego wirusa wywołującego
zakażenie. Celem terapii opartej na RNAi było
znalezienie regionów genomu HCV jak najbardziej konserwatywnych a jednocześnie ważnych w cyklu życiowym wirusa. W latach
2005–2006 wykryto kilka takich miejsc, np.
w regionie IRES od 330 do 349 oraz od 340 do
359 pary zasad. Ponadto podjęto badania nad
wpływem RNAi na ekspresję cyklofiliny B
(CyPB) i regionu NS5B. W kolejnych pracach
in vitro zajmowano się białkiem CXCL-8, któ-
zakażenia 1/2009
zakażenia wirusowe
rego wyciszenie skutkowało spadkiem syntezy
HCV. Celem badań są także geny człowieka
modulujące infekcję HCV [6, 7, 8].
Dalsze prace nad miejscami docelowymi
siRNA prowadzi się w wielu prywatnych laboratoriach na świecie, a wyniki tych badań
są natychmiast zgłaszane do ochrony patentowej. Obecnie ochroną patentową jest objętych
kilkadziesiąt sekwencji siRNA dotyczących
genomu HCV [10, 11, 12].
Wnioski
Wirus HCV, replikujący w cytoplazmie
komórek bez integracji z genomem gospodarza, stanowi dobry cel terapii opartej na RNAi.
Jest to wirus jednoniciowy RNA, toteż zniszczenie RNA powoduje ograniczenie nie tylko
syntezy białek, ale także replikacji wirusa.
Częsty efekt uboczny RNAi, czyli produkcja
interferonów, może być pomocny w leczeniu
infekcji HCV. Mimo trudności w syntezie
i konstrukcji wektorów, problemów ze stabilnością siRNA w osoczu oraz zmiennością
wirusa HCV terapia przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu C za pomocą interferencji RNA okaże w najbliższych latach
skuteczną metodą.
n
Słownik:
RNAi (RNA interference) − interferencja RNA.
dsRNA (double stranded RNA) − dwuniciowy
RNA.
siRNA (small interfering RNA) − małe interferujące
RNA (oligonuleotydy).
RISC (RNA-induced silencing complex) − kompleks
białkowy o aktywności endorybonukleazy (indukowany przez RNA kompleks wyciszający).
mRNA (messenger RNA) − informacyjny RNA (bierze udział w regulacji ekspresji genów).
Piśmiennictwo:
1. Raskopf E., Vogt A. i wsp.: siRNA targeting
VEGF inhibits hepatocellular carcinoma growth and
tumor angiogenesis in vivo, Journal of Hepatology 2008,
49, 977−84.
2. Kronke J., Kittler R., Buchholz F. i wsp.: Alternative approaches for efficient inhibition of hepatitis C virus
RNA replication by small interfering RNAs, J Virol 2004
Apr, 78 (7), 3436−46.
3. Ilves H., Kaspar R. L., Wang Q. i wsp.: Inhibition
of Hepatitis C IRES-Mediated Gene Expression by Small
Hairpin RNAs in Human Hepatocytes and Mice, Ann N
Y Acad Sci 2006 Oct, 1082, 52−5. 4. Chen W. X., Shan L. N., Chen J. i wsp.: Inhibition
of HCV IRES controlled reporter gene expression by RNA
interference, Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi 2006 Jul,
14 (7), 521−4.
5. Wilson A. J., Richardson C. D.: Virus replicons
escape RNA interference induced by a short interfering
RNA directed against the NS5b coding region, Hepatitis
Journal of Virology 2005, 79, 11, 7050−8.
6. Wang Y., Kato N., Jazag A., Dharel N. i wsp.:
Hepatitis C virus core protein is a potent inhibitor of RNA
silencing-based antiviral response, Gastroenterology
2006 Mar, 130 (3), 883−92.
7. Konishi M., Wu C. H., Kaito M. i wsp.: siRNAresistance in treated HCV replicon cells is correlated with
the development of specific HCV mutations, J Viral Hepat
2006 Nov, 13 (11), 756−61.
Cecha
Ograniczenia terapii
Ryc. 3. Geny gospodarza
modulujące infekcję HCV
jako cel terapii wykorzystującej RNAi [9].
Rozwiązania problemu
Znaczna specyficzność działania
siRNA
Mutacja wirusa HCV
w obrębie sekwencji
docelowej dla siRNA
czyni oligonukleotyd
nieskutecznym
Podawanie kilku cząsteczek siRNA
jednocześnie (skierowanych do różnych fragmentów genomu HCV)
Dożylne podanie
cząsteczek siRNA
doprowadza do ich
szybkiej degradacji
Niskie stężenie siRNA
w miejscu docelowym
terapii
Wiązanie z liposomami jako nośnikami cząsteczek siRNA w transporcie
do cytoplazmy wirusa HCV (ApoB,
nanocząsteczki lipidowe − LNP)
Zjawisko wyciszania genów można
obserwować tylko
przez okres od 1 do
3 tygodni
W czasie leczenia chorób przewlekłych niezbędne jest cykliczne
podawanie leku w formie iniekcji
Wykorzystanie wektorów wprowadzających do komórek geny kodujące siRNA
Usprawnienie produkcji siRNA
dzięki systemowi toczącej się transkrypcji na matrycy małych dzwonów DNA
Szybkie efekty w fazie przedklinicznej
badań nad lekami
opartymi na RNAi
Ochrona patentowa
poszczególnych sekwencji nukleotydów
Interesy firm farmaceutycznych
Współpraca ośrodków badawczych
z firmami biotechnologicznymi
8. Koo B. C., McPoland P., Wagoner J. P. i wsp.:
Relationships between hepatitis C virus replication and
CXCL-8 production in vitro, J Virol 2006 Aug, 80 (16),
7885−93.
9. Randal G., Pfeffer S., Soutschek J.: 42nd Anual
Meeting of the EASL 2007. Symposium 5 (oral presentation).
10. Watanabe T., Sudoh M., Miyagishi M. i wsp.:
Intracellular-diced dsRNA has enhanced efficacy for silencing HCV RNA and overcomes variation in the viral
genotype, Gene Ther 2006 Jun, 13 (11), 883−92.
11. Hamazaki H., Takahashi H., Shimotohno K. i wsp.:
Inhibition of hcv replication in HCV replicon by shRNAs,
Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2006, 25 (7),
801−5.
12. Seyhan A. A., Vlassov A. V., Johnston B. H.:
(SomaGenics).RNA interference from multimeric shRNAs
generated by rolling circle transcription, Oligonucleotides 2006, 16 (4), 353−63.
75
Tab. 1. Mocne i słabe
strony terapii opartej
na RNAi.
data przyjęcia pracy – 9.01.2009
data akceptacji – 16.01.2009