Przegląd metod określania aktywności lipolitycznej enzymów
advertisement
Dyplomant: Agnieszka Kowalska Kierujący pracą dyplomową: dr inż. Monika Wielechowska Przegląd metod określania aktywności lipolitycznej enzymów izolowanych z drożdży Streszczenie Enzymy są naturalnymi katalizatorami przyspieszającymi przebieg lub nadającymi odpowiedni kierunek reakcjom chemicznym. Ze względu na liczne zalety, procesy katalizowane enzymatycznie cieszą się rosnącym z roku na rok zainteresowaniem w przypadku zastosowania przemysłowego. Enzymy lipolityczne, wśród których można wyróżnić karboksyloesterazy (EC 3.1.1.1) oraz lipazy (EC 3.1.1.3), pełnia ważną rolę nie tylko w środowisku naturalnym, gdzie biorą udział w rozkładaniu lipidów, ale również w przemyśle, gdzie dzięki zdolności do katalizowania różnego typu reakcji (hydrolizy, transestryfikacji, interestryfikacji) w zależności od środowiska (wodne lub rozpuszczalników organicznych), znajdują zastosowanie m.in. podczas syntezy związków optycznie czynnych, biopolimerów oraz detergentów. W celu prawidłowego zaplanowania procesu z wykorzystaniem enzymu niezbędna jest znajomość jego aktywności. Celem niniejszej pracy było przedstawienie opisanych w literaturze metod określania aktywności lipolitycznej enzymów izolowanych z drożdży, wśród których można wyróżnić metody oparte na pomiarze ubytku substratu, m.in. nefelometrię, turbidymetrię, metodę płytkową Wilhelmy’go, spektroskopię w podczerwieni z transformacją fourierowską. Znacznie większe możliwości stwarzają metody oparte na pojawianiu się produktów hydrolizy, a wśród nich metody wykorzystujące barwne wskaźniki, metody alkacymetryczne, kolorymetrię, fluorymetrię, chromatografię. Szeroka gama dostępnych technik umożliwia dobranie odpowiedniego sposobu postępowania w zależności od właściwości badanego enzymu, dostępności aparatury, a także preferencji osoby wykonującej pomiary. Część doświadczalna pracy została poświęcona metodom spektrofotometrycznym, za pomocą których określano aktywność enzymów izolowanych z drożdży z rodzaju Candida. Zastosowano estry p-nitrofenolu palmitynian, maślan, propionian, octan, laurynian oraz kapronian, za pomocą których określa się specyficzność substratową enzymów. Analizując uzyskane wyniki można zauważyć, iż nawet w przypadku stosowania tego samego substratu, ale w innych warunkach (inny bufor, rozpuszczalnik, dodatki typu guma arabska i Triton X-100, sposób zatrzymania reakcji enzymatycznej) uzyskiwano różne wartości aktywności. W niektórych przypadkach przeprowadzenie pomiarów spektrofotometrycznych okazało się niemożliwe ze względu na zachodzącą samoistnie hydrolizę substratu. Biorąc pod uwagę prostotę wykonania, i wiarygodność uzyskanych wyników, najlepsza okazała się metoda, w której w roli substratu zastosowano roztwory palmitynianu oraz maślanu p-nitrofenylu w izopropanolu, środowisko reakcji stanowił 1/15 M bufor fosforanowy pH 7,2, a do zatrzymania reakcji enzymatycznej wykorzystano mieszaninę aceton-etanol (1:1 (v/v)) oraz roztwór inhibitorów proteaz.
