Enzymy wskaźnikowe

Enzymy
Izoenzymy, izoformy, makroenzymy
Enzymy w diagnostyce laboratoryjnej
Znaczenie enzymów w diagnostyce klinicznej
zmiany aktywności enzymów we krwi – odbicie zmian zachodzących w narządach
rodzaj uszkodzenia determinuje rodzaj enzymów uwalnianych z uszkodzonej
tkanki
- „konstelacja zmian enzymatycznych”
uszkodzenie narządu = uszkodzenie struktur komórkowych
lub zmiana przepuszczalności błon komórkowych
ucieczka enzymów
spadek syntezy enzymów
zwiększenie
zmniejszenie
ich ilości w płynach ustrojowych i wydalinach
Izoenzymy
enzymy katalizujące tę samą reakcję, które występują w różnych
tkankach/typach komórek, mogą różnić się strukturą cząsteczki
produkty różnych, choć blisko spokrewnionych genów
różne właściwości fizyczne i chemiczne:
punkt izoelektryczny
ruchliwość elektroforetyczna
powinowactwo do substratów
wrażliwość na czyniki regulatorowe
wykrywanie: bad. aktywności po zablokowani za pomocą mAb
niepożądanych izoenzymów
dotyczy dehydrogenaz, oksydaz, aminotransferaz, fostataz i proteaz.
znacznie zwiększa swoistość tkankowa niż ta, którą można
przypisać ich aktywności enzymatycznej!
Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)
enzym cytoplazmatyczny, wyst. we wszystkich komórkach organizmu
katalizuje odwracalną reakcję mleczan ←→pirogronian
największa aktywność w tkankach o wysokim metabolizmie energetycznym
mózg, mięsień sercowy,
erytrocyty, leukocyty, płytki krwi (hemoliza ↑akt.)
nerki, wątroba, płuca
występuje 5 izoenzymów
wykrywanie:
elekroforeza (różna ruchliwość elektroforetyczna poszczególnych
izoenzymów)
dla LDH1 – reakcja z β-hydroksymaślanem (swoisty substrat) – kiedyś w
diagnostyce zawału mm sercowego
Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)
cząsteczka zbudowana z 4 podjednostek – tetramer
dwie różne podjednostki syntetyzowane w organizmie:
M – typu mięśniowego, (ang. muscle); gen LDHA (chr. 11)
H – typu sercowego (ang. heart); gen LDHB (chr. 12)
geny LDHA i LDHB podlegają różnej ekspresji w różnych tkankach
w różnych tkankach różne ilości różnych podjednostek enzymu
wytwarzane
rożne połączenia podjednostek – 5 izoenzymów:
LDH1 – HHHH
LDH2 – HHHM
LDH3 – HHMM
LDH4 – HMMM
LDH5 – MMMM
Dehydrogenaza mleczanowa (LDH)
w surowicy ludzkiej obecne wszystkie izoenzymy LDH
ich proporcje zmieniają się w różnych stanach chorobowych, w
zależności od tego, które izoenzymy są produkowane przez uszkodzony
narząd
u osób zdrowych - LDH2>LDH1
zawał serca, uszkodzenie mięśnie szkieletowych – LDH1>LDH2
anemia hemolityczna - ↑LDH1, ↑LDH2, LDH2>LDH1
dystrofia mięśniowa, nowotwory, ch. wątroby - ↑LDH4, ↑LDH5
(10-20x)
zawał serca z niewydolnością w krążeniu wrotnym – ↑LDH1,
↑LDH2, ↑LDH5
nasieniak najądrza – ↑ LDH1 izolowany
Izoformy enzymów
produkty tego samego genu
katalizują tę samą reakcję chemiczną
inna budowa cząsteczki enzymu na skutek:
zmian posttranslacyjnych struktury białka
fosfataza alkaliczna (ALP) – izoformy kostna i wątrobowa
degradacji proteolitycznej po ich wydzieleniu do pł.śródtkankowego i
osocza
kinaza kreatynowa – CKMM1, CK-MM2, CK-MM3, CK-MB1, C-MB2
wykrywanie: elektroforeza, oznaczenia immunochemiczne z użyciem
przeciwciał moloklonalnych
Fosfataza zasadowa (ALP)
hydrolaza – odszczepia monofosforany od reszt organicznych w
środowisku silnie zasadowym (pH 10)
białko zewnętrznej błony plazmatycznej lub w kompleksach z innymi
białkami błonowymi
funkcja:
transport jonów fosforanowych przez błony
uczestniczy w interakcji między osteoblastami a macierzą
nieorganiczną
transport IgG z osocza matki do płodu (?)
występują izoenzymy, izoformy i frakcje
hemoliza, tłusty posiłek, menstruacja, doustne estogeny –
podwyższenie akt. ALP
Fosfataza zasadowa (ALP)
1. Izoenzym tkankowo niespecyficzny
wyst. praktycznie w każdej tkance
cztery izoformy (glikozylacja): kostna, wątrobowa i nerkowa
izoforma kostna
uwalniana przez aktywne osteoblasty
dominuje u dzieci w okresie wzrostu
wzrost akt. w chorobach kości (osteomalacja, krzywica, osteoporoza)
wzrasta w okresie rekonwalescencji, podczas zrastania kości, po
zabiegach operacyjnych
Obecnie oznacza się masę izoformy tech. immunoenzymatycznymi
Fosfataza zasadowa (ALP)
izoforma wątrobowa
produkowana przez hepatocyty
wzrost akt. w chorobach wątroby i cholestazie
w cholestazie i przerzutowych guzach wątroby pojawać się
mogą frakcje (nawet, gdy całkowita ALP w normie)
f. żółciowa – wielonzymatyczny kompleks błonowy
f. makromolekularna – kompleks e. z lipoproteiną X
izoforma nerkowa
nie wyst. u osób zdrowych
w chorobach nerek (bez znaczenia diagnostycznego)
Fosfataza zasadowa
(ALP)
1. Izoenzym tkankowo niespecyficzny
2. Izoenzym jelitowy
gr. krwi O i B
produkowana przez enterocyty
wzrost w chorobach wątroby: przewlekłe zap. wątroby, marskość
(osłabione usuwanie przez wątrobę)
3. Izoenzym komórek zarodkowych
nie obecny w osoczu osób zdrowych
ektopowo w nowotworach zarodkowych, przysadki i grasicy
4. Izoenzym łożyskowy
fizjologicznie u ciężarnych, od II trymestru, zanika wkrótce po porodzie
ektopowo w nowotworach płuc, jajnika, macicy, jąder, ukł.
żołądkowo-jelitowego
Makroenzymy
enzymy występujące we krwi, które tworzą kompleksy o dużej masie
cząsteczkowej poprzez:
polimeryzację
łączenie z immunoglobulinami (IgG, rzadziej IgA) lub lipidami
prawdopodobnie związane z powstawaniem autoprzeciwciał,
niekiedy u chorych z nowotworami
u 1,5 – 2,5% populacji ogólnej, najczęściej u osób starszych
dotyczy przede wszystkim amylazy i aminotransferazy asparaginowej (AspAT)
najczęściej zjawisko niezwiązane z chorobą
kiedy? - izolowana, kilkakrotnie stwierdzana podwyższona aktywność enzymu bez
objawów klinicznych lub z symptomami nietypowymi dla danej enzymopatii
duża masa cząsteczkowa → osłabiona filtracja kłębkowa → wydłużony czas
półtrwania → podwyższona aktywność
wykrywanie: strącanie makromolekuł glikolem etylenowym, HPLC, elektroforeza
Klasyfikacja enzymów
ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji
EC 1 – oksydoreduktazy
EC 2 – transferazy
EC 3 – hydrolazy
EC 4 – liazy
EC 5 – izomerazy
EC 6 – ligazy (syntetazy)
ze względu na sposób, w jaki dostają się ne do przestrzeni pozakomórkowej
(podział kliniczny)
e. wskaźnikowe
e. sekrecyjne
e. ekskrecyjne
Enzymy wskaźnikowe (indykatorowe)
enzymy wewnątrzkomórkowe
uwalniane w wyniku uszkodzenia bł. komórkowej lub rozpadu komórki –
wzrost aktywności we krwi
zawartość enzymu wskaźnikowego w pł. pozakomórkowym jest zależna od:
jego ilości w uszkodzonej tkance
liczby uszkodzonych komórek i stopnia ich uszkodzenia
rozmieszczenia wewnątrzkomórkowego enzymów
przykłady:
kinaza kreatynowa (CK)
dehydrogenza mleczanowa (LDH)
aminotrasferazy asparaginianowa (AspAT) i alaninowa (AlAT)
Aminotransferaza alaninowa (AlAT, ALT)
występowanie:
cytoplazma komórek wątroby
komórki ścian cewek nerkowych
mięśnie poprzecznie prążkowane, w tym serce
w niewielkich ilościach – wszystkie tkanki (hemoliza zawyża wynik)
fizjologicznie niewielkie ilości w osoczu, pł. mózgowo-rdzeniowym, moczu
wzrost akt. w osoczu – gł. przyczyny wątrobowe
uszkodzenie wątroby (stany zapalne, gł. zakażenia HBV, HCV,
poalkoholowe, toksyczne uszkodzenia)
uszkodzenie mięśni szkieletowych (urazy, niedokrwienie, mioliza)
zawał serca
często oznacza się wraz z akt. aminotransferazy asparaginianowej (AspAT)
– wskaźnik de Ritisa
Enzymy sekrecyjne
fizjologicznie wydzielane do pł. pozakomórkowego, np. do krwi
tam pełnia swą funkcję - funkcjonalne enzymy osocza
niewydolność
narządu
produkującego
i
wydzielającego
powoduje obniżenie ich aktywności (synteza na rybosomach
wątroby)
przykłady:
czynniki krzepniecia i fbrynolizy
esteraza cholinowa
ceruloplazmina
lipaza lipoproteinowa
Cholinoesteraza, pseudocholinoesteraza (ChE)
katalizuje hydrolizę estrów choliny do choliny i kw. tłuszczowego
acetylocholinesteraza (AchE) ukł. nerwowego i erytrocytów, rozkłada
acetylocholinę
pseudocholinoeateraza (ChE) – produkowana przez wątrobę, wydzielana do
krwi, funkcja nieznana
znaczenie diagnostyczne:
diagnostyka/monitorowanie osób narażonych na kontakt ze związkami
fosforoorganicznymi (niodwracalne inhibitory AchE)
↓ aktywności
miąższowe choroby wątroby
niedożywienie
wstrząs pourazowy
terapia promieniami X, lekami cytotoksycznymi
Enzymy ekskrecyjne
produkowane przez gruczoły i wydzielane do wydzielin ustrojowych:
śliny
światła przewodu pokarmowego (żółć, sok trzustkowy)
płynu nasiennego
ich pojawienie się w osoczu świadczy o zaburzeniu procesu wydzielania
(zastój wydzieliny) i/lub niszczeniu struktury gruczołu
przykłady:
amylaza
lipaza
fosfataza zasadowa
γ-glutamylotranspeptydaza
α-amylaza i lipaza
enzymy ekskrecyjne
lipaza – trzustka, zoładek, jelita
α-amylaza – trzustka, ślinianki , wątroba, mięśnie, neutrofile
↑ akt. amylazy
ostre zapalenie trzustki (max. ↑ po 12 h., potem ↓ - wyczerpanie
zdolności wydzielniczej trzustki
kolka nerkowa
kolka zółciowa
perforacja wrzodu
niedrożnośc jelit
zapalenie ślinianek (izoenzym śliniankowy)
↑ akt. Lipazy
proces zapalny trustki (wyższa swoistośc narżdowa niż amylaza)
hemoliza – zaniża akt. lipazy
α-amylaza i lipaza
MAKROAMYLAZEMIA
stan nie związany z chorobą
↑ akt. we krwi bez ↑ w moczu
polimeryzowanie cz. enzymu lub łączenie się z immunoglobulinami
duże kompleksy białkowe nie przechodzą do moczu
Triacyloglicerole (hipertriglicerydemia) hamują aktywność amylazy
Amylaza w moczu
odzwierciedla akt. we krwi
monitorowanie przebiegu ostrego zapalenia trzustki
Oznaczanie enzymów
Pośrednio - aktywność
badanie przemiany chemicznej substratu katalizowanej przez dany enzym
pomiar ilości enzymu w układzie na podstawie pomiaru szybkości reakcji
w określonych warunkach szybkość reakcji jest proporcjonalna do
ilości enzymu
szybkość reakcji wyrażona jako ubytek substratu lub przyrost produktu
szybkość rekcji maleje z czasem (hamujący wpływ produktu, stopniowa
inaktywacja enzymu) → mierzona jest prędkość początkowa vo ,
dostateczni duże stężenie substratu dla wysycenia enzymu
prędkość początkową – przed utworzeniem dostatecznej ilości produktu
umożliwiającej zachodzenie reakcji odwrotnej
Bezpośrednio - masa
oznaczanie ilości białka enzymatycznego met. immunochemicznymi
Badanie aktywności enzymatycznej
w płynach ustrojowych
surowica/osocze
mocz
płyn mózgowo-rdzeniowy
aktywność w surowicy/osoczu <<< aktywność w tkankach (także w kwinkach) –
surowica z hemolizą – wyniki zawyżone
białka osocza, składniki surowicy (w tym leki) mogą być aktywatorami/inhibitorami
reakcji enzymatycznych
antykoagulanty (heparyna, fluorek) – pływ +/- na akt. enzymów
izoenzymy – różne powinowactwo do substratu i maks. aktywność przy różnych
stężeniach substratu
niekiedy krótki czas, w którym obserwuje się zmiany akt. enzymatycznej związane
ze stanem chorobowym
Jednostki aktywności enzymatycznej
Katal (kat)
ilość enzymu katalizująca przemianę 1 mola substratu w czasie 1 sekundy
układ SI; [mol/s]
duża jednostka → używane mikro- , nano-, pikokatal
Jednostka enzymu, jednostka enzymatyczna,
międzynarodowa jednostka standardowa (U, ang. unit)
ilość enzymu katalizująca przemianę 1 μmola substratu (lub odpowienich
grup chemicznych) w czasie 1 minuty w warunkach standardowych
(30°C, optymalne pH, maksymalne wysycenie enzymu substratem)
1U = 1/60 μkatala = 16,67 nanokatala
Jednostki aktywności enzymatycznej
Aktywność właściwa
liczba jednostek enzymu na 1 mg białka
określa czystość preparatu enzymatycznego
Aktywność molekularna
liczba cząsteczek substratu (lub odpowiednich grup chemicznych)
przekształconych przez 1 cząsteczkę enzymu w ciągu 1 minuty (przy
optymalnym stężeniu substratu)
Stężenie aktywności enzymatycznej w roztworze – kat(lub U)/1 ml roztworu
Test optyczny Warburga
wykorzystuje różnice w absorpcji światła o dł. fali 340 nm między
formą utlenioną a zredukowaną NAD i NADP
utenianie/redukcja NAD+/NADH → proporcjonalny spadek/wzrost
absorbancji przy 340 nm
Pierścienie purynowy
i pirmidynowy
Pierścień
pirydynowy w
amidzie kw.
nikotynowego w
NADH – układ
dihydropirydy
Test optyczny Warburga
ilościowa analiza dehydrogenaz zależnych od NAD+ i NADP+
lub innych enzymów o reakcjach sprzężonych z dehydrogenazami
aktywność heksokinazy
proporcjonalna do
wzrostu
absorbancji przy
340 nm