Ćwiczenie 1 Oksydoreduktazy i transferazy. ENZYMOLOGIA
advertisement
ENZYMOLOGIA Wydział Nauk o Żywności i Rybactwa Centrum Bioimmobilizacji i Innowacyjnych Materiałów Opakowaniowych ul. Klemensa Janickiego 35 71-270 Szczecin Ćwiczenie 1 Oksydoreduktazy i transferazy. Ogólne właściwości enzymów Ćwiczenie 1. Oksydoreduktazy i transferazy. Ogólne właściwości enzymów Reakcje chemiczne w organizmie są zawsze przyspieszane przez swoiste katalizatory komórkowe, zwane biokatalizatorami lub enzymami. Enzymy nie zmieniają końcowego składu mieszaniny reagującej ani stałej równowagi danej reakcji, przyspieszają jedynie osiągnięcie stanu równowagi w reakcjach termodynamicznie możliwych. Są to reakcje egzoergiczne, którym towarzyszy utrata energii swobodnej (∆G ma znak ujemny). Enzymy są złożonymi, wielkocząsteczkowymi katalizatorami o charakterze białkowym wytwarzanymi wyłącznie przez żywe komórki (ale mogą działać poza komórkami) i odznaczającymi się dużą swoistością w przyspieszaniu lub nadawaniu odpowiedniego kierunku reakcjom chemicznym. Pod względem chemicznym wszystkie poznane dotąd enzymy należą do białek prostych lub złożonych. Zasadniczą częścią składową enzymów jest tzw. grupa czynna, warunkująca łączenie się enzymu z substratem. Ze względu na budowę chemiczną wyróżnia się 3 kategorie enzymów: l) Enzymy jako białka proste zbudowane tylko z aminokwasów. Rolę grupy czynnej spełniają specyficzne zespoły aminokwasów, których nie można odszczepić bez zmiany struktury białka, a więc bez zniszczenia enzymu jako substancji katalitycznej. Należą tu enzymy proteolityczne oraz amylaza, ureaza, aldolaza, czy RNaza. 2) Enzymy jako białka złożone, zawierające nieaminokwasowe grupy chemiczne trwale związane z cząsteczką białkową, tzw. grupy prostetyczne. Oddzielenie ich i ponowne złączenie nie zawsze prowadzi do odtworzenia katalitycznie czynnego enzymu. Należą tu takie enzymy, jak np. oksydaza cytochromowa, katalaza lub peroksydaza, w których grupą prostetyczną, spełniającą rolę czynnej grupy katalitycznej jest żelazoporfiryna. 3) Enzymy należące do białek złożonych, zawierające nieaminokwasowe grupy związane luźno z cząsteczką białkową, których nie można traktować jako integralnych części enzymów na podobieństwo grup prostetycznych. Obie części składowe dają się łatwo od siebie oddzielić za (m.in. pomocą zwykłej dializy) i każda z nich jest katalitycznie nieczynna, a złączone ze sobą (np. dializat z pozostałością) dają ponownie aktywny enzym. Takie grupy chemiczne nazywane są koenzymami; część białkowa zwie się wówczas apoenzymem, a całość, czyli aktywny enzym - holoenzymem. Należą tu m.in. dehydrogenazy, których koenzymem może być dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+) lub jego fosforan (NADP+). Grupy prostetyczne i koenzymy są odporne na ogrzewanie i mają różną budowę. Mogą to być nukleotydy, witaminy, związki hemu, metale, pochodne cukrów czy kwasów tłuszczowych. Ugrupowania te łączą się z białkiem różnymi wiązaniami: kowalencyjnymi, koordynacyjnymi, wodorowymi, jonowymi czy przez siły van der Waalsa. Bardzo częste jest wiązanie przez metal, przeważnie dwuwartościowy, jak Mg, Mn, czy Zn. Na przykład Zn, 2 mający liczbę koordynacyjną 6, w dehydrogenazie alkoholowej wiąże się Z NAD+ dwiema wartościowościami koordynacyjnymi, z apoenzymem - trzema dalszymi, a szóstą - z substratem, tj. alkoholem (rys. 1). W wielu enzymach koordynacyjnie związany metal stanowi jego grupę prostetyczną, niezbędną do pełnienia funkcji katalitycznej (metaloenzymy). Rys. 1. Udział metalu w wiązaniu enzymu z substratem (Kłyszejko-Stefanowicz, 2003) Od części białkowej zależy specyficzność w stosunku do substratu (jaki rodzaj substratu ulega przemianie), a ponadto białko decyduje również o kierunku reakcji. Istotnie, te same grupy prostetyczne, czy koenzymy mogą brać udział w różnych reakcjach chemicznych, zależnie od białka, z którym są związane, np. katalaza i peroksydaza. Specyficzność enzymu zależy więc od komponentu białkowego. Grupa prostetyczna czy koenzym są tylko narzędziem pozwalającym na przetwarzanie takiego czy innego materiału. Biorą one istotny udział w działaniu enzymu, wyznaczając typ reakcji, decydując np. jakie atomy czy grupy chemiczne mogą być przenoszone z donora na akceptor. Zarówno grupy prostetyczne, jak i koenzymy biorą udział w katalizowanym procesie, ulegając przy tym przekształceniu i tym samym nie odpowiadają definicji katalizatora, ponieważ nie wychodzą z reakcji niezmienione. Wracają one do stanu pierwotnego dopiero na skutek wtórnej reakcji, która zachodzi inaczej w przypadku grupy prostetycznej, a inaczej koenzymu. Na ogół w reakcjach enzymatycznych biorą udział dwa substraty i enzym. Substratem przyjęto nazywać związek, który jest przetwarzany przez enzym, natomiast drugi – kosubstratem. Wiele kosubstratów biologicznych występuje w bardzo małych stężeniach, często rzędu stężeń samych enzymów. Takie kosubstraty noszą nazwę koenzymów. Odgrywają one rolę akceptorów czy donorów wodoru lub grup atomów. NAD+ przyjmuje np. wodór od substratu, a ATP dostarcza reszty fosforanowej w reakcji katalizowanej przez glukokinazę: Z tych reakcji widać, że oba koenzymy, zarówno NAD+, jak i ATP, funkcjonują jako drugi substrat,· który ulega wymianie z substratem właściwym w stosunkach stechiometrycznych, 3 tzn. 1 mol/1 mol, a bynajmniej nie katalitycznie. W reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę zredukowany dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH) jest produktem reakcji na równi z pirogronianem i jonem wodorowym. Regeneracja NAD+ ze zredukowanego NAD zachodzi w następnej reakcji katalizowanej przez inny enzym, w której NADH będzie z kolei kosubstratem, ponieważ przekształca się w NAD+ oddając swój wodór stechiometrycznie. Podobnie ADP może znów przekształcić się stechiometrycznie w ATP przyjmując fosforan od wysokoenergetycznego związku: Katalityczne działanie koenzymu przejawia się dopiero w wyniku sprzężenia obydwu enzymów w jeden układ enzymatyczny. Szczególne znaczenie koenzymów w przemianie materii polega na pośredniczeniu między różnymi enzymami, bowiem w organizmie żywym bardzo często ma się do czynienia z ciągami reakcji, w których koenzymy zmienione w jednej reakcji są odtwarzane w następnej. Enzym mający grupę prostetyczną reaguje równocześnie z dwoma różnymi substratami. Na przykład aminokwas ulega pod wpływem enzymu odwodornieniu, wodory zostają przejęte przez grupę prostetyczną przeniesione na cząsteczkę tlenu z wytworzeniem H2O2 (rys. 2). Wprawdzie i tutaj grupa prostetyczna, tj. dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD) przekształca się stechiometrycznie, ale w przeciwieństwie do koenzymu na tym samym białku enzymatycznym odzyskuje pierwotną postać przez reakcję z drugim substratem. Jest to druga różnica (oprócz trwałości wiązania z białkiem) między grupą prostetyczną a koenzymem. Rys. 2. Odwracalna redukcja FAD w procesie deaminacji aminokwasów (KłyszejkoStefanowicz, 2003) Zasadniczą funkcją enzymu jest aktywowanie substratu (i ewentualnie koenzymu) przez ustawienie go w przestrzeni w sposób najbardziej sprzyjający oddziaływaniu enzymu. Białko 4 enzymatyczne jest pewnego rodzaju matrycą, na której układa się lub wiąże substrat i kosubstrat. Dany enzym wchodzi w połączenie i aktywuje tylko określone substraty, a reakcja zachodzi nie w dowolnych, lecz w ściśle określonych miejscach na powierzchni enzymu. Swoistość działania enzymów jest miarą stopnia „dopasowania się” enzymu i substratu. Owo „dopasowanie” może być niezupełnie doskonałe, wskutek czego cząsteczka substratu uzyskuje pewne napięcie wewnętrzne, czego wynikiem jest wzrost reaktywności chemicznej, określany jako aktywacja. Fakt, że enzymy reagują tylko z jedną odmianą stereoizomeryczną danego związku, nasuwa przypuszczenie, że połączenie enzymu z substratem zachodzi co najmniej w 3 miejscach. W reakcjach enzymatycznych uzyskuje się zwiększenie szybkości reakcji 106-1011 razy. Przyczyn tego jest kilka. W reakcji nieenzymatycznej znaczny odsetek zderzeń cząsteczek substratu o energii większej od energii aktywacji nie prowadzi do powstania produktu, bo nie następuje zetknięcie się czynnych grup substratów. Natomiast w reakcji enzymatycznej występuje ścisła orientacja przestrzenna reagujących cząsteczek i eliminowana jest przypadkowość sposobu ich zetknięcia. Enzym (E) wiąże się ze swym substratem (S) tworząc kompleks enzym-substrat (ES). Kompleks ES może dysocjować z powrotem do E + S lub przekształcić się w sam E i produkt P. Stałe szybkości k1, k2, k3 opisują szybkości przebiegu każdego etapu katalitycznego. Przyjmuje się , iż reakcja odwrotna, w której enzym i produkt (E + P) byłyby przekształcane w kompleks ES, przebiega z tak małą szybkością, że reakcję tę można pominąć. Ponadto w reakcji enzymatycznej ważną rolę odgrywa aktywowanie substratów w wyniku tworzenia kompleksu enzym-substrat. Występuje często zmiana rozmieszczenia elektronów w reaktywnym wiązaniu tak, że w kompleksie jest ono mniej trwałe od wiązania w samym substracie. Budowa wielkocząsteczkowa enzymu wpływa specyficznie na zmianę rozmieszczenia elektronów w kompleksie ES. Pod wpływem przyłączenia substratu enzym przybiera konformację (ukształtowanie) niezbędną do czynności katalitycznej; ułatwia to zbliżenie i ustawienie w odpowiedniej pozycji substratu i grup czynnych enzymu, a także powoduje wzrost naprężeń w substracie, co prowadzi do rozerwania określonych wiązań. Tylko niewielka część łańcucha białkowego decyduje o katalitycznych właściwościach enzymu. Najistotniejszym elementem budowy enzymów, któremu zawdzięczają aktywność katalityczną, jest centrum aktywne. Jest to zgrupowanie właściwych reszt aminokwasowych o odpowiednim ułożeniu przestrzennym i potencjalnej ruchomości. Z tymi właśnie grupami połączy się substrat. Reszty aminokwasowe wchodzące w skład centrum aktywnego mogą 5 należeć do aminokwasów odległych w sekwencji łańcucha polipeptydowego, a zbliżonych do siebie dzięki jego pofałdowaniom; dlatego czynniki oddziałujące na przestrzenną budowę enzymu mają wpływ na jego funkcję. Większość zmian w konformacji cząsteczek enzymu (struktura II-, III- i IV-rzędowa) prowadzi do utraty możliwości katalitycznych. Na przykład czynniki redukujące czy utleniające powodują powstanie dodatkowych lub rozerwanie istniejących wiązań -S-S-; zmiany wartości pH, zmieniając liczbę ładunków elektrycznych grup dysocjujących, zwiększają lub zmniejszają liczbę wiązań jonowych wewnątrz- i międzyłańcuchowych, co prowadzi do zmian układu łańcucha. Wpływ temperatury wynika ze zwiększonej ruchliwości atomów zarówno środowiska, jak i enzymu. Wzrasta przez to możliwość wytwarzania połączeń, które są mało prawdopodobne w normalnych warunkach, a także przejścia aktywnej konformacji cząsteczki enzymu w konformację nieaktywną, czyli denaturacji enzymu. Z tych rozważań wynika również wpływ aminokwasów nie uczestniczących w budowie centrum, a tylko determinujących konformację cząsteczki, co ma duże znaczenie dla optymalnej struktury centrum aktywnego. Główną rolę w centryum. aktywnym przypisuje się najczęściej takim aminokwasom, jak seryna, cysteina czy histydyna, chociaż mogą uczestniczyć w jego budowie jeszcze lizyna, tyrozyna, metionina, glicyna, kwas asparaginowy i inne. W cząsteczce enzymu należy wyróżnić jeszcze istnienie centrów allosterycznych, które warunkują powinowactwo enzymu do czynników regulujących jego aktywność, a nie do substratu. Klasyfikacja i nazewnictwo enzymów. Swoistą cechą odróżniającą każdy enzym jest katalizowana przez niego reakcja chemiczna i właśnie ona jest podstawą klasyfikacji i nomenklatury enzymów (bierze się pod uwagę pełną, sumaryczną reakcję przedstawioną odpowiednim równaniem). Reakcja ta łącznie z nazwą substratu (substratów) służy za podstawę terminologii poszczególnych enzymów. Enzymy mają z reguły dwie nazwy: systematyczną i potoczną. Nazwa systematyczna musi być tworzona według określonych reguł, powinna identyfikować dany enzym i określać jego działanie. Nazwy potoczne są zwykle krótkie i często tworzone od nazw substratu, m.in. deoksyrybonukleaza, arginaza, amylaza, lipaza, ureaza. Niektóre nazwy potoczne, mimo braku racjonalnego uzasadnienia, utrzymały się ze względu na tradycję, np. pepsyna, trypsyna, chymotrypsyna. Komisja Enzymowa Międzynarodowej Unii Biochemicznej opracowała w 1961 r. zasady klasyfikacji i nazewnictwa enzymów. Według przyjętych zasad, enzymy i katalizowane reakcje podzielono na sześć klas głównych: 1. Oksydoreduktazy — katalizują odwracalne reakcje utleniania i redukcji, a więc przemiany związane z przeniesieniem protonów i elektronów, 6 2. Transferazy — katalizują odwracalne reakcje przeniesienia grup funkcyjnych z donora na akceptor, 3. Hydrolazy — katalizują nieodwracalne reakcje hydrolizy, a więc rozpadu wiązań z jednoczesnym przyłączeniem się jednej czasteczki wody na każde wiązanie ulegające rozpadowi, 4. Liazy — katalizują niehydrolityczny rozpad wiązań (bez pobrania i wydzielania ubocznych produktów), niektóre reakcje są odwracalne 5. Izomerazy — katalizują reakcje przekształceń strukturalnych w obrębie cząsteczki — reakcje odwracalne 6. Ligazy czyli syntetazy — katalizują syntezę trwałych wiązań kowalencyjnych, (np. C-C, C-N, C-S, C-O), z wykorzystaniem wiązań makroergicznych ATP Zgodnie z zaleceniami Międzynarodowej Unii Biochemicznej nazwy systematyczne enzymów składają się z dwóch części. Pierwszą tworzy się od nazwy katalizowanej reakcji, dodając końcówkę -aza. np. hydrolaza, Drugą część tworzy się od nazwy substratu w dopełniaczu - liczby pojedynczej, np. hydrolaza acetylocholiny, karboksyliaza L-tryptofanu itp. Jeśli reagują dwa substraty, to druga część nazwy składa się z dwóch nazw substratów podanych w mianowniku liczby pojedynczej i rozdzielonych dwukropkiem, np. oksydoreduktaza alkohol: NAD. Każdy enzym ma numer międzynarodowej klasyfikacji (EC), składający się z 4 członów oddzielonych kropkami. Człon I oznacza numer klasy, do której należy enzym. Enzymy podzielono na 6 klas: 1) oksydoreduktazy, 2) transferazy, 3) hydrolazy, 4) liazy, 5) izomerazy i 6) ligazy (syntetazy). Człon II - to podklasa. W klasie oksydoreduktaz wskazuje on na rodzaj grupy w donorach ulegającej utlenieniu (-CHOH, aldehydowa, ketonowa itd.); w transferazach - na rodzaj grupy przenoszonej (jednowęglowa, glikozylowa, azotowa itd.); w hydrolazach - na typ wiązania ulegającego hydrolizie (peptydowe, estrowe, glikozyd owe itd); w liazach - typ rozszczepianego wiązania (C-C, C-O, C-N, C-S); w izomerazach - na typ izomeryzacji (cistrans, racemizacja itp.); w ligazach - na typ utworzonego wiązania (C-O, C-S, C-N, C-C). Człon III - to pod-podklasa. W klasie oksydoreduktaz wskazuje na rodzaj akceptora; w transferazach bliżej określa rodzaj przenoszonej grupy (metylowa, aminowa, itp.), a w hydrolazach - typ hydrolizowanego wiązania (estrów karboksylowych, fosforowych itp.); w liazach - charakter chemiczny usuniętej grupy (CO2, H2O, NH3); w izomerazach - charakter przekształcanego związku (aminokwasy, cukry itp.); w ligazach - wskazuje na rodzaj powstałego związku. Człon IV - to kolejny numer enzymu w jego pod-podklasie. 7 Oksydoreduktazy (klasa 1) katalizują wiele istotnych reakcji komórkowych, zwłaszcza dotyczących utleniania biologicznego, które polega na łączeniu się wodoru z tlenem. W komórkach utlenia się jednak nie wodór cząsteczkowy, ale związany przeważnie z koenzymami nikotynamidoadeninowymi, które go pobierają wprost od substratów biologicznych utleniań (glukozy, kwasów tłuszczowych, aminokwasów itp.). Biologiczne utlenianie wodoru polega na przeniesieniu elektronów nie wprost z wodoru na tlen, ale przez wiele biologicznych układów oksydoredukcyjnych. W ten sposób energia uwalnia się małymi porcjami i może być wykorzystana dzięki sprzęgnięciu tych układów z reakcjami magazynującymi energię w sposób chemiczny (ATP). Elektrony są przenoszone w kolejności wyznaczonej przez potencjał oksydoredukcyjny od układów o bardziej ujemnym potencjale w kierunku układów o bardziej dodatnim potencjale. Procesowi biologicznego odłączania elektronów towarzyszy zwykle oddawanie protonów, które utleniany związek odrzuca. Odbiorcą wodorów (elektronów i protonów) jest pośrednio i bezpośrednio tlen atmosferyczny. Tlen przyjmując elektrony redukuje się do jonu tlenkowego, który łączy się z protonami w cząsteczkę H2O. Przyjmując za kryterium mechanizm działania, enzymy klasy oksydoreduktaz (14 podklas) można ująć w 4 umowne grupy: oksydazy, oksygenazy, dehydrogenazy i hydroperoksydazy. l. Oksydazy katalizują odrywanie się elektronów od utlenianego substratu i dwu lub czteroelektronową redukcję cząsteczki tlenu. Po połączeniu się z protonami powstaje cząsteczka H2O2 lub H2O. Z uwagi na ten końcowy produkt katalizowanej reakcji wyróżnia się 2 zespoły oksydaz. Mechanizm działania oksydaz I zespołu, w których grupą czynną jest metal, np. miedź, przedstawia rys. 3. Do tego zespołu należą oksydazy mono- i polifenoli, askorbinianu, oksydaza cytochromowa itp. Rys. 3. Schemat działania oksydaz I (Kłyszejko-Stefanowicz, 2003) Oksydazy ziemniaka. Enzymy te przenoszą elektrony bezpośrednio na tlen atmosferyczny. Substratem w reakcjach utleniania mogą być m.in. o- i p-difenole; utlenia się także fenol. Powstają chinony, a w wyniku ich kondensacji tworzą się barwne pochodne. Oksydaza fenolowa, zwana również oksydazą polifenolową, tyrozynazą lub katecholazą, jest metaloproteiną i zawiera miedź, która przyjmuje elektrony od difenoli i przekazuje je na tlen cząsteczkowy (rys. 4). 8 Rys. 4. Utlenianie pirokatechiny przez oksydazy (Kłyszejko-Stefanowicz, 2003) Grupą prostetyczną oksydaz II zespołu jest dinukleotyd flawinoadeninowy występujący bardzo często obok metali (Fe, Cu, Mo), które biorą udział w przenoszeniu elektronów z FADH2 na tlen z wytworzeniem H2O2 (rys. 5). Tlen cząsteczkowy może tu być zastąpiony innym akceptorem, np. błękitem metylenowym. Przykładem enzymów tego zespołu mogą być oksydazy aldehydów, aminokwasów, oksydaza ksantynowa, moczanowa i in. Rys. 5. Schemat działania oksydaz II (Kłyszejko-Stefanowicz, 2003) 2. Oksygenazy katalizują proces wbudowywania O2 w cząsteczkę. Wyróżnia się oksygenazy właściwe i hydroksylujące. 3. Dehydrogenazy katalizują odrywanie atomów wodoru od utlenianego substratu i przenoszą je na inne enzymy czy związki pośrednie, a nie mają zdolności, przenoszenia elektronów bezpośrednio na tlen. Różnią się rodzajem koenzymu, który jest właściwym akceptorem atomów wodoru. Może być nim: NAD, NADP+, FMN, FAD lub liponian. Dehydrogenazy te wykazują specyficzność zarówno w stosunku do substratów, jak i koenzymów. Z NAD+ współpracują m.in. dehydrogenazy: aldehydu 3-fosfoglicerynowego, 2glicerofosforanu (rozpuszczalna) mleczanu, jabłczanu, 3-hydroksymaślanu, glutaminianu, a do współdziałających z NADP+ - dehydrogenazy: glukozo-6-fosforanu, izocytrynianu itp. Dehydrogenazy nie wymagające udziału NAD+ ani NADP+ to najczęściej: dehydrogenazy flawinowe, np. dehydrogenaza 2-glicerofosforanu (nierozpuszczalna), bursztynianu, acyloCoA, bądź liponianowe (dehydrogenaza pirogronianu i 2-oksoglutaranu). 4. Hydroperoksydazy obejmują dwie podgrupy enzymów: peroksydazy (przeważają w tkankach roślinnych) i katalazy (w tkankach zwierzęcych). Są to białka zawierające żelazoporfirynę. Schemat reakcji katalizowanych przez hydroperoksydazy przedstawiono na rys. 6. 9 Rys. 6. Schemat działania katalazy i peroksydazy (Kłyszejko-Stefanowicz, 2003) Transferazy (klasa 2). Enzymy tej klasy katalizują reakcje przeniesienia grup między związkami i to zwykle z udziałem specyficznych koenzymów. Typowymi przedstawicielami są: aminotransferazy, fosfotransferazy (kinazy), acylotransferazy i glikozylotransferazy, katalizujące odpowiednio przeniesienie grupy aminowej, fosforanowej, acylowej lub glikozylowej. Duże znaczenie mają enzymy przenoszące grupy jednowęglowe (C1), z których najważniejsze to metylotransferazy, hydroksymetylotransferazy i formylotransferazy. Nazwa enzymów tej klasy powinna zawierać określenie grupy przenoszonej, dawcy oraz akceptora. Na przykład prawidłową nazwą heksokinazy jest 6-fosfotransferaza ATP : D-heksoza. Zastosowanie w technologii żywności enzymów z klasy oksydoreduktaz Preparaty (zwykle pochodzenia bakteryjnego) zawierające katalazę, tj. enzym z kategorii hydroperoksydaz, znajdują zastosowanie przy rozkładzie np. wody utlenionej, która w krajach tropikalnych bywa dodawana w stosunku ok. 0,03% (jako czysty H2O2) do surowego mleka w celach konserwujących. Po spełnieniu swej funkcji nadtlenek wodoru jest rozkładany przez katalazę dodaną do mleka bezpośrednio przed jego pasteryzacją katalaza 2 H2O2 ———→ 2H2O + O2 Ostatnio dość powszechne zastosowanie znajduje enzym oksydaza glukozowa (należący do enzymów flawinowych - dehydrogenaz) w połączeniu z katalazą. Mianowicie β-Dglukopiranoza zostaje utleniona pod wpływem oksydazy glukozowej do laktonu kwasu glukonowego, który po przyłączeniu wody przechodzi w kwas glukonowy. Odłączone od glukozy atomy wodoru są przekazywane za pośrednictwem dwunukleotydu f1awinoadeninowego (w skrócie FAD) lub mononukleotydu flawinowego (FMN) hezpośrednio na tlen z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Ogólnie utlenianie glukozy można przedstawić w postaci sumarycznej reakcji oksydaza glukozowa C5H11O5 ∙ CHO + H2O ———————→ C5H11O5 ∙ COOH + H2O2 przy czym powstały nadtlenek wodoru jest rozkładany przez katalazę. W rezultacie ilość tlenu biorącego udział w reakcji ulega zmniejszeniu do połowy, gdyż zostaje on zużyty do 10 utleniania glukozy. W dalszych reakcjach tego typu tlen z czasem zużywa się całkowicie do utlenienia glukozy. Reakcje te wykorzystuje się w technologii żywności: - do zużywania resztek glukozy (zlikwidowania w niej reaktywnej grupy aldehydowej) w celu zapobieżenia niepożądanym reakcjom kondensacyjnym między aldozami i wolnymi grupami aminowymi białek (związki Maillarda), powodującymi ciemnienie i niekorzystne zmiany zapachowe; przykładem może tu być suszona masa jajowa; - do usuwania resztek tlenu, np. z soków owocowych - w celu lepszego zachowania witaminy C i zabezpieczenia przed brunatnieniem lub z majonezów w celu zahamowania autooksydacji tłuszczu. Oksydaza glukozowa łącznie z katalazą - w postaci tzw. pakietów antyoksydacyjnych - jest wprowadzana także do niektórych produktów suchych łatwo utleniających się i pakowanych hermetycznie. Część doświadczalna Ćwiczenie 1. Oksydoreduktazy i transferazy. Ogólne właściwości enzymów Otrzymanie ekstraktu z ziemniaka: Obrać jednego ziemniaka i zetrzeć na tarce. Miazgę zawiesić w 50 ml wody destylowanej, a następnie wyciąg wodny wycisnąć przez gazę (do zlewki o poj. 400 cm3). Po opadnięciu skrobi płyn zdekantować i użyć do przeprowadzenia doświadczeń. 1) BADANIE AKTYWNOŚCI OKSYDAZY FENOLOWEJ W EKSTRAKCIE Z ZIEMNIAKA (oksydoreduktaza) Do badania aktywności oksydazy fenolowej przygotować próby, jak podano w tabeli: Nr probówki 1 2 3 wyciąg z ziemniaka (ml) 1 1 woda destylowana (ml) fenol 1% (ml) 5 - 1* wyciąg z ziemniaka należy przegotować przed dodaniem kolejnych roztworów 4 1 4 1 Próby inkubować w 37°C przez 40-50 minut mieszając od czasu do czasu. Obserwować zmianę zabarwienia. Wyjaśnienie: Oksydaza fenolowa (oksydoreduktaza o-difenol: tlen EC.1.10.3.1) działa na o-difenole i monofenole w myśl reakcji: 11 Reakcja katalizowana przez oksydazę fenolową W próbówce nr 3 podczas inkubacji dochodzi do utleniania wprowadzonego do probówki fenolu przy udziale oksydazy fenolowej. Barwa powstających produktów utleniania fenolu zmienia się od różowej do ciemnobrunatnej – z fenolu powstaje pirokatechina, która utleniana jest następnie do o-chinonu ulegającemu dalszym przemianom do ciemno zabarwionej melaniny. W probówce nr 2 nastąpiła denaturacja enzymu – reakcja nie zachodzi. W wyciągu ziemniaczanym obecne są endogenne związki typu o-difenoli, które podczas dość długiej inkubacji również ulegają utlenieniu, co może prowadzić do zmiany zabarwienia w probówce nr 1. Podobną reakcję obserwuje się np. na obranym ziemniaku, który po pewnym czasie sinieje, z tego samego powodu jabłko obrane ze skórki w krótkim czasie brązowieje. 2) ENZYMY ROZKŁADAJĄCE NADTLENEK WODORU Nadtlenek wodoru (H2O2) jest silnym inhibitorem układów enzymatycznych a jego nagromadzenie może sprzyjać tworzeniu się wolnych rodników, które z kolei mogą uszkadzać błony komórkowe i materiał genetyczny komórek oraz prowadzić do powstawania nowotworów. W związku z powyższym organizmy żywe posiadają aktywne mechanizmy zdolne do rozkładu nadtlenku wodoru. Do enzymów biorących udział przy usuwaniu H2O2 z komórki należą peroksydazy i katalazy, które należą do hemoprotein. Katalaza występuje powszechnie w organizmach tlenowych, głównie u zwierząt: w wątrobie, nerkach, krwi, szpiku, błonach śluzowych. Peroksydazy są to enzymy głównie roślinne, rzadziej zwierzęce. 2.1) WYKRYWANIE PEROKSYDAZY W ZIEMNIAKU (oksydoreduktaza) Przygotować 2 probówki, wprowadzić do nich po 2 ml wyciągu z ziemniaka, zawartość jednej z probówek zagotować. Do probówek dodać po 0,5 ml fenolu, a następnie 0,5 ml 3% H2O2. Zawartość probówek wymieszać i obserwować zmianę zabarwienia (zmiana zabarwienia następuje o wiele szybciej niż w zadaniu 1, gdyż jednocześnie działa oksydaza i peroksydaza). 12 Wyjaśnienie: Peroksydazy nie rozkładają nadtlenku wodoru a pośredniczą jedynie w utlenianiu substratów (katalizują przeniesienie odłączonych atomów wodoru z substratów, zwykle aromatycznych na H2O2), zgodnie z reakcją ogólną: H2O2 +AH2 → 2H2O + A Substratami dla peroksydaz są najczęściej fenole: H2O2 + fenole → 2H2O + chinony 2.2) BADANIE AKTYWNOŚCI KATALAZY W EKSTRAKCIE Z ZIEMNIAKA (oksydoreduktaza) Do dwóch probówek odmierzyć po 1 ml ekstraktu z ziemniaka. W jednej z probówek enzym zinaktywować, wstawiając ją na 5 minut do wrzącej łaźni wodnej, po czym do obydwu probówek dodać po 1 ml 3% roztworu nadtlenku wodoru. Obserwować wynik reakcji. Wyjaśnienie: Katalaza (oksydoreduktaza nadtlenek wodoru: nadtlenek wodoru) katalizuje rozkład H2O2 na wodę i tlen w myśl reakcji: 2 H2O2 → 2 H2O + O2 W czasie reakcji pojawia się gazowy tlen w postaci pęcherzyków. Katalaza wykazuje również aktywność peroksydazy, tzn. może katalizować oderwanie atomów wodoru od substratów organicznych i tylko przy ich małym stężeniu działa jak katalaza właściwa. 2.3) WYKRYWANIE AKTYWNOŚCI KATALAZY W WYBRANYCH OWOCACH I WARZYWACH Materiały i odczynniki: - probówka typu Falcone o poj. 50 ml - 3% roztwór nadtlenku wodoru - ziemniak, burak, marchew, jabłko lub kapusta – „zestaw dnia” układa prowadzący - płyn do mycia naczyń 1. Do zlewki należy nalać 30 ml roztworu nadtlenku wodoru, następnie dodać 5 ml mieszaniny płynu do mycia naczyń (trzy krople płynu do mycia naczyń wymieszać z 30 ml wody destylowanej). Całość delikatnie zamieszać, uważając by nie powstała piana. 2. Do każdej probówki należy nalać po 10 ml roztworu przygotowanego w punkcie 1. 3. W probówce nr 1 należy umieścić kawałek (ok. 1,5 g) ziemniaka, w probówce nr 2 kawałek (ok. 1,5 g) buraka/marchwi a w probówce nr 3 kawałek (ok. 1,5 g) jabłka i włączyć stoper. Całość delikatnie zamieszać. 4. Zanotować, jaki jest poziom cieczy po umieszczeniu w probówkach kawałka warzywa/owocu, a następnie sprawdzić i zanotować poziom cieczy (razem z powstającą pianą) w poszczególnych probówkach po 5, 10, 20, 30 minutach. 13 Wyjaśnienie: Katalaza występuje w komórkach organizmów tlenowych. Katalaza występuje np. w komórkach krwi u ludzi – jej działanie możemy zaobserwować w momencie skaleczenia, kiedy ranę polejemy wodą utlenioną (zauważymy pianę). Katalaza występuje również w wielu owocach i warzywach, przy czym jej ilość i aktywność w poszczególnych przypadkach jest zróżnicowana. Awokado, kiwi, brzoskwinie, wiśnie, morele, banany, arbuzy i ananasy posiadają duże ilości katalazy, natomiast mniej omawianego enzymu występuje w jabłkach i winogronach. Wśród warzyw bogate w katalazę są: ziemniak, por, cebula, brokuł, cukinia, szpinak, kapusta, rzodkiew, marchew, papryka czerwona, rzepa, ogórek, seler, natomiast pomidor zawiera mniej katalazy. 3) BADANIE AKTYWNOŚCI FOSFORYLAZY (transferaza) Do zlewki odmierzyć 20 ml wyciągu ziemniaczanego. Próbę wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 45 - 50oC!, mieszając ogrzewać 5 minut (w tych warunkach inaktywuje się βamylaza roślinna przeszkadzająca w doświadczeniu). Przygotować 6 probówek (2 zestawy po 3 szt.). Probówka I i I’ – odmierzyć 2 ml kleiku skrobiowego, 5 ml wody destylowanej i 3 ml buforu fosforanowego, zawartość wymieszać. Probówka II i II’ – odmierzyć 2 ml kleiku skrobiowego, 5 ml wyciągu ziemniaczanego i 3 ml wody destylowanej, zawartość wymieszać. Probówka III i III’ – odmierzyć 2 ml kleiku skrobiowego, 5 ml wyciągu z ziemniaka i 3 ml buforu fosforanowego, zawartość wymieszać. Schemat doświadczenia przedstawiono w tabeli: Nr probówki 3% kleik skrobiowy (ml) woda destylowana (ml) wyciąg z ziemniaka (ml) bufor fosforanowy (ml) I i I’ II i II’ III i III’ 2 5 3 2 3 5 - 2 5 3 Wszystkie probówki inkubować w temp. 37oC przez 25 min. Po inkubacji, do trzech probówek: I’, II’ i III’ dodać po 1 ml roztworu I2 w KI (reakcja z jodem na obecność skrobi). Wyjaśnienie: Fosforylaza katalizuje rozpad polisacharydów zapasowych (skrobi lub glikogenu). Enzym należy do glikozylotransferaz. Katalizowana reakcja zachodzi na drodze fosforolizy, gdzie wiązania α-1,4 glikozydowe ulegają rozbiciu a reszta α-glukozy przeniesiona zostaje na ortofosforan. 14 Po inkubacji: probówka I’ – obecność skrobi potwierdza dodatnia reakcja z jodem, probówka II’ – reakcja katalizowana przez fosforylazę nie zajdzie z powodu braku reszty fosforanowej. Obecność skrobi potwierdza dodatnia reakcja z jodem. probówka III’ – pod działaniem fosforylazy odłącza się reszta glukozy z nieredukującego końca skrobi i wiąże się z kwasem fosforowym, powstaje glukozo-1-fosforan. W próbie obserwujemy brak reakcji z jodem. Literatura: 1) Ćwiczenia z biochemii. Praca zbiorowa pod red. L. Kłyszejko-Stefanowicz. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2003. 2) Ogólna technologia żywności. Pijanowski E., Dłużewski M., Dłużewska A., Jarczyk A. Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa, 2004. 3) Biochemia. Krótkie wykłady. Hames B.D. i Hooper N.M. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2002. 4) Podstawy biochemii. J. Kączkowski. Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa, 2005 5) http://www.ehow.com/info_8552996_vegetable-fruit-sources-catalase.html 15
