Tytuł: Rola motywu HPD w obrębie J domeny białka JAC1 w

Tytuł: Rola motywu HPD w obrębie J domeny białka JAC1
w oddziaływaniu z mitochondrialnym białkiem HSP70.
Autor: Agnieszka Kaszuba
Opiekun: mgr inż. Leszek Ciesielski
Klasa III
Szkoła: I Akademickie Liceum Ogólnokształcące w Gdyni
STRESZCZENIE
Centra żelazowo siarkowe występują w białkach wszystkich organizmów żywych, miedzy
innymi w tak ważnych biomolekułach, jakimi są enzymy mitochondrialnego łańcucha
oddechowego. W komórkach eukariotycznych do syntezy centrów dochodzi w obrębie
mitochondrii. W moich badaniach skupiłam się na motywie HPD w obrębie domeny J białka Jac1
i jego roli w procesie tworzenia centrów. Według literatury(2) białko Jac1 łączy się z białkiem Isu1,
które stanowi rusztowanie molekularne. Do tak utworzonego kompleksu przyłącza się białko
Hsp70, które zostaje aktywowane przez motyw HPD znajdujący się w domenie J białka Jac1.
W wyniku tego oddziaływania Hsp70 zmienia swój kształt i trwale łączy się białkiem Isu1.
Na początku moich badań postawiłam hipotezę, iż motyw HPD pełni kluczową rolę w procesie
formowania centrów Fe/S. W celu jej zweryfikowania zaplanowałam dwa doświadczenia.
Pierwszym z nich był pomiar aktywności ATPazowej, ponieważ Jac1 stymuluje Hsp70, w skutek
czego dochodzi do hydrolizy ATP do ADP, a to prowadzi do trwałego związania Isu1. Takie badanie
pozwoliło mi zbadać, czy stopień hydrolizy ulegnie zmianie, jeśli motyw HPD będzie zawierał
określone mutacje, a co za tym idzie wywnioskować, czy Hsp70 został uaktywniony przed białko
Jac1. Drugim doświadczeniem była precypitacja kompleksów białkowych. Do studzienek
wykonanego przeze mnie żelu poliakrylamidowego zostało naniesione 10 prób. W każdej z nich
białko Jac1 w motywie HPD zawierało określone mutacje – tabela nr 2. Pozwoliło mi to sprawdzić,
czy zostaną uformowane kompleksy miedzy białkiem rusztowania molekularnego a Hsp70.
Po wykonaniu tych doświadczeń, analizie wyników, zweryfikowałam swoją hipotezę. Zgodnie
z moimi oczekiwaniami motyw HPD w obrębie J domeny białka Jac1 odgrywa kluczową rolę
w procesie tworzenia centrów Fe/S. Problem syntezy centrów Fe/S jest niezwykle ważny, ponieważ
ma bezpośredni związek z funkcjonowaniem organizmów jako całości. Moje badania
przeprowadziłam pod opieką dr Rafała Dutkiewicza i mgr Mateusza Manickiego w Pracowni
Biochemii Ewolucyjnej Katedry Biologii Molekularnej i Komórkowej Międzyuczelnianego Wydziału
Biotechnologii UG i GUMed.
WSTĘP
Centra
żelazowo-siarkowe
są
konserwowanymi
ewolucyjnie
kofaktorami
białek . Są niezbędne do funkcjonowania organizmów. Budujące je atomy żelaza i siarki mogą
przyjmować wiele stopni utlenienia, tym samym czyniąc z centrów żelazowo-siarkowych
precyzyjne i wieloaspektowe miejsca kontrolowanej wymiany elektronów, będącej podstawą
bardzo wielu reakcji chemicznych(4). Wolna siarka oraz wolne atomy żelaza są toksyczne
dla komórek, centra Fe/S nie są więc spontanicznie formowane, lecz ich synteza opiera
się na skoordynowanym działaniu układu wyspecjalizowanych białek. Do formowania centrów
żelazowo-siarkowych dochodzi w obrębie białkowego rusztowania molekularnego i współdziałaniu
współpracujących z nim partnerów białkowych. Gotowe centrum jest następnie przekazywane
przez system białek przenośnikowych do docelowych akceptorów(2). Chociaż molekularne
podstawy tych procesów nie zostały do dziś dobrze poznane, to wiadomo, że kluczowym etapem
inicjacji transportu gotowego centrum jest interakcja białka rusztowania molekularnego z białkiem
opiekuńczym. W modelowym organizmie eukariotycznym, drożdżach Saccharomyces cerevisiae,
do syntezy centrów dochodzi w obrębie mitochondrii. Rusztowanie molekularne stanowi białko
Isu1, a współpracują z nim białka opiekuńcze. Z literatury(1) wiadomo, iż są to białka z rodziny
Hsp40 (Jac1) i Hsp70 (Ssq1). W swojej pracy weryfikuję rolę motywu HPD w obrębie J domeny
białka Jac1 w oddziaływaniu z mitochondrialnym białkiem Hsp70.
(1)
1
MATERIAŁ I METODY
Jac1 stymuluje aktywność białka Hsp70, które z kolei wiąże się do Isu1, inicjując proces
transferu centrum żelazowo-siarkowego. Na podstawie literatury(2) wiadomo, że Jac1 aktywuje
Hsp70 poprzez działanie tak zwanej domeny-J zawierającej w swojej sekwencji aminokwasowej
kluczowy motyw HPD ( H- histydyna; P-prolina; D-kwas asparaginowy). Na skutek takiej interakcji
dochodzi do stymulacji aktywności ATPazowej białka Hsp70. W konsekwencji Hsp70 hydrolizuje
ATP do ADP. To indukuje zmiany konformacyjne prowadzące do trwałego związania Isu1 przez
Hsp70. Dlatego też w moich badaniach posłużyłam się 2 metodami badawczymi. Pierwszą z nich
jest pomiar aktywności ATPazowej białka Hsp70. W celu przeprowadzenia takiego badania
wykonałam 8 doświadczeń. Białko Jac1 użyte w każdym z tych doświadczeń różniło się rodzajem
mutacji w motywie HPD (przygotowany „Mix Białek” zestawiono w tabeli nr 1). Doświadczenia
zostały przeprowadzone w środowisku reakcyjnym, którym był bufor 1x stężony (tabela nr 4).
Następnie przygotowałam „Mix Reakcyjny” (tabela nr 2). Probówki zarówno z „Mix-em Białek” jak
i „Mix-em Reakcyjnym” zostały umieszczone w termostacie na okres 4 minut w celu podwyższenia
temperatury do 250C. Po tym czasie połączyłam niezależnie każdy z przygotowanych „Mix-ów
Białek” z „Mix-em Reakcyjnym”. „Mix Reakcyjny” dla każdej wykonanej próby był o takim składzie
i ilości (tabela nr 2). Tak przygotowane próbki umieściłam w spektrofotometrze. Zostały dokonane
ilościowe pomiary zmiany absorbancji w czasie. Interpretacja tych danych pozwoli mi ustalić
stopień hydrolizy ATP dla każdej z tych prób.
Tabela nr 1- Przedstawia skład „Mix-u Białek” użytego w reakcji badania pomiaru aktywności ATPazowej.
BUFOR 2X
SSQ (HSP70)
MGE
ISU
JAC1WILD TYPE (1:5)
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
125µl
125µl
5,23µl
125µl
5,23µl
6,9µl
1,46 µl
125µl
5,23µl
6,9µl
1,46 µl
6,15 µl
125µl
5,23µl
6,9µl
1,46 µl
125µl
5,23µl
6,9µl
1,46 µl
125µl
5,23µl
6,9µl
1,46 µl
125µl
5,23µl
6,9µl
1,46 µl
6,95 µl
JAC1 HPD/AAA
4,25 µl
JAC1 H/A
JAC1 P/A
JAC1 D/A
H2O
5,1 µl
125 µl
119,77µl
111,94 µl
110,7 µl
110,5 µl
111 µl
110,92 µl
3,3 µl
111,2 µl
Tabela nr 2 System regeneracji ATP umożliwiający pomiar zmiany ATP w czasie
BUFOR 2X
PEP
NADH
LDH
H20
ATP 3 mM
Tabela nr 3 Skład Buforu 1x stężonego użytego do reakcji
.
Odczynnik Stężenie
HEPES
Glycerol
KCl
DTT
MgCl2
40mM
5%
100mM
1mM
10mM
125µl
32,5 µl
8,325 µl
3,5 µl
75,675 µl
5 µl
Tabela nr 4 Skład Buforu 2x stężonego użytego do reakcji
Odczynnik
HEPES
Glycerol
KCl
DTT
MgCl2
Stężenie
80mM
10%
200mM
2mM
20mM
2
Drugą wykorzystaną przeze mnie metodą jest precypitacja kompleksów białkowych.
Pozwala to na wykazanie obecności uformowanych kompleksów białkowych pomiędzy Hsp70,
a Isu1. W celu weryfikacji hipotezy, iż HPD jest kluczowym miejscem, dzięki któremu powstaje
wiązanie, dokonałam badania efektywności powstawania kompleksów w modelach ze zmienioną
sekwencją aminokwasową w tym motywie. Poszczególne aminokwasy zostały zastąpione przez
alaninę w różnych wariantach mutacji tego motywu (HPD/AAA, H/A, P/A, D/A). Wykonałam
10 mieszanin reakcyjnych, o składzie i zawartości podanych w tabeli nr 5 oraz 6, które następnie
zostały wprowadzone pipetą i umieszone w studzienkach wykonanego żelu poliakrylamidowego
oraz ulokowane w aparacie do przeprowadzenia elektroforezy. Metoda ta pozwala mi sprawdzić,
czy zostały stworzone kompleksy białkowe.
Tabela nr 5- Przedstawia stężenia roztworów białek użytych do reakcji precypitacji kompleksów białkowych
Isu1-GST [μM]
Ssq1(Hsp70) [μM]
Jac1 WT [μM]
Jac1 HPD/AAA [μM]
Jac1 H/A [μM]
Jac1 P/A [μM]
Jac1 D/A [μM]
GST [μM]
ATP [μM]
1
2
3
4
5
2.5
2.5
2.5
2.5
6
0.5
6
6
6
6
7
8
9
10
6
6
6
6
2.5
6
0.5
6
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
2
2
2
2.5
2
2
2
0.5
2.5
2
2.5
2
2.5
2
2.5
2
Tabela nr 6- Przedstawia skład 10 mieszanin reakcyjnych użytych do precypitacji kompleksów białkowych
Buffer 2x (µl)
H2O (µl)
Isu-GST (µl)
Ssq1 (µl)
Jac 1 WT (µl)
Jac 1 HPD/AAA(µl)
Jac 1 H/A (µl)
Jac1 P/A (µl)
Jac1 D/A (µl)
GST (µl)
ATP 92,5 mM (µl)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
75
41,3
2,63
24,14
3,7
75
42,9
2,63
24,14
75
42,4
2,63
24,14
75
41,9
2,63
24,14
75
42,7
75
43
2,63
24,14
75
44,4
75
43,9
75
43,4
75
44,5
24,14
24,14
24,14
24,14
24,14
3,7
2,08
2,08
2,55
2,55
3,06
3,06
1,99
3,25
3,25
3,25
3,25
1,17
3,25
3,25
1,99
1,17
3,25
1,17
3,25
1,17
3,25
1,17
3,25
WYNIKI
Pomiar aktywności ATPazowej białka Hsp70
Wykres nr 1- przedstawia wynik pomiaru aktywności ATPazowej białka Hsp70
0,028
Aktywność ATPazowa
0,03
0,025
0,02
0,015
0,0065 0,007
0,0042 0,0051
0,01
0,005
0,0004
0,0019 0,0025
0
I
II
III
IV
V
Numery prób
VI
VII
VIII
3
Wykres nr 1 przedstawia pomiar aktywności ATPazowej białka Hsp70. W próbie
nr IV umieszczone zostało białko typu Wild Type, co oznacza, że występował podstawowy skład
wszystkich kluczowych aminokwasów. Próby badawcze posiadały mutacje wprowadzone
w obrębie całego motywu tj. Jac1 HPD/AAA ( próba nr V, wykres nr 1), lub w jego poszczególnych
częściach tj. Jac1 H/A (próba nr VI), Jac1 P/A (próba nr VII, wykres nr 1) oraz Jac1 D/A (próba nr VIII,
wykres nr 1). Próby od I-III posiadają różny układ białek. Pokazują, iż białko Hsp70 oraz różny układ
białek Isu, Mge, Hsp70, bez dodatku Jac1 (tabela nr 1 wykres nr 1) nie powodują istotnego wzrostu
aktywności ATPazowej. Dopiero po uzupełnieniu układu komponentów białkiem Jac1 obserwuje
się charakterystyczny wynik tego badania. Po dokonaniu analizy stwierdzam iż największa różnica
w stopniu hydrolizy ATP występuje pomiędzy próbami IV a V. Oznacza to, że mutacja
wprowadzona w obrębie całego motywu HPD wpływa na znaczne zmniejszenie zużycia ATP
w wyniku hydrolizy. Zmiana poszczególnych aminokwasów motywu HPD na alaninę- próby VI, VII
oraz VIII powoduje spadek aktywności ATPazowej. Największy występuje w próbie nr VI,
co oznacza, że histydyna odgrywa niezwykle dużą rolę w procesie aktywacji białka Hps70,
a pozostałe w kolejności to prolina i kwas asparaginowy
Precypitacja kompleksów białkowych
Ilustracja nr 1 - Przestawia wynik precypitacji kompleksów białkowych na żelu poliakrylamidowym,
numery prób odnoszą się do tabeli nr 3
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
44
Precypitacja kompleksów białkowych pozwala sprawdzić, czy po wprowadzeniu
niekorzystnych mutacji w motywie HPD zostaną uformowane kompleksy oraz jak wpłynie to na ich
ilość. Próby zostały dodatkowo wzbogacone o GST. Białko to, łącząc się z kompleksem powoduje
jego lepszą wizualizację na żelu. Standardowo białko Jac1 wiąże się do GST poprzez białko Isu1.
W moich próbach o numerach 5,7,8,9,10 w celu sprawdzenia, czy i w jakim stopniu białko Jac1
zwiąże się z samym GST, nie zostało dodane białko Isu1. Studzienki o tych numerach stanowią tło
dla właściwego badania (próby o numerach 1,2,3,4,6). Analiza żelu wykazała, że białko Jac1,
bez pośrednictwa Isu1, tylko w niewielkim stopniu wiąże się z GST. Komponent Isu1 jest niezbędny,
aby powstało to związanie. W studzience nr 1 znajduje się próba z białkiem Jac1 WT, która stawowi
próbę kontrolną reakcji. Dalszej analizie żelu poddano próby, w których znajdował się zmutowany
cały motyw HPD. Prążek jest najmniejszy. Próby 3,4,6 dotyczą mutantów, gdzie alaniną został
zamieniony jeden z aminokwasów w układzie HPD. I tak, w próbie nr 3 histydyna została
zastąpiona alaniną, w próbie nr 4 prolina alaniną, a w próbie nr 6 kwas asparaginowy alaniną.
4
We wszystkich próbach z mutantami wielkość i intensywność prążka znacząco się obniżyła.
Kluczowym komponentem HPD okazała się Histydyna.
Dyskusja
Centra żelazowo-siarkowe to grupy prostetyczne, które uczestniczą w wielu szlakach
metabolicznych, jak na przykład oddychanie komórkowe. Budujące je atomy żelaza i siarki mogą
przyjmować wiele stopni utlenienia, dzięki czemu centra żelazowo siarkowe to doskonałe miejsca
kontrolowanej wymiany elektronów, które jak są warunkiem do przebiegu wielu reakcji
chemicznych.
Formowanie centrów odbywa się w obrębie białkowego rusztowania molekularnego Isu1,
a także współpracujących z nim partnerów białkowych. Poprzez system białek przenośnikowych
centrum Fe/S jest ostatecznie przekazywane do docelowych akceptorów.
W drożdżach Saccharomyces cerevisiae, na których przeprowadzałam badania, do syntezy centrów
dochodzi w obrębie mitochondrii i, mimo iż podstawy tych procesów nie zostały jeszcze dobrze
poznane, to wiadomo, że kluczową rolę odrywa współdziałanie Isu1 z białkiem opiekuńczym.
Jac1 stymuluje aktywność białka Hsp70 poprzez działanie domeny J, które dostosowując swój
kształt, trwale wiąże się z białkiem Isu1.
Ilustracja nr 2 – Proces tworzenia kompleksu Isu-Hsp70
Rolę znaczącą w procesie aktywacji odgrywa motyw HPD. Białko Hsp70 rozpoczyna
hydrolizę ATP do APD w wyniku, czego połączy się ono z białkiem rusztowania molekularnego.
W swoich badaniach zweryfikowałam rolę tego motywu. Pomiar aktywności ATPazowej wskazuje
na to, czy Hsp70 uaktywnił się i połączył z Isu1, tworząc kompleks. Odnosząc się do wyników tego
badania (wykres nr 1), można bez problemu zauważyć, iż HPD jest najważniejszym miejscem, które
uaktywnia Hsp70, ponieważ mutacje wprowadzone w jego sekwencji prowadzą do znaczącego
spadku hydrolizy ATP – próba V wykres 1, a tym samym do zmniejszenia ilości uformowanych
kompleksów. Zamieniając odpowiednie aminokwasy na alaninę, można stwierdzić,
iż najważniejszym aminokwasem w sekwencji HPD jest histydyna (próba nr VI wykres nr 1). Wynik
aktywności ATPazy tej próby spada aż o 82 %. To wyraźnie wskazuje na jej niezbędność w procesie
aktywacji. Kolejnymi aminokwasami o istotnym znaczeniu są prolina (próba nr VII wykres 1), gdzie
spadek następuje o 77% oraz kwas asparaginowy (próba nr VIII wykres nr 1) o 75%. Jednakże
wyniki nie spadają do 0. W celu zbadania tej sytuacji posłużyłam się materiałami i badaniem
stymulacji aktywności ATPazy Ssq1 przez oczyszczone białka w warunkach równowagi wykonanymi
przez Zespół Pracowni Biochemii Ewolucyjnej z katedry Biologii Molekularnej i Komórkowej
na Międzyuczelnianym Wydziale Biotechnologii UG i GUM użyczonymi dzięki uprzejmości dr Rafała
Dutkiewicza na potrzeby pracy. Wyniki tych badań zostały przedstawione na wykresie nr 2.
5
Wykres nr 2 – Przedstawia wyniki badań stymulacji aktywności ATPazy Ssq1 przez oczyszczone
białka w warunkach równowagi
Badanie zostało przeprowadzone w następujących stężeniach białek Hsp70:Isu:Mge
0,5(µM):10(µM):0,5(µM) . Takie próby zostały poddane miareczkowaniu różnymi stężeniami białka
Jac1, które zostały zobrazowane na osi X wykresu nr 2. Doświadczenie zostało przeprowadzone
w nadmiarze białka Isu1, które jest substratem, aby jego dostępność nie była czynnikiem
limitującym. W tym badaniu hipotezę badawczą stanowiło pytanie, czy nadmiary białek Isu1 oraz
Jac1 może w pewnym stopniu zrekompensować efekty mutacji w obrębie motywu HPD.
Ta hipoteza została zweryfikowana pozytywnie. Wykres ilustrujący wyniki tego doświadczenie
pokazuje, że defekt mutacji HPD może być częściowo kompensowany przez nadmiar białek Isu1
oraz Jac1.
Precypitacja kompleksów białkowych pozwala wykryć obecność uformowanych
kompleksów, jeśli białkowy aktywator w swojej domenie J w motywie HPD zawiera niekorzystne
mutacje. Zdjęcie żelu poliakrylamidowego na określonej wysokości widać zmniejszenie
intensywności prążka, dzięki któremu obserwuję, czy kompleksy zostały utworzone. Prążek
zawierający białko Wild Type zgodnie z oczekiwaniami jest intensywny. Największą różnicę
obserwuje się pomiędzy prążkami 1 a 2 (ilustracja nr 1). W kolejnych próbach również zaistniał
znaczący spadek intensywności prążka, a tym samym ilości uformowanych kompleksów.
Najważniejszym aminokwasem w motywie HPD jest histydyna znajdująca się w próbie nr 3 (analiza
prób 3,4,6 na żelu- -ilustracja nr 1). To doświadczenie wskazuje na ważność roli, jaką spełnia
motyw HPD w procesie tworzenia centrów żelazowo- siarkowych.
W literaturze znajduje się niewiele publikacji dotyczących moich badań, w związku z tym
nie mam dostatecznej liczby materiałów porównawczych. Proces formowania centrów Fe/S jest
niezwykle ważny. Ma on niezwykle ścisły związek z funkcjonowaniem organizmu. Ze względu
na wagę procesów i podjęte badania przez zespoły naukowe, należy oczekiwać w nieodległej
przyszłości więcej doniesień naukowych na ten temat.
Bibliografia:
(1) Manicki Mateusz, Majewska Julia, Ciesielski Szymon, Schilke Brenda, Błenska Anna, Kominek Jacek, Marszałek Jarosław,
Craig Elizabeth A., Dutkiewicz Rafał. Overlapping binding sites of the frataxin homologue assembly factor and the heat
shock protein 70 transfer factor on the Isu iron-sulfur cluster scaffold protein. Journal of Biological Chemistry 2014
(2) Rafal DutkiewiczaA, Brenda Schilke, Helena Knieszner, Wiliam Walter, Elizabeth A. Craig and Jaroslaw Marszalek „Ssq1,
a Mitochondrial Hsp70 Involved in Iron Sulfur (Fe/S) Center Biogenesis
(3) Roland Lill, Rafal Dutkiewicz, Hans- Peter Elsasser, Anja Hausmann, Daili J. A. Netz, Antonio J. Pierik, Oliver Stehling,
Eugen Urzica, Ulrich Muhlenhoff „Mechanisms of iron-sulfur protein maturation in mitochondria, cytosol and nucleus of
eukaryotes.”
(4) http://biotech.ug.edu.pl/dzialalnosc_naukowa/zespoly_badawcze/pracownia_biochemii_ewolucyjnej
6