histo wyklady - Histologia - que-hiciste

histo wyklady.doc
(744 KB) Pobierz
Wykład 1
Historia wiedzy o komórkach:
 1665r. - Hook użył prymitywnego mikroskopu do opisu komórek korka;
wprowadził pojęcie komórki,
 1674r. - Leeuwenhoek odkrył pierwotniaki; 9 lat później zobaczył bakterie (
w późniejszym okresie zaobserwował plemniki i krwinki),
 1781r. – Felix Fontana wykrył po raz pierwszy i opisał gęste ziarna
rozpoznane później jako jąderko,
 1831r. – Brown opisał jądro komórkowe,
 1839r. – Schleiden i Schviann – współtwórcy teorii komórkowej (
wszystkie tkanki są zbudowane w analogiczny, ale zróżnicowany sposób.),
 1879r. – Flemming opisał chromosomy podczas mitozy,
 1881r. – Cajal i inni opisali metody barwienia komórek nerwowych i tkanki
nerwowej,
 1898r. – Golgi opisał aparat Golgiego,
 1952r. – Palade, Pouter, Sjostraud rozwinęli metody mikroskopii
elektronowej, które pozwoliły po raz pierwszy zobaczyć wiele struktur
wewnętrznych,
 1952r. – Robertson opisał dwuwarstwową strukturę błony komórkowej po
raz pierwszy oglądanej w mikroskopie elektronowym.
MIKROSKOPY
1.
Świetlne
M. w polu jasnym,
Elektronowe
1.
M.
transmisyjny,
2.
M. w polu ciemnym,
2.
skaningowy.
M.
3.
4.
M. fluorescencyjny,
M. polaryzacyjny,
5.
M. kontrastowo – fazowy,
6.
M. interferencyjny,
7.
M. konfokalny (laserowy).
M. w polu ciemnym:

Kondensor w szczególny sposób oświetla badany obiekt,

Do obiektywu wpadają wyłącznie promienie ugięte na strukturach
obiektu, a nie ugięte są eliminowane,

Struktury rozpraszające światło widoczne są jako jasno oświetlone
obrazy.
M. fluorescencyjny:

Zmodyfikowany mikroskop świetlny,

Źródło światła – lampa rtęciowa,

Preparaty sporządza się przy użyciu odczynników dających zjawisko
fluorescencji,

Struktury komórkowe znakuje się, np. przeciwciałami sprzężonymi z
fluorochromami ( po naświetleniu światłem ultrafioletowym emituje
światło widzialne).
M. polaryzacyjny:

Wykorzystuje się w nim zjawiska istnienia w komórkach struktur
anizotropowych (mających różne współczynniki załamania światła),

Zbudowany jest z dwóch płytek – polaryzatora i analizatora –
zbudowane są z przejrzystego, polaryzującego światło materiału.
M. kontrastowo – falowy:

Używany do badań żywych komórek (można zobaczyć struktury
wewnętrzne, w nieutrwalonych i niebarwionych komórkach) , np.
hodowanych in vitro,

W układzie optycznym o jasnym ( dodatnim) kontraście fazowym dwie
wiązki fal sumując się dają rozjaśnienie obrazu. Przy ciemnym (
ujemnym) kontraście znoszą się wzajemnie, tworząc ciemniejsze
obszary,

W mikroskopie tym przesunięcie fazy świetlnej przechodzącej przez
obiekt uzyskuje się dzięki wyposażeniu go w specjalną przysłonę w
kondensatorze oraz płytkę fazową w obiektywie.
M. interferencyjny:

Wykorzystuje się w nim nakładanie się fal świetlnych,

Pozwala na dowolny, płynny sposób zmienić wobec siebie przesunięcia
fazowe promieniowania tła i promieni ugiętych przez badany obiekt,

Przy jego udziale można dokładnie zmierzyć wartość współczynnika
załamania światła, którego wartość zależy od stężenia substancji
wchodzących w skład żywej materii,

Za pomocą pomiaru współczynnika załamania światła można określić
stężenie substancji w danych obszarach komórki i podać suchą masę
materii żywej w badanych organellach.
M. laserowy (LSM):

Źródłem światła jest laser, którego cieniutki promień skanuje miejsce po
miejscu w obrębie obserwowanego pola widzenia,

Średnica plamki promienia lasera definiuje zdolność rozdzielczą
mikroskopu,

Rozdzielczość - 0.1 µm,

Jakość obrazów – zwłaszcza obiektów grubych, np. ok. 20 µm o wiele
lepsza – obraz uzyskany nie jest zburzony nakładaniem się światła
ugiętego przez struktury leżące poza płaszczyzna ostrego widzenia,

Dopuszcza do płaszczyzny obrazu te promienie, które są ugięte na
strukturach widocznych, w płaszczyźnie ostrości widzenia obrazu
mikroskopu,

Promienie ugięte na strukturach leżących w warstwach niżej lub wyżej
od warstw w płaszczyźnie ostrego widzenia są odfiltrowane.
Za pomocą LSM :

Można tworzyć obrazy kolejnych warstw badanego obiektu o grubości
1-2 µm,

Obserwacje można prowadzić na obiektach żywych ( na pojedynczych
komórkach),

Pozwala na uzyskanie obrazów w świetle przechodzącym i odbitym,

Obrazy te można zestawić ze sobą za pomocą komputera.
Wykład 2.




Metody badawcze:
Metody HE (hematoksylina - eozyna):
Hematoksylina – barwnik zasadowy, wybarwia jądro na niebiesko,
Eozyna – barwnik kwasowy, zabarwia cytoplazmę na różowo.
Barwienie metachromatyczne:
Struktury zostają zabarwione innym kolorem, niż kolor barwnika
użytego do barwienia,
Używa się błękitu toluidyny – daje on różowo- fioletowe zabarwienie
struktur metachromatycznych ( powstają dimery barwnika inaczej
absorbujące widmo światła białego),

Zjawisko metachromatyczne występuje przy:

Reakcje histoenzymatyczne:
Wykazanie obecności i lokalizacji enzymów w komórce i tkankach








Reakcje Gomoriego:
Do wykrycia zespołu enzymów nazywanych fosfatazą zasadową
(hydrolizują estry fosforanowe),

Polega na jako substrat estrów fosforanowych glicerolu.
Wykrywanie hydrolaz i dehydrolaz:
Skrawki zamrożonej tkani inkubuje się w roztworze bursztynianu sodu i
błękitu tetrazolowego,
Dehydrogenaza utlenia bursztynian sodu do fumaranu sodowego, a
protony są przekazywane na cząsteczkę błękitu tetrazolowego, który
zostaje zredukowany do formazonu i zmienia zabarwienie na niebieski,
Intensywność zabarwienia jest wskaźnikiem aktywności utleniającej
mitochondrium.
Immunohistochemia:

Dziedzina, w której używa się swoistych odczynników,
Znakowane przeciwciała wiążą się z określonym białkiem w komórkach
i można je wykryć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (
fluorochromy), świetlnego
( peroksydaza), elektronowego ( złoto).


Barwieniu glikozaminoglikanów ( mukopolisacharydów) w
chrząstce,

Barwieniu komórek tucznych, ich ziarnistość barwią
metachromatycznie ze względu na zawartość heparyny.
Istnieją 2 metody stosowania przeciwciał:
Bezpośrednia – przeciwciało bezpośrednio oznakowane, tak aby można
było je wykryć,
Pośrednio – wprowadza się nieoznakowane przeciwciało, a później
odpowiednio oznakowane antyprzeciwciało.
Hodowla tkanek:
Wprowadzona przez A. Corella na początku XX w. umożliwia analizę
zachowań komórek i tkanek pod wpływem różnych substancji
dodawanych do środowiska hodowlanego.

W celu standaryzacji powstały dobrze opisane pod względem
genetycznym linie komórkowe
Komórki pozyskane z tkanek człowieka mają określoną liczbę pokoleń
do przeżycia.







Nieśmiertelne linie komórek uzyskuje się przez transformacje ( np.
nowotwory,
wprowadzenie części genomu człowieka).
Autoradiografia:
Właściwości promieniotwórcze pierwiastków można wykorzystać do
śledzenia szlaków metabolicznych niektórych cząsteczek ( makro),
Komórki nie odróżniają pierwiastków od ich promieniotwórczych
izotopów, którymi są znakowane cząsteczki prekursorowe,
Do oznakowania prekursorów metabolizmu białek wykorzystuje się
aminokwasy, w których jeden z węgli zostaje zastąpiony jego izotopem (
lub można też zastąpić w cysteinie jej izotopem).
Frakcjonowanie komórki:
Rozwój mikroskopii elektronowej umożliwił kontrolę morfologicznej
jakości i czystości frakcji komórek badanych przez biochemików
Wirowanie, różnicowanie z coraz większym przyspieszeniem pozwala
na uzyskanie oddzielnych frakcji komórki.
Etapy:

Wycinki tkanek zostaną rozdarte w homogenizatorze,

Z homogenatu po wirowaniu otrzymuje się osad i nadsącz,
Powtarzana procedura wirowania nadsączu z coraz większą szybkością
pozwala otrzymać kolejne osady okładające się z oddzielonych
poszczególnych składników cytoplazmy.
Wykład 3.
Mikroskopy.
Teoria de Broglie’a (1924r.) – o strukturze falowej materii i stwierdzenie Brusha
(1926r.) – odpowiednio ukształtowane pole elektryczne i magnetyczne. Skupiając
wiązkę elektronów może służyć jak soczewka do otrzymania wiernego i
powiększonego obrazu. Źródła tych elementów przyczyniły się do wynalezienia i
rozwoju mikroskopu elektronowego.
Pierwszy mikroskop elektronowy skonstruowali Marks Knall i Ernest Ruska w 1931r.
w Berlinie.
1934r. – następny mikroskop elektronowy skonstruowany został przez Ruskę o
zdolności rozdzielczej już 50 nm.
Ernest Ruska (1906-1988r.) – Nagroda Nobla w 1986r. za znalezienie 56 lat
wcześniej mikroskopu.
1936r. – powstaje pierwszy handlowy egzemplarz elektronowego mikroskopu firmy
Metropolitan Vickers.
1939r. firma Siemens zbudowała mikroskop konstrukcji Borries’a i Ruski o
rozdzielczości 2,5 nm. Od tego czasu następowało ulepszanie mikroskopów przez
znane firmy, np. Siemens.
1952r. – Palade Porter i Sjostrand rozwinęli metody mikroskopii elektronowej, które
pozwoliły po raz pierwszy zobaczyć wiele struktur wielokomórkowych.
Robertson opisał 2-warstwową strukturę błony komórkowej po raz pierwszy oglądaną
w mikroskopie elektronowym.
Konstruowanie materiału w mikroskopii elektronowej.
Octan uranylu
Cytrynian ołowiu
Czterotlenek osmu ( utrwalanie)
Podział mikroskopów
MIKROSKOPY ELEKTRONOWE
a) M. transmisyjny (TEM)
b) M. skaningowy (SEM)
c) M. wysokowoltażowy
d) M. tunelowy skanujący
e) M. atomowy
f) M. rentgenowski
W mikroskopie elektronowym wiązkę światła zastępuje wiązka elektronów, soczewki
szklane zastąpione są przez soczewki magnetyczne.
Kontrast uzyskuje się stosując substancje zawierające metale ciężkie, które
pochłaniają lub rozpraszają elektrony. Działo elektronowe wytwarza elektrony, które
są przyspieszane przez wysokie napięcie.
Wiązka przyspieszonych elektronów jest formowana prze uzwojenia soczewek
elektromagnetycznych.
M. SEM
Cienka wiązka elektronów przemiata linia po linii powierzchnię oglądanego obiektu.
Wybijane z powierzchni wtórne elektrony są zbierane i wzmacniane przez
fotopowielacz, a sygnały przetwarzane na monitorze.
Obraz jest trójwymiarowy.
W mikroskopii elektronowej wykonuje się również tzw. repliki : próbę badaną napyla
się w napylarce próżniowej cienką warstwą metalu, np. złota, a następnie usuwa
oryginalna próbkę i wykonuje obraz repliki (TEM); w SEM nie trzeba usuwać próbki
właściwej.

TEM i SEM – można oglądać m.in. płaszczyzny przełomu otrzymane po
zastosowaniu metody zamrażania i łamania tkanki (freeze - fracture), czy
rytowania (etching)
 Można badać rozmieszczenie reakcji enzymatycznych w organellach komórki.
Mikroskopię elektronową można łączyć z autoradiografią (badanie rozmieszczenia
znakowanych izotopowo związków w organellach komórki).
Metoda immunocytochemii – polegająca na selektywnym i specyficznym łączeniu się
przeciwciał z określonymi antygenami występującymi w komórce.
Przeciwciała ulegają związaniu w tych miejscach, które posiadają właściwy antygen.
Powstaje kompleks antygen – przeciwciało uwidoczniony dzięki wyznakowaniu
przeciwciał.
 Enzymami – metody immunoenzymatyczne
 Białkami – zawierającymi metal
Do najczęściej stosowanych znaczników enzymatycznych zaliczamy:
a) Peroksydazę chrzanową
b) Fosfatazę zasadową
c) Cytochrom
d) Oksydazę glukozową
Białka zawierające metal ciężki.
Ferrytyna – białko o masie cząsteczkowej 600 000 –...
Plik z chomika:
que-hiciste
Inne pliki z tego folderu:


Podstawy biologii komorki 15.pdf (17279 KB)
 histo wyklady.doc (744 KB)
 HISTOOOO.pdf (722 KB)
 Histologia_wejsciowki.zip (105 KB)
histologia_z_cytofizjologia_-_program_nauczania_i_rok.doc (41 KB)
Inne foldery tego chomika:
Zgłoś jeśli naruszono regulamin





Strona główna
Aktualności
Kontakt
Dział Pomocy
Opinie


Regulamin serwisu
Polityka prywatności
Copyright © 2012 Chomikuj.pl