SiFB1-2009
advertisement
Struktura i funkcja białek (I mgr) dr Katarzyna Śmietana [email protected] http://www.protein.pl/protein/downup/struk-funk/ Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer „Biochemia” Carl Branden, John Tooze “Introduction to Protein Structure” Wykład 1 - cztery główne typy funkcjonalne białek - aminokwasy: wzory, właściwości, szczególne cechy kodu genetycznego, - struktury II, III, IV rzędowe białek, mapa Ramachandrana, - preferencje do występowania w określonych strukturach II-rzędowych, - wiązanie peptydowe: cechy charakterystyczne, kąty, - typy oddziaływań, odległość, przykłady, - elementy stabilizujące struktury białek, - efekt hydrofobowy (zwijanie białek, oddziaływanie białko-białko) Wykład 2 - motywy strukturalne i funkcjonalne (przykłady), domeny alfa, beta, alfa/beta, alfa + beta - oligomeryzacja białek (typy, przykłady) - rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne, elastyczność białek, białka szkieletowe, - domena PDZ, cechy charakterystyczne wiązania ligandów, struktura, specyficzność Wykład 3 - poziomy kontroli funkcji białek - mechanizmy kierowania i regulacji białek - kontrola funkcji białek: degradacja, kowalencyjne modyfikacje, proteoliza, lipidacja, metylacja, N-acetylacja, sumoilacja, nitrozylacja, fosforylacja białek, przykłady, wpływ na strukturę/aktywność - molekularne przełączniki -- cykl aktywności białek G, minimalna domena G, zasada działania, białka GAP, GEF, GDI – budowa i mechanizm działania, model działania mięśniowej miozyny i kinezyny - kontrola funkcji białek przez modyfikacje kowalencyjne (fosforylacja, lipidacja, metylacja, N-acetylacja, sumoilacja, nitrozylacja) - degradacja, proteoliza i składanie białek, czterostopniowy mechanizm splicingu białek Wykład 4 Od sekwencji do funkcji: -- sekwencje homologiczne, dopasowanie sekwencyjne, motywy strukturalne i funkcjonalne (przykład), zasada 40% -- mikromacierze DNA, żele 2D, Y2H -- modelowanie homologiczne, profile-based threading, metody Rosetta, metoda GRID, THEMATICS -- sekwencje kameleonowe Biosynteza białka - etapy, funkcje poszczególnych IF, EF i RF, ogólny opis struktury krystalicznej rybosomu, czym jest PTC, synteza wiązania peptydowego, tunel wyjściowy, L22 i SecM Wykład 5 - kinazy białkowe, struktura przestrzenna, mechanizm aktywacji i działania kinaz Src i układu Cdk2-cyklina A - dwuskładnikowy mechanizm sygnalizacyjny bakterii - przeciwciała, MHC I i II, receptor T: budowa, genetyczne i strukturalne podłoże różnorodności - p53, ogólne informacje, budowa domeny oligomeryzacyjnej i wiążącej DNA, kluczowe reszty, białka natywnie niezwinięte - struktura i funkcja bakteriorodopsyny, poryn, kanału potasowego, - trzy typy białek fibrylarnych, - kolagen, filamenty pośrednie, włókna amyloidowe: budowa i cechy szczególne, - foldy metastabilne – priony, amyloidy i serpiny - białka opiekuńcze - podstawowa jednostka symetrii wirusów sferycznych, budowa wybranych wirusów Wykład 6 ? Białka • stanowią aż 75% suchej masy tkanek miękkich naszego ciała • z gr. proteios - pierwszorzędny, o największym znaczeniu • białka są polimerami zbudowanymi z zestawu 20 różnych aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi -> już dla stuaminokwasowego białka liczba możliwych sekwencji aminokwasowych (20100) przekracza 10130 • znaczne zróżnicowanie właściwości fizykochemicznych poszczególnych reszt aminokwasowych umożliwia tworzenie przez łańcuchy białkowe bardzo różnorodnych struktur trójwymiarowych odznaczających się często dużym stopniem komplikacji – pozwala to na pełnienie przez białka tak wielu różnych funkcji • różnorodność białek jest widoczna już w ich rozmiarach – znane są białka o masach od tysiąca do ponad miliona Da Białka są najbardziej różnorodnymi i wielofunkcyjnymi cząsteczkami występującymi w komórce Wiązanie różnorodność rozpoznawanych cząsteczek; komplementarność kształtu i oddziaływań polarnych Kataliza przyspieszanie reakcji do 17 rzędów wielkości, odpowiednie ułożenie grup reaktywnych, stabilizacja stanu przejściowego, kataliza kwasowo-zasadowa Molekularny przełącznik zmiana konformacyjna pod wpływem pH lub wiązania liganda przełącza funkcję Białka strukturalne specyficzna asocjacja podjednostek i białek pozwala na spontaniczne powstawanie nawet bardzo złożonych struktur Wyróżniamy cztery poziomy organizacji struktury białek Od właściwości łańcuchów bocznych zależy wkład różnych reszt aminokwasowych w zwijanie i funkcje białek w pH 7 końcowe grupy łańcucha polipeptydowego (aminowa i karboksylowa) są zjonizowane -zaangażowane tylko w oddziaływania van der Waalsa -unikanie wody i pakowanie się na siebie są podstawą efektu hydrofobowego -Ala i Leu faworyzują powstawanie helisy w przeciwieństwie do proliny -aromatyczny pierścień Phe czasami uczestniczy w słabych polarnych oddziaływaniach -mogą tworzyć wiązania wodorowe między sobą, z łańcuchem głównym i innymi cząsteczkami polarnymi (m.in. z wodą) -niektóre dysponują ładunkiem (w zależności od pH i otoczenia) - aa hydrofilowe tworzą wiązania wodorowe ze sobą, z łańcuchem głównym, z polarnymi związkami organicznymi i z wodą - Glu i Asp pKa 5 (ujemnie naładowane w pH 7), ale w otoczeniu hydrofobowym pKa może wzrosnąć powyżej 7 i wtedy służą jako donory protonu - Lys pKa 10 (w pH 7 dodatnio naładowana), ale w otoczeniu hydrofobowym może spaść poniżej 6 i wtedy Lys staje się akceptorem protonu - His ma dwie grupy –N-H, każda o pKa około 6 -- gdy jedna traci proton, pKa drugiej staje się większa niż 10 -- gdy obie są uprotonowane His jest ujemnie naładowana (bardzo rzadko) -- gdy jedna jest uprotonowana His jest neutralna i zdolna do przyjęcia bądź oddania protonu - Arg jest prawie zawsze uprotonowana - Grupa –SH cysteiny jest najsilniejszym nukleofilem - Ser, Thr, Gln i Asn są akceptorami i donorami protonu -- aa amfipatyczne najczęściej uczestniczą w tworzeniu interfejsów między elementami hydrofobowymi a polarnymi - Tyr zwykle nie jonizuje w pH 7 (pKa=9). Grupa –OH jest donorem i akceptorem wiązania wodorowego, a aromatyczny pierścień Tyr uczestniczy w słabych oddziaływaniach polarnych - Met jest najmniej polarna z grupy aa amfipatycznych, ale jej siarka jest często uczestniczy w oddziaływaniach z jonami metali Sposób organizacji kodu genetycznego odzwierciedla wzajemne podobieństwa aminokwasów Więcej białek niż genów u Eukariontów: -alternatywny splicing -editing RNA Częstość podstawień aminokwasowych w tym samym białku pochodzącym z różnych organizmów „conservative substitutions” Tworzenie i hydroliza wiązania peptydowego Wiązanie kowalencyjne tworzone pomiędzy kwasem karboksylowym i grupą aminową dwóch α-aminokwasów z uwolnieniem jednej cząsteczki wody. Wiązania amidowe są bardzo stabilne w środowisku wodnym w pH bliskim 7. W komórce tworzenie i hydroliza wiązań peptydowych kontrolowane są enzymatycznie. Rozciągnięty łańcuch polipeptydowy Rezonans – delokalizacja elektronów w obrębie wiązania peptydowego powoduje: -częściowy charakter wiązania podwójnego (CNO w jednej płaszczyźnie - dwa kąty torsyjne - ograniczona możliwość rotacji i konformacji; podwyższona stabilność) -polarność wiązania peptydowego, moment dipolowy (możliwe oddziaływania) Oddziaływania stabilizujące białko oddziaływania z wodą lub za jej pośrednictwem C=O i N-H we wnętrzu białka nie mogą tworzyć wiązań wodorowych z cząsteczkami wody, więc tworzą je między sobą prowadząc do powstania struktur II rzędowych i stabilizacji struktury Wykres Ramachandrana Prawie we wszystkich białkach łańcuch główny przyjmuje taką konformację, w której kąty torsyjne phi i psi powtarzają się, tworząc regularne wzory – elementy struktury drugorzędowej Ograniczenia steryczne określają możliwe typy struktury drugorzędowej Zgięcie beta (beta/hairpin/reverse turn) najprostszy element struktury II-rzędowej -NH -O n+3 (n+2) Część grup C=O i N-H nie tworzy wiązań wodorowych w obrębie łańcucha, dlatego zgięcia występują najczęściej na powierzchni cząsteczki białka Obecność zgięć beta pozwala ograniczyć rozmiary białka i nadać mu bardziej zwartą strukturę Helisa alfa – najpopularniejsza struktura II-rzędowa wiązania wodorowe pomiędzy C=O i N-H znajdującymi się blisko siebie w sekwencji 3.6 reszty na skręt n+4 Parametry elementów helikalnych n+4 n+3 n+5 Amfipatyczność helis alfa -łańcuchy boczne „wystają” co 100o -reszty oddalone od siebie o 3-4 aminokwasy grupują się po tej samej stronie helisy -helisy amfipatyczne stabilizują pakowanie helisa-helisa i często występują na powierzchni białka Helisy zawierające reszty proliny Struktura kolagenu helisa lewoskrętna (Gly-X-Y)n gdzie X, Y to Pro, Pro-OH lub (rzadziej) Lys Helisy poliprolinowe wszystkie proliny w formie trans tworzą lewoskrętną helisę (3 reszty na skręt); motyw w białkach sygnalnych rozpoznawany przez domeny SH3 Struktury beta bardziej stabilna nie są eksponowane do rozpuszczalnika, najczęściej „przeplatane” helisami Silnie rozciągnięty, zwykle lekko skręcony łańcuch polipeptydowy odległość między resztami 3,3 Å Możliwość utworzenia struktury amfipatycznej Kompleks Rap–Raf pakowanie helisy na równoległe włókno beta międzycząsteczkowa struktura beta jako interfejs oddziaływania białko-białko Baryłka beta (b-barrel) -włókna beta, ze względu na konfiguracje L aminokwasów, mają tendencję do prawoskrętu -aminokwasy rozgałęzione na węglu beta (Val, Ile) łatwo akomodują się w strukturze beta (w porównaniu z gęsto upakowaną helisą) białko wiążące retinol z niepolarnym ligandem związanym we wnętrzu baryłki Przewidywanie struktury drugorzędowej - trafność przewidywań zaledwie ok. 70% - najłatwiej określić położenie helis (tworzone dzięki oddziaływaniom reszt sąsiadujących ze sobą w sekwencji) - najtrudniej przewidzieć granice pętli i miejsca zgięć Tworzenie struktury trzeciorzędowej Intermediaty zwijania (barnaza) Efekt hydrofobowy -minimalizacja powierzchni hydrofobowej dostępnej dla rozpuszczalnika -zbliżenie polaryzowalnych grup hydrofobowych umożliwia powstanie między nimi oddziaływań van der Waalsa -tym samym „wciągniecie” polarnych grup C=O i N-H łańcucha głównego staje się siłą sprawczą powstania struktur drugorzędowych Porównanie struktur TIM (izomerazy triozofosforanowej) i DHFR (reduktazy kw. dihydrofoliowego) -podobne elementy struktury drugorzędowej mogą tworzyć białka o całkiem różnych strukturach III° -wynika to ze sposobu łączenia elementów występowania pętli lub zgięć Pętle -pętle w białkach zwykle ulokowane są na powierzchni, eksponowane do rozpuszczalnika -ponieważ ich wkład w stabilizację struktury białka jest niewielki, w obrębie pętli łatwiej tolerowane są mutacje -dzięki temu pętle łatwo dostosowują się do powierzchni ligandów i często tworzą interfejsy oddziaływań białko-białko Pierwsza powłoka hydratacyjna elastazy -cząsteczki wody ściśle związane z białkiem stanowią część jego struktury Wnętrze zwiniętego białka - atomy we wnętrzu są upakowane prawie jak w ciele stałym -kanały i szczeliny pozwalają jednak na ruch atomów i zapewniają elastyczność -jeśli w rdzeniu znajdują się większe przestrzenie, to wypełnione są cząsteczkami wody, które mogą oddziaływać z okolicznymi grupami polarnymi Motywy pakowania struktur helikalnych „ridges and grooves” cytochrom b562 ludzki hormon wzrostu Symulowana struktura fragmentu dwuwarstwy lipidowej 20 x 1,5 Å - helisa 8-9 x 3.5 Å - włókno beta -otoczenie hydrofobowe powoduje, że wszystkie polarne grupy (w tym C=O i N-H łańcucha głównego) muszą zostać „zagrzebane” we wnętrzu białka – odwrotnie niż w środowisku wodnym Fragment kompleksu cytochromu bc1 elementy przezbłonowe najczęściej są helikalne, ze względu na możliwość lokalnego utworzenia wiązań wodorowych w obrębie łańcucha głównego Profil hydrofobowości białka DctB z Rhizobium meliloti Błonowe białka beta Struktura transportera FhuA -włókno przezbłonowe = 8-9 reszt -zwykle pod kątem => trudniejsze do przewidzenia -zamknięte baryłki aby zaspokoić HB -często tworzą kanały Struktura bakteryjnego kanału potasowego homotetramer Zorganizowane cząsteczki wody na eksponowanej powierzchni hydrofobowej rybonukleazy A Pojedyncze słabe oddziaływanie uwalnia około 4-13 kJ/mol energii swobodnej Zwinięte natywnie białko jest termodynamicznym kompromisem. Stabilność można zdefiniować jako utratę energii swobodnej, będącą sumą efektów entalpowych i entropowych. Dla większości białek różnica energii między stanem rozwiniętym a zwiniętym jest marginalna, około 21-42 kJ/mol. Stabilność, denaturacja, termofilność -marginalna stabilność dopuszcza duży stopień swobody (niezbędny do wzajemnego dopasowania podczas oddziaływań z ligandami czy katalizy) -stan zdenaturowany rozpoznajemy po utracie aktywności biologicznej/biochemicznej lub zmianie sygnału np. dichroizmu kołowego -denaturację można wymusić wysoką temperaturą oraz chemicznymi denaturantami (chlorowodorek guanidyny, mocznik, SDS), które współzawodniczą z polarnymi grupami białka o wiązania wodorowe -stabilizację białek można uzyskać poprzez skracanie pętli, dodawanie mostków solnych itp. Struktura BPTI stabilizacja przez mostki S-S -zwykle struktura białka jest stabilizowana przede wszystkim przez oddziaływania niekowalencyjne -w niektórych przypadkach istotną rolę mogą też pełnić oddziaływania kowalencyjne, np. tworzenie mostków disulfidowych -dotyczy to głównie białek zewnątrzkomórkowych, ponieważ warunki panujące w komórce są silnie redukujące Fragment struktury subtylizyny stabilizacja przez koordynację metalu (Ca2+) -Kd wiązania metalu w zakresie od mM (bardzo słabe) do nM (bardzo mocne) -w koordynacji mogą uczestniczyć cząsteczki wody -w niektórych przypadkach białka strukturyzują się wyłącznie w obecności jonów metalu, a ich usunięcie prowadzi do denaturacji Stabilizacja przez wiązanie kofaktora dotyczy miejsc aktywnych DaAT/pirydoksal mioglobina/hem+żelazo cytochrom c/hem+żelazo oksydaza poliaminowa /PQQ Modyfikacje potranslacyjne wpływające na stabilność białka SUMOylation S-nitrosylation Domeny strukturalne domeny tetrameryzacyjne domeny wiążące DNA Diagram tetrameru Lac represora wiążącego się do DNA -białka fibrylarne/globularne -domena – zwarty obszar w strukturze białka, zwykle (ale nie zawsze) tworzony przez ciągłą sekwencję aa, często posiadający zdolność zwijania się i funkcjonowania w sposób niezależny od reszty białka -domeny mają nie więcej niż 250 aa (49% w granicach 51-150aa) Domeny strukturalne struktura racemazy alaniny - nie wszystkie domeny budowane są przez ciągły odcinek sekwencji - rdzenie hydrofobowe domen białkowych Domeny strukturalne -białka wielodomenowe ewoluowały przez fuzję genów kodujących pojedyncze białka -im dawniej nastąpiła duplikacja, tym trudniej dostrzec podobieństwo (coraz więcej nagromadzonych mutacji) monomer (tioesteraza) homodimer (dehydraza tioestrowa) Struktura gamma-krystaliny z soczewki oka podwójna duplikacja w obrębie tej samej domeny Struktury syntazy Trp i dehydratazy galaktonianiu Podobna alfa/beta baryłka (żółta) mimo całkowitego braku pokrewieństwa oraz podobieństwa sekwencji czy funkcji obu białek -ograniczona liczba sposobów zwijania -domain fold – topograficzny układ elementów struktury drugorzędowej, charakterystyczny dla danej domeny Diagram aranżacji domen w białkach zaangażowanych w sygnalizację komórkową -funkcjonowanie poszczególnych modułów może (ale nie musi) zależeć od ich kolejności w łańcuchu polipeptydowym => możliwe zamienianie i dokładanie domen -wyodrębniamy rodziny białek w zależności od architektury domenowej Struktura reduktazy aldozy (redukcja, NADPH) i fosfotriesterazy (hydroliza, jon metalu) ten sam sposób zwinięcia – zupełnie inna funkcja i mechanizm katalizy Struktura aminotransferaz -katalizują tą samą reakcję -brak podobieństwa sekwencji i struktury przestrzennej, z wyjątkiem bardzo podobnych miejsc aktywnych Na następnym wykładzie: -motywy strukturalne i funkcjonalne (przykłady), domeny alfa, beta, alfa/beta, alfa + beta - oligomeryzacja białek (typy, przykłady) - rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne, - elastyczność białek, białka szkieletowe, - domena PDZ, cechy charakterystyczne wiązania ligandów, struktura, specyficzność
