Szkodliwość grzybów pleśniowych występujących w środowisku
advertisement
MAŁGORZATA NABRDALIK Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej, Uniwersytet Opolski Szkodliwość grzybów pleśniowych występujących w środowisku człowieka Przy użyciu testów API ZYM dokonano oceny aktywności enzymatycznej trzech szczepów grzybów pleśniowych: Cladosporium cladosporioides, Alternaria tenuissima i Stachybotrys chartarum. Badane szczepy inkubowano w płynnym podłożu Sabourauda z dodatkiem materiałów budowlanych lub ich składników. Do badań użyto supernatantów z inkubowanych hodowli po ich odwirowaniu. Aktywność enzymów określono w nanomolach hydrolizowanego substratu w skali od 0 do 5. Na podstawie wyników badań stwierdzono wysoką aktywność enzymatyczną Cladosporium cladosporioides. Natomiast Alternaria tenuissima i Stachybotrys chartarum cechowała niska aktywność enzymów hydrolitycznych. Ilość uwalnianych enzymów zmieniała się w zależności od rodzaju zastosowanego podłoża. Wszystkie badane grzyby charakteryzowały się wysoką aktywnością fosfatazy zasadowej i kwaśnej, esterazy (C4), esterazy lipazy (C8), fosfohydrolazy naftylo-AS-BI. Zaobserwowano istotny wpływ środowiska budowlanego na tworzenie enzymów hydrolitycznych przez grzyby pleśniowe. Poszczególne materiały budowlane lub ich składniki stymulowały tworzenie odpowiednich enzymów. Podobieństwa w aktywności enzymatycznej pomiędzy szczepami kontrolnymi a hodowanymi na pożywkach z dodatkiem materiałów budowlanych pozwalają stwierdzić, że szczepy te prawdopodobnie są możliwym źródłem infekcji dla człowieka. Ponadto uzyskane wyniki pokazują, iż żadne ze szczepów nie wytwarzają zewnątrzkomórkowych hydrolaz w środowisku substancji grzybobójczych. Słowa kluczowe: grzyby pleśniowe, aktywność enzymatyczna Harmfulness of moulds occurring in human environment The enzymatic activity of 3 moulds species: Cladosporium cladosporioides, Alternaria tenuissima and Stachybotrys chartarum was evaluated with the use of the API ZYM system. The investigated strains were incubated in the liquid Sabouraud medium containing building substrates or their components. Centrifuged culture supernatants were used to assess the activity of enzymes, presented as amounts of hydrolised substrate in nanomols, depicted on a scale from 0 to 5. This investigation revealed a high enzymatic activity of Cladosporium cladosporioides. In contrast, Alternaria tenuissima and Stachybotrys chartaru were characterised by a low activity of hydrolytic enzymes. The amount of produced enzymes varied depending on the medium used. All the investigated moulds were characterised by both a high activity of alkaline and acid phosphatase, esterase (C4), esterase lipase (C8) and naphtol-AS-BI-phosphohydrolase. A significant influence of the building materials environment on the production of hydrolytic enzymes by moulds was observed. Particular building materials or their components stimulated the production of respective enzymes. The resemblances in the enzymatic activity between the control strains and the strains grown on the medium with building materials bring to the conclusion that the strains could be a potential source of human infection. Moreover the results demonstrate that none of the existing mould species produces hydrolases in environments containing fungicidal substances. Keywords: moulds, enzymatic activity 28 1. Wstęp Zagrożenia biologiczne w budynkach mieszkalnych wynikają głównie z obecności mikroorganizmów – bakterii i grzybów. Dzięki doskonałym zdolnościom adaptacyjnym, zarówno fizjologicznym jak i morfologicznym, na pierwsze miejsce w procesach biokorozji wysunęły się grzyby strzępkowe potocznie zwane pleśniami. Minimalne wymagania, w połączeniu z szerokim spektrum tolerancji na zmieniające się warunki środowiska, predysponują tę grupę mikroorganizmów do szybkiego i trwałego kolonizowania nowych podłoży. Zjawisko wywołane rozwojem grzybów pleśniowych określa się mianem biodeterioracji pleśniowej. Jest to rodzaj korozji biologicznej, która powoduje obniżenie właściwości użytkowych obiektu budowlanego w wyniku sumowania się dwóch niekorzystnych procesów: mikotoksycznego skażenia środowiska oraz biodegradacji materiałów budowlanych. Występowanie i rozwój grzybów pleśniowych w budynkach powoduje nie tylko biodeteriorację materiałów budowlanych, ale przede wszystkim stanowi ogromne zagrożenie dla zdrowia ludzi w nich przebywających. Konsekwencją są powszechnie występujące uczulenia, długotrwałe alergie czy grzybice całych narządów. Ponadto grzyby pleśniowe posiadają specyficzne właściwości biologiczne i uzdolnienia biochemiczne do produkcji wielu toksycznych metabolitów, a do jednych z najgroźniejszych niewątpliwie należą mikotoksyny. Związki te jako wtórne metabolity, gromadzone w zarodnikach grzybów pleśniowych, są wydalane do środowiska i odznaczają się różnokierunkowym działaniem m. in. mutagennym i rakotwórczym. Organizm człowieka pozostaje wobec nich bezbronny, bowiem związki te nie wykazują cech antygenowych. Grzyby wydzielają do środowiska również bogaty wachlarz enzymów zewnątrzkomórkowych, mających ogromne znaczenie nie tylko w procesach biodegradacji i niszczenia materiałów budowlanych, ale przede wszystkim wskazują na ich potencjalną chorobotwórczość. Odgrywają one istotną rolę w osiadaniu zarodników grzybów na błonach śluzowych człowieka, a także w dalszej ich inwazji. Istnieje zatem konieczność stwierdzenia czy wyizolowane z budynków mieszkalnych grzyby zagrażają zdrowiu osób przebywają- cych w ich środowisku, a następnie podanie skutecznego sposobu ich likwidacji. Według Instytutu Techniki Budowlanej [5] zabezpieczenie budynków przed występowaniem grzybów pleśniowych to ochrona budynku przed zawilgoceniem i niedogrzaniem, zapewnienie właściwej wentylacji pomieszczeń oraz przeprowadzenie określonych prac remontowych. Jednak przy braku zapewnienia warunków całkowicie eliminujących zawilgocenie, konieczne jest stosowanie środków chemicznych przeciwdziałających rozwojowi grzybów pleśniowych. Stosowanie preparatów chemicznych wydaje się najskuteczniejszą formą walki z tymi mikroorganizmami. Jednak wiąże się to z ciągłym poszukiwaniem nowych preparatów hamujących rozwój pleśni, gdyż od pewnego czasu zwraca się w literaturze [7] uwagę na problem narastania wśród grzybów pleśniowych oporności na stosowane preparaty dezynfekcyjne. Dlatego też w pracy podjęto próbę oceny czy porastające materiały budowlane grzyby pleśniowe stanowią zagrożenie dla zdrowia ludzi. Celem podjętych badań było określenie wpływu środowiska budowlanego na tworzenie enzymów zewnątrzkomórkowych przez grzyby pleśniowe, podczas ich wzrostu na podłożach z dodatkiem materiałów budowlanych oraz substancji aktywnych środków grzybobójczych (fungicydów). 2. Materiały i metodka badań W badaniach wykorzystano szczepy grzybów strzępkowych pochodzące z kolekcji Katedry Biotechnologii i Biologii Molekularnej Uniwersytetu Opolskiego, a stanowiące największy odsetek wyizolowanych grzybów z budynków z oznakami biodeterioracji pleśniowej [5]. Należały tu gatunki Cladosporium cladosporioides oraz Alternaria tenuissima. Dodatkowo w badaniach wykorzystano szczep Stachybotrys chartarum, który uważany jest za indykator w nadmiernie zawilgoconych budynkach. Aktywność enzymatyczną zewnątrzkomórkowych hydrolaz, enzymów odpowiedzialnych za wywoływanie różnego typu infekcji i stanów zapalnych skóry [6], oceniono za pomocą testów API ZYM firmy BioMerieux. Metoda ta pozwala na oznaczenie 19 enzymów należących do różnych klas enzymów – amylolitycznych, lipolitycznych, proteolitycznych oraz fosfataz. Enzymy i ich substraty przedstawiono w tablicy 1. Hodowlę grzybów strzępkowych prowadzono na płynnym podłożu Sabourauda z dodatkiem materiałów wykorzystywanych w budownictwie oraz związków będących substancjami czynnymi fungicydów: tapeta, celuloza, skrobia (jako składnik klejów do tapet), gips, zaprawa murarska oraz siarczan miedzi i IV rzędowa sól amoniowa. Przygotowano 5% roztwory powyższych związków. Podłoże kontrolne (bez dodatków) oraz podłoża z dodatkiem materiałów budowlanych oraz Tablica 1. Zestawienie badanych enzymów hydrolitycznych i ich substratów Nr Nazwa enzymu Hydrolizowany substrat 1 Fosfataza zasadowa Alkaline phosphatase 2-naftylofosforan 2-naphtyl phosphate 2 Esteraza (C4) Esterase 2-naftylomaślan 2-naphtyl butyrate 3 Lipaza esterazowa (C8) Esterase lipase 2-naftylokapronian 2-naphtyl caprylate 4 Lipaza (C14) Lipase 2-naftylomirystylan 2-naphtyl myristate 5 Arylamidaza leucynowa Leucine arylamidase L-leucylo-2-naftyloamid L-leucyl-2-naphthylamide 6 Arylamidaza walinowa Valine arylamidase L-walinylo-2-naftyloamid L-valyl-2-naphthylamide 7 Arylamidaza cystynowa Cystine arylamidase L-cystynylo-2-naftyloamid L-cystyl-2-naphthylamide 8 Trypsya Trypsin N-benzylo-DL-arginino-2-naftyloamid NL-benzoyl-DL-arginine-2-naphthylamide 9 α-chymotrypsyna α-chymotrypsi N-glutarylo-fenyloalanino-2-naftyloamid N-glutaryl-phenylalanine-2-naphthylamide 10 Fosfataza kwaśna Acid phospatase 2-naftylofosforan 2-naphthyl phosphate 11 Fosfohydrolaza naftolowa AS-BI Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase Fosforan naftolu-AS-BI Naphtol-AS-BI-phosphate 12 α-galaktozydaza α-galactosidase 6-Br-2-naftylo-αD-galaktopiranoza 6-Br-2-naphthyl-αD-galactopyranoside 13 β-galaktozydaza β-galactosidase 2-naftylo-βD- galaktopiranoza 2-naphthyl-βD-galactopyranoside 14 β-glukuronidaza β-glucuronidase Naftolu-AS-BI- βD-glukuronid Naphthol-AS-BI- βD-glucuronide 15 α-glukozydaza α-glucosidase 2-naftylo-αD-glukopiranoza 2-naphthyl-αD-glucopyranoside 16 β-glukozydaza β-glucosidase 6-Br-2-naftylo-βD-glukopiranoza 6-Br-2-naphthyl-βD-glucopyranoside 17 N-acetylo-β-glukozaminidaza N-acetyl-β-glucosaminidase 1-naftylo-N-acetylo-βD-glukozyloamid 1-naphthyl-N-acetyl- βD-glucosaminide 18 α-mannozydaza α-mannosidase 6-Br-2-naftylo-αD-mannopiranoza 6-Br-2-naphthyl-αD-mannopyranoside 19 α-fukozydaza α-fucosidase 2-naftylo-αL-fukopiranoza 2-naphthyl-αL-fucopyranoside związków chemicznych zaszczepiono 5 cm3 standaryzowanej zawiesiny zarodników testowanych grzybów o gęstości 1×106 kom/cm3. Hodowlę prowadzono w warunkach ciągłego natleniania przez okres 21 dni w temperaturze 25oC. Następnie przy użyciu densytometru przygotowano zawiesinę o gęstości 5o w skali McFarland’a, którą dodawano do mikroprobówek testów API ZYM. Testy inkubowano 4 godziny w temperaturze 37oC. Po tym czasie do każdej mikroprobówki dodawano odczynniki ZYM A i ZYM B. Aktywność enzymów określono w nanomolach hydrolizowanego substratu w skali od 0 do 5, przy czym: 0 oznacza reakcję negatywną, 1–5 nmoli, 2–10 nmoli, 3–20 nmoli, 4–30 nmoli oraz 5–40 nmoli i więcej. 3. Wyniki badań i omówienie Do oceny wpływu środowiska budowlanego na aktywność enzymatyczną grzybów pleśniowych wykorzystano testy API ZYM. W przeprowadzonych badaniach zaobserwo- wano istotny wpływ środowiska budowlanego na tę cechę metabolizmu badanych grzybów pleśniowych. Wyniki przedstawiono w tablicach 2–4 i na rysunkach 1–3. Spośród badanych grzybów największą ilością i aktywnością wytwarzanych enzymów charakteryzował się Cladosporium cladosporioides (tabl. 2, rys. 1). Cladosporium cladosporioides wytworzył największą liczbę hydrolaz zarówno w podłożu kontrolnym, jak i próbach zawierających materiały budowlane. Największą aktywność enzymatyczną stwierdzono dla próby kontrolnej, ale również gipsu i zaprawy murarskiej, w obecności których szczep tworzy 13 z 19 enzymów. W próbach zawierających składnik materiałów budowlanych tj. tapetę, celulozę, skrobię, gips oraz zaprawę murarską zaobserwowano aktywność 10 enzymów: fosfatazy alkalicznej i kwaśnej, esterazy (C4), esterazy lipazy (C8), arylamidazy leucyny i waliny, fosfohydrolazy naftylo-AS-BI, α- i β-glukozydazy i N-acetylo-β-glukozamidazy (tabl. 2). W tym przypadku maksymalną aktywność – 5 nmoli, zanotowano jedynie dla 29 3 enzymów: fosfatazy alkalicznej i kwaśnej oraz fosfohydrolazy naftylo-AS-BI. W porównaniu do próby kontrolnej, we wszystkich podłożach z dodatkiem składników materiałów budowlanych zwiększyła się aktywność arylamidazy waliny z 1 nmola do 2–4 nmoli, α-glukozydazy z 1 nmola do 4–5 nmoli i Nacetylo-β-glukozamidazy z 1 nmola do 2–3 nmoli. Jedynie w próbie kontrolnej stwierdzono obecność lipazy. Jednak jej aktywność wynosiła tylko 1 nmol (rys. 1). Natomiast w obecności materiałów budowlanych badany szczep Cladosporium nie wytwarzał 4 enzymów: α-galaktozydazy, β-glukuronidazy, α-mannozydazy i α-fukozydazy. Ponadto zaobserwowano uaktywnienie się enzymów pod wpływem substratu budowlanego obecnego w podłożu. I tak, np.: na podłożu z dodatkiem gipsu stwierdzono obecność α-chymotrypsyny, na podłożu z dodatkiem gipsu oraz zaprawy murarskiej trypsyny, a na podłożu z tapetą i zaprawą murarską β-galaktozydazy (tabl. 2). Co istotne, w obecności badanych substancji czynnych fungicydów tj. siarczanu miedzi oraz IV rzędowej soli amoniowej Cladosporium cladosporioides nie wykazuje aktywności enzymatycznej (tabl. 2). Wydaje się, iż najkorzystniejszym środowiskiem do rozwoju i tworzenia zewnątrzkomórkowych hydrolaz jest podłoże zawierające gips i zaprawę murarską, a w następnej kolejności tapetę, celulozę i skrobię. Natomiast wzrostowi i aktywności enzymatycznej grzybów z rodzaju Cladosporium nie sprzyja środowisko zawierające substancje czynne fungicydów. Znacznie mniejszą ilość i aktywność enzymów w środowisku materiałów budowlanych, w porównaniu do szczepu Cladosporium, odnotowano dla Alternaria tenuissima (tabl. 3, rys. 2). W próbie kontrolnej zaobserwowano tworzenie się jedynie 10 spośród 19 enzymów. Jednak tylko dwa enzymy: kwaśna fosfataza i fosfohydrolaza naftylo-AS-BI są wspólne dla kombinacji zawierających materiały budowlane. W większości prób, za wyjątkiem podłoża zawierającego skrobię, występują enzymy: fosfataza alkaliczna, esteraza (C4) i esteraza lipazy (C8) (tabl. 3). Podobnie jak w przypadku szczepu Cladosporium, tak i tutaj zaobserwowano uaktywnienie się hydrolaz. W obecności gipsu szczep Alternaria wytwarzał trypsynę w ilości 5 nmoli (rys. 2). Należy zaznaczyć, iż badany szczep Alternaria charakteryzował się bardzo zróżnicowanym poziomem wytwarzanych enzymów. Wysoką, bo w granicach 3–5 nmoli, aktywność enzymatyczną odnotowano dla podłoża kontrolnego. Niski poziom aktywności hydrolaz uzyskano na podłożu zawierającym tapetę oraz z dodatkiem celulozy. Najmniej korzystnym podłożem do wzrost i wytwarzania enzymów było podłoże zawierające skrobię, gdzie zaobserwowano wytwarzanie wyłącznie kwaśnej fosfatazy w ilości 5 nmoli i fosfohy- 30 Tablica 2. Aktywność enzymatyczna hydrolaz Cladosporium cladosporioides Cladosporium cladosporioides enzym kontrola tapeta celuloza skrobia gips zaprawa murarska siarczan miedzi IV rzędowa sól amoniowa kontrola - - - - - - - - 1 + + + + + + - - 2 + + + + + + - - 3 + + + + + + - - 4 + - - - - - - - 5 + + + + + + - - 6 + + + + + + - - 7 + - - - + + - - 8 - - - - + + - - 9 - - - - + - - - 10 + + + + + + - - 11 + + + + + + - 12 - - - - - - - - 13 - + - - - + - - 14 - - - - - - - - 15 + + + + + + - - 16 + + + + + + - - 17 + + + + + + - - 18 - - - - - - - - 19 - - - - - - - - 1 – fosfataza zasadowa, 2 – esteraza (C4), 3 – lipaza esterazowa (C8), 4 – lipaza (C14), 5 – arylamidaza leucytowa, 6 – arylamidaza walinowa, 7 – arylamidaza cystynowa, 8 – trypsyna, 9 – α-chymotrypsyna, 10 – fosfataza kwaśna, 11 – fosfohydrolaza naftolowi AS-BI, 12 – α-galaktozyaza, 13 – β-galaktozydaza, 14 – β-glukuronidaza, 15 – α-glukozydaza, 16 – β-glukozydaza, 17 – N-acetylo-β-glukozaminidaza, 18 – α-mannozydaza, 19 – α-fukozydaza. „+” reakcja dodatnia, „-” reakcja ujemna. Rys. 1. Aktywność enzymatyczna hydrolaz w skali punktowej Cladosporium cladosporioides drolazy naftylo-AS-BI na poziomie 2 nmoli (rys. 2). Na żadnym podłożu zawierającym materiały budowlane szczep Alternaria nie wytwarzał 8 enzymów: lipazy, arylamidazy waliny i cystyny, α-chymotrypsyny, β-galaktozydazy, β-glukuronidazy, α-mannozydazy i α-fukozydazy (tabl. 3). Podobnie jak w przypadku szczepu Cladosporium, tak i tutaj w obecności siarcza- nu miedzi oraz IV rzędowej soli amoniowej Alternaria tenuissima nie wytwarza zewnątrzkomórkowych hydrolaz (tabl. 3). Przeprowadzone badania pokazują, iż podłożami sprzyjającymi wzrostowi i tworzeniu zewnątrzkomórkowych hydrolaz przez rodzaj Alternaria, są podłoża zawierające tapetę oraz gips, a w następnej kolejności celulozę i zaprawę murarską. Z kolei środowiskiem niesprzyjającym rozwojowi i aktywności enzymatycz- Tablica 3. Aktywność enzymatyczna hydrolaz Alternaria tenuissima Alternaria tenuissima enzym kontrola tapeta celuloza skrobia gips zaprawa murarska siarczan miedzi IV rzędowa sól amoniowa kontrola - - - - - - - - 1 + + + - + + - - 2 + + + - + + - - 3 + + + - + + - - 4 - - - - - - - - 5 + - - - + - - - 6 - - - - - - - - 7 - - - - - - - - 8 - - - - + - - - 9 - - - - - - - - 10 + + + + + + - - 11 + + + + + + - - 12 + - - - - - - - 13 - - - - - - - - 14 - - - - - - - - 15 + + - - - - - - 16 + + + - - - - - 17 + + - - - - - - 18 - - - - - - - - 19 - - - - - - - - 1 – fosfataza zasadowa, 2 – esteraza (C4), 3 – lipaza esterazowa (C8), 4 – lipaza (C14), 5 - arylamidaza leucytowa, 6 – arylamidaza walinowa, 7 – arylamidaza cystynowa, 8 – trypsyna, 9 – α-chymotrypsyna, 10 – fosfataza kwaśna, 11 – fosfohydrolaza naftolowi AS-BI, 12 – α-galaktozyaza, 13 – β-galaktozydaza, 14 – β-glukuronidaza, 15 – α-glukozydaza, 16 – β-glukozydaza, 17 – N-acetylo-β-glukozaminidaza, 18 – αmannozydaz, 19 – α-fukozydaza. „+” - reakcja dodatnia, „-” – reakcja ujemna. Rys. 2. Aktywność enzymatyczna hydrolaz w skali punktowej Alternaria tenuissima nej jest środowisko zawierające skrobię oraz substancje czynne fungicydów. W przypadku Stachybotrys chartarum, w próbie kontrolnej, zaobserwowano tworzenie się jedynie 9 spośród 19 enzymów (tabl. 4, rys. 3). W próbie kontrolnej maksymalną aktywność (5 nmoli) uzyskano dla fosafatazy zasadowej i kwaśnej, arylamidazy leucyny oraz fosfohydrolazy naftylo-AS-BI. Podobnie jak w przypadku szczepu Alternaria, Stachybotrys chartarum na podłożu z dodatkiem skrobi tworzy jedynie dwa enzymy: kwaśną fosfatazę w ilości 4 nmoli oraz z maksymalną aktywnością fosfohydrolazę naftylo-AS-BI (ryc. 3). Zaobserwowano, iż szczep ten nie wytwarza żadnych enzymów zewnątrzkomórkowych w podłożu zawierającym zaprawę murarską, siarczan miedzi oraz IV rzędową sól amoniową. Natomiast dla pozostałych kombinacji zawierających materiały budowlane, wspólnymi enzymami zewnątrzkomórkowymi są: fosfataza alkaliczna, esteraza (C4), esteraza lipazy (C8), kwaśna fosfataza, fosfohydrolaz naftylo-AS-BI i β-glukozydaza (tab. 4). Jedynie w obecności gipsu zaobserwowano dla szczepu Stachybotrys uaktywnienie się, do poziomu 2 nmoli, arylamidazy waliny (rys. 3). Na podłożach z dodatkiem materiałów budowlanych Stachybotrys chartarum nie wytwarzało aż 9 enzymów: lipazy, arylamidazy cystyny, trpsyny, α- i β-galaktozydazy, β-glukuronidazy, α-glukozydazy, α-mannozydazy i α-fukozydazy (tab. 4). Zaobserwowano, iż rodzaj Stachybotrys najlepiej rozwija się i tworzy najwięcej enzymów na podłożach zawierających tapetę, gips oraz celulozę. Natomiast podłoża zawierające skrobię, zaprawę murarską, siarczan miedzi oraz IV rzędową sól amoniową są niekorzystne dla ich wzrostu i aktywności enzymatycznej. Należy podkreślić, iż wszystkie badane szczepy cechował brak aktywności w środowisku badanych substancji czynnych fungicydów (tabl. 2, 3, 4). 4. Podsumowanie W przeprowadzonych badaniach aktywności enzymatycznej grzybów pleśniowych stwierdzono różnice w rodzaju i ilości uwalnianych zewnątrzkomórkowych enzymów hydrolitycznych, w zależności od zastosowanego podłoża, co może potwierdzać fakt doskonałych możliwości przystosowawczych grzybów pleśniowych do różnorodnych środowisk. Powszechne występowanie grzybów pleśniowych w budynkach mieszkalnych wywołało większe zainteresowanie cechami ich szkodliwości, gdyż patogenność grzybów, w tym aktywność enzymatyczna może współdecydować o przebiegu zakażenia. Jak podaje Baran [1], w przypadku dermatofitów, enzymy hydrolityczne ułatwiają rozkład kreatyny, a tym samym mogą być odpowiedzialne za grzybiczne zmiany skórne i paznokciowe. W przeprowadzonych badaniach wykazano dużą aktywność fosfatazy zasadowej i kwaśnej, esterazy (C4), esterazy lipazy (C8) oraz fosfohydrolazy naftylo-AS-BI, a intensywność wydzielanych enzymów była skorelowana z rodzajem zastosowanego podłoża. Według Brascha [2] fosfataza zasadowa, esteraza (C4) oraz arylamidaza leucyny mogą być istotne dla pasożytniczego wzrostu dermatofitów. Jednak, jak podaje Plomer-Niezgoda [10, 11], enzymy te są wydzielane również przez grzyby pleśniowe, których patogenność przy prawidłowej odporności gospodarza jest niewielka. Natomiast esteraza (C4) i esteraza lipazy (C8) uważane są za szczególnie istotne w pierwszej fazie infekcji przez dermatofity, w której kreatyna jest trudno dostępna. Enzymy te ułatwiają penetracje tkanek gospodarza, gdyż zaburzają strukturę składników błon komórkowych, prowadząc do ich przerwania [4, 6]. Z kolei lipazy odgrywają ważną rolę w wi- 31 Tablica 4. Aktywność enzymatyczna hydrolaz Stachybotrys chartarum Stachybotrys chartarum enzym kontrola tapeta celuloza skrobia gips zaprawa murarska siarczan miedzi IV rzędowa sól amoniowa kontrola - - - - - - - - 1 + + + - + - - - 2 + + + - + - - - 3 + + + - + - - - 4 - - - - - - - 5 + + - - + - - - 6 - - - - + - - - 7 - - - - - - - - 8 - - - - - - - - 9 + - - - - - - - 10 + + + + + - - - 11 + + + + + - - - 12 - - - - - - - - 13 - - - - - - - - 14 - - - - - - - - 15 - - - - - - - - 16 + + + - - - - - 17 + + - - - - - - 18 - - - - - - - - 19 - - - - - - - - 1 – fosfataza zasadowa, 2 – esteraza (C4), 3 – lipaza esterazowa (C8), 4 – lipaza (C14), 5 – arylamidaza leucytowa, 6 – arylamidaza walinowa, 7 – arylamidaza cystynowa, 8 – trypsyna, 9 – α-chymotrypsyna, 10 – fosfataza kwaśna, 11 – fosfohydrolaza naftolowi AS-BI, 12 – α-galaktozyaza, 13 – β-galaktozydaza, 14 – β-glukuronidaza, 15 – α-glukozydaza, 16 – β-glukozydaza, 17 – N-acetylo-β-glukozaminidaza, 18 – α-mannozydaza, 19 – α-fukozydaza. „+” - reakcja dodatnia, „-” – reakcja ujemna. Rys. 3. Aktywność enzymatyczna hydrolaz w skali punktowej Stachybotrys chartarum rulencji przez hydrolizę glicerofosfolipidów błon komórkowych gospodarza [6]. Według Plomer-Niezgoda [10] przemawia to za tym, że wytwarzane enzymy ułatwiają wprawdzie rozprzestrzenianie się grzyba w tkance, ale to nie one decydują o jego patogenności. Również Saenz-de-Santamaria [12], w badaniach nad alergenami Alternaria alternata, podaje iż aktywność fosfatazy zasadowej i kwaśnej oraz esterazy nie ma znaczącego wpływu na 32 ich patogenność. Jednak podobieństwa w aktywności enzymatycznej fosfatazy kwaśnej i zasadowej, esterazy oraz esterazy lipazy, pomiędzy szczepami na podłożach kontrolnych i modyfikowanych, uzyskane w badaniach własnych, pozwalają przypuszczać, iż grzyby pleśniowe porastające materiały budowlane w naszym środowisku mogą stanowić źródło infekcji dla człowieka. Badane grzyby charakteryzowały się wysoką aktywnością enzymatyczną. Niepokojący jest fakt dużej reaktywności Cladosporium cladosporioides, szczepu często izolowanego z pomieszczeń mieszkalnych również przez innych badaczy [3, 9, 13]. Szczep ten cechowała znacząca aktywność enzymatyczna zarówno na podłożu kontrolnym, jak i na podłożach zawierające składniki materiałów budowlanych tj. tapetę, celulozę, skrobię, gips oraz zaprawę murarską. Wydaje się, iż jego obecność w pomieszczeniach mieszkalnych może stanowić realne zagrożenia dla zdrowia ludzi w nich przebywających. Natomiast szczep Alternaria tenuissima w środowisku skrobi oraz Stachybotrys chartarum w obecności skrobi i zaprawy murarskiej nie stanowią takiego zagrożenia. Przeprowadzone badania wykazały, iż materiały te nie sprzyjają wytwarzaniu zewnątrzkomórkowych hydrolaz. Co istotne, zastosowanie środków grzybobójczych zawierających jako substancję czynną siarczan miedzi oraz IV rzędową sól amoniową pozwala na całkowite zahamowanie wydzielania przez pleśnie enzymów zewnątrzkomórkowych odpowiedzialnych za infekcje grzybiczne. 5. Wnioski 1. Rodzaj podłoża budowlanego ma istotny wpływ na patogeniczność grzybów pleśniowych. 2. Nie każde środowisko sprzyja rozwojowi grzybów pleśniowych. Wykazano, iż Alternaria tenuissima na podłożu z dodatkiem skrobi i Stachybotrys chartarum na podłożu z dodatkiem skrobi i zaprawy murarskiej nie wykazują aktywności enzymatycznej. 3. Badane grzyby charakteryzowały się znaczącą aktywnością fosfatazy zasadowej i kwaśnej, esterazy (C4), esterazy lipazy (C8) oraz fosfohydrolazy naftylo-AS-BI – enzymów mogących decydować o przebiegu zakażenia. 4. Poszczególne materiały budowlane mogą stymulować tworzenie odpowiednich enzymów zewnątrzkomórkowych. Stwierdzono uaktywnienie się enzymów pod wpływem substratu budowlanego obecnego w podłożu. W przypadku Cladosporium cladosporioides α-chymotyrypsyny, trypsyny i β-galaktozydazy, Alternaria tenuissima trypsyny, Stachybotrys chartarum arylamidazy waliny. 5. Obecność w środowisku człowieka Cladosporium cladosporioides stanowi zagrożenie dla jego zdrowia, gdyż na podłożach z dodatkiem materiałów budowlanych wykazano wysoką aktywność enzymatyczną. 6. Ze względu na powszechne występowanie grzybów z rodzaju Cladosporium na zawilgoconych materiałach budowlanych zaleca się, w celu zabezpieczenia budynków przed korozją biologiczną, stosowanie materiałów (farb, silikonów, itp.) z dodatkiem fungicydów 7. Zleca się stosowanie jako fungicydów środków zawierających sole miedzi oraz IV rzędowe sole amoniowe, ponieważ w ich środowisku badane grzyby nie wykazują aktywności enzymatycznej. LITERATURA 1. Baran E. (red.): Zarys mikologii lekarskiej. Volumed, Wrocław, 1998. 2. Brasch J., Zaldua M.: Enzyme patterns of dermatophytes. Mycoses, 1994, 37 (1-2), 11-16. 3. Gutarowska B., Piotrowska M.: Wyniki analizy mikologicznej materiałów budowlanych pochodzących z budynków mieszkalnych. VI Międzynarodowa Konferencja Naukowa „Mikotoksyny w środowisku człowieka i zwierząt” Bydgoszcz 2002, 57-64. 4. Hellegren L., Vincent J.: Lipolitic activity of some dermatophytes. J. Med. Mikrobiol., 1980, 13, 155-157. 5. Instytut Techniki Budowlanej. Instrukcja 349/97. Metody zabezpieczeń istniejących budynków mieszkalnych przed szkodliwym działaniem grzybów pleśniowych. Warszawa 1997. 6. Kobierzycka M., Cisło M.: Rola enzymów w patogenezie infekcji grzybiczych. Mikol. Lek., 2005, 12 (3), 207-210. 7. Koziróg A., Żakowska Z., Kuberski S., Brycki B.: Morfologia grzybów strzępkowych opornych na działanie nowego preparatu grzybobójczego. III Konferencja Naukowa „Rozkład i Korozja Mikrobiologiczna Materiałów Technicznych” Łódź 2003, 373-377. 8. Nabrdalik M., Latała A.: Występowanie grzybów strzępkowych w obiektach budowlanych. Roczniki PZH, 2003, 54, 1, 119-128. 9. Piotrowska M., Żakowska Z., Bogusławska-Kozłowska J.: Charakterystyka grzybów strzępkowych występujących na przegrodach budowlanych wybranych budynków Łodzi. Ogólnokrajowa Konferencja Naukowa „Rozkład i Korozja Mikrobiologiczna Materiałów Technicznych” Łódź 2000, 67-69. 10. Plomer-Niezgoda E., Baran E., Cisło M., Hryncewicz-Gwóźdź A., Walów B.: Badanie aktywności enzymów hydrolitycznych wybranych grzybów pleśniowych i drożdżaków przy użyciu testu API ZYM. Mikol. Lek., 1998, 5 (3), 157-164. 11. Plomer-Niezgoda E., Baran E., Maj J., Czarnecka A., Hryncewicz-Gwóźdź A: Patogenność grzybów z rodzaju Alternaria, Cladosporium i Chrysosporium. Mikol. Lek., 1998, 5 (3), 187-190. 12. Saenz-de-Santamaria M., Guisantes J.A., Martinez J.: Enzymatic activities of Alternaria alternata allergenic extracts and its major allergen (Alt a 1). Mycoses, 2006, 49, 288292. 13. Zyska B.: Grzyby powietrza wewnętrznego w krajach europejskich. Mikol. Lek., 2001, 8 (3-4), 127-140. Informacje o Autorze Dr Małgorzata Nabrdalik - magisterium: Wyższej Szkoły Pedagogicznej w Opolu, Wydział Matematyki, Fizyki i Chemii 1993; doktorat: Politechnika Opolska, Wydział Budownictwa 2004. Temat pracy: „Analiza możliwości ograniczenia zanieczyszczeń mikologicznych budynków”. Miejsce zatrudnienia: Uniwersytet Opolski, Wydział Przyrodniczo-Techniczny, Katedra Biotechnologii i Biologii Komórki. Zainteresowania zawodowe: dotyczą mikologii budowlanej, a w szczególności zagadnień związanych z występowaniem oraz sposobem zwalczania grzybów w budynkach mieszkalnych. Podstawą kwalifikacji jest ukończenie w 2001 roku kursu mykologiczno-budowlanego „Ochrona budynków przed korozją biologiczną”, prowadzonego przez Polskie Stowarzyszenie Mykologów Budownictwa we Wrocławiu Adres korespondencji Dr Małgorzata Nabrdalik Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej UO ul. Kominka 4, 45-035 Opole tel. +48 77 401 60 56, +48 77 401 60 50 e-mail: [email protected] Biuletyn Urzędu Patentowego 2007, nr 14 (875) Sposób otrzymywania polieterów Twórcy: Stolarzewicz Andrzej, Grobelny Zbigniew, Morejko Barbara, Piekarnik Beata · Firma: Uniwersytet Śląski w Katowicach, Katowice · Zgłoszenie 378664, s. 11 Sposób wykrywania wad struktur warstwowych i urządzenie do wykrywania wad struktur warstwowych Twórcy: Gronowska Irena, Latuszek Antoni, Borowik Łukasz, Lipiec Konrad, Orzechowski Jan, Trzciński Marcin, Tykarski Leonard · Firma: Politechnika Warszawska, Warszawa · Zgłoszenie 378672 s. 19 2007, nr 15 (876) Sposób otrzymywania pigmentów z dwutlenku tytanu o ograniczonej fotoaktywności Twórcy: Morawski Antoni Waldemar, Wawrzyniak Beata · Firma: Politechnika Szczecińska, Szczecin · Zgłoszenie 378676, s. 9 2007, nr 20 (881) Smar stały topliwy do ciśnieniowych maszyn odlewniczych Twórcy: Rakoczy Jan, Chmura Mieczysław, Fajkiel Aleksander, Bodora Kazimierz · Firma: Politechnika Krakowska im. Tadeusza Kościuszki, Kraków · Zgłoszenie 379234, s. 16 Sposób wytwarzania kompozycji polimerowych z termoplastycznymi tworzywami proszkowanymi Twórcy: Sterzyński Tomasz, Królikowski Bogusław, Jakubowska Paulina · Firma: Instytut Przetwórstwa Tworzyw Sztucznych METALCHEM, Toruń · Zgłoszenie 379305, s. 16–17 Dekoracyjny pęczniejący środek bioi ogniochronny Twórcy: Budziak Tomasz, Czarnecki Zbigniew, Kobiela Stanisław, Krajewski Krzysztof Jan, Rasz Przemysław, Thiel Alojzy · Firma: ICOPOL S.A., Zduńska Wola · Zgłoszenie 379336, s. 9–10 Bio- i wodochronny impregnat do drewna Twórcy: Budziak Tomasz, Czarnecki Zbigniew, Kobiela Stanisław, Krajewski Krzysztof Jan, Rasz Przemysław, Thiel Alojzy · Firma: ICOPOL S.A., Zduńska Wola · Zgłoszenie 379335, s. 10 Sposób wytwarzania alkoksylatów i urządzenie do realizacji tego sposobu Twórcy: Malone Richard, US; Ziółkiewicz-Dydak Agnieszka · Firma: HH Technology Corporation, Beverly, US · Zgłoszenie 382154, s. 15 Sposób eliminacji zjawisk fretingu i trybokorozji na powierzchni części maszyn bezpośrednio współpracujących ze sobą Twórcy: Buchholz Andrzej, Suwalski Ryszard, Gumny Wiesław · Firma: Buchholz Andrzej, Szczecin · Zgłoszenie 379254, s. 18 33
