Ziemniak Polski - IHAR
advertisement
Ziemniak Polski 2010 nr 1 1 Ochrona NOWE METODY DIAGNOSTYCZNE DO WYKRYWANIA FITOPATOGENNYCH BAKTERII ZIEMNIAKA dr inż. Włodzimierz Przewodowski, dr inż. Agnieszka Barnyk IHAR, Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Biochemii w Boninie e-mail: [email protected] F itopatogenne bakterie są jedną z przyczyn strat ekonomicznych w produkcji ziemniaków. Ze względu na szeroki zakres wywoływanych przez nie symptomów chorobowych diagnostyka mikroorganizmów chorobotwórczych jest uciążliwa. Ponadto bakterie często występują w tkankach ziemniaka w niskiej koncentracji, co znacznie utrudnia ich identyfikację. Często jedynym sposobem ograniczenia występowania i eliminacji infekcji powodowanych przez bakterie chorobotwórcze ziemniaka jest dobór właściwej metody diagnostycznej. Powinna ona być odpowiednio czuła, szybka i wiarygodna. W celu zmniejszenia ryzyka rozprzestrzenienia się chorób wywoływanych przez drobnoustroje ich obecność powinna być monitorowana na każdym z etapów produkcji i dystrybucji materiału roślinnego. Oto przegląd nowych oraz stosowanych dotychczas klasycznych metod wykrywania i identyfikacji bakteryjnych patogenów ziemniaka. Tradycyjne metody diagnostyczne Tradycyjne metody identyfikacji bakterii opierają się na dobrze opracowanych, lecz niejednokrotnie czasochłonnych metodach mikrobiologicznych. Wymagają one z reguły zastosowania odpowiedniego podłoża, optymalnej temperatury, a następnie identyfikacji izolowanych drobnoustrojów na podstawie wyglądu kolonii oraz biochemicznej i fizjologicznej charakterystyki ich właściwości. W przypadku roślin wykazujących wyraźne symptomy choroby bakterie izoluje się na pożywkach selektywnych, natomiast do rutynowych hodowli czystych kultur bakterii stosuje się mineralne podłoża wzrostowe. Do oceny zjadliwości wyizolowanych kultur bakteryjnych stosuje się dodatkowo test biologiczny polegający na zakażaniu roślin wskaźnikowych, takich jak np. tytoń czy bakłażan. Już pod koniec lat 70. ubiegłego stulecia w detekcji bakteryjnych patogenów ziemniaka zaczęto stosować testy serologiczne. Tego typu oznaczenia mimo stosunkowo szybko uzyskiwanych wyników nie znalazły zastosowania w rutynowej analizie dużej ilości prób. Dopiero opracowanie immunoenzymatycznej metody ELISA pozwoliło na zwiększenie przepustowości, czułości i automatyzację testów immunologicznych. Test o nazwie ELISA, oparty na wykorzystaniu przeciwciał rozpoznających specyficzne patogeny (wirusy i bakterie) oraz reakcji enzymatycznej dającej barwny produkt mierzalny kolorymetrycznie, pomimo wymienionych zalet nie pozwala na bezpośrednią obserwację morfologii komórek bakteryjnych. Możliwość taką daje natomiast test pośredniej immunofluorescencji – IF (Slack i in. 1979; De Boer, Copeman 1980). Polega on na wybarwieniu za pomocą chemicznie przyłączonego barwnika fluorescencyjnego. Barwnik pod wpływem światła UV świeci, co umożliwia obserwację bakterii za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. 2 Ziemniak Polski 2010 nr 1 Zastosowanie testów serologicznych w kombinacji z innymi metodami korzystnie wpłynęło na zwiększenie czułości i specyficzności metod diagnostycznych. Przykładem może być test immunoenzymatyczno-filtracyjny (ELIFA) oparty na wykrywaniu bakterii związanych na filtrze przeciwciałami znakowanymi enzymem – peroksydazą. Obecność enzymu jest wykrywana w reakcji barwnej lub za pomocą chemiluminescencji. Dla wzmocnienia uzyskanego sygnału w testach immunologicznych stosuje się połączenia metod wykorzystujących białko A, digoksygeninę, układ biotyna-streptawidyna czy też układ kilku enzymów (peroksydaza, oksydaza glukozy, alkaliczna fosfataza). Wraz z upowszechnieniem się molekularnych technik diagnostycznych stosowano metody hybrydyzacji, czyli łączenia się jednoniciowych cząstek kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) w struktury dwuniciowe, z wykorzystaniem tzw. sond molekularnych będących znacznikami reakcji (Firrao 1990). W porównaniu z metodami serologicznymi hybrydyzacja DNA okazała się metodą mniej czułą, lecz bardziej specyficzną. Czułość molekularnych metod detekcji i identyfikacji bakterii znacznie zwiększono, namnażając fragmenty DNA techniką PCR, czyli łańcuchową reakcją polimerazy (Schneider i in. 1993). Niestety, wadą klasycznej metody PCR jest możliwość wystąpienia fałszywie negatywnych wyników wskutek obecności w ekstraktach tkankowych substancji zakłócających reakcję syntezy DNA. Trudność tę przełamano, stosując wstępne namnażanie drobnoustrojów na podłożach selektywnych, jak również wychwytywanie bakterii z ekstraktów na różnych nośnikach przy użyciu przeciwciał. Nowe metody diagnostyczne Dla polepszenia diagnostyki chorób ziemniaka poza metodami tradycyjnymi coraz częściej stosuje się nowoczesne, szybko rozwijające się techniki identyfikacji drobnoustrojów. Nowe protokoły są opracowywane i optymalizowane w przeciągu kilku miesięcy. Dodatkowo coraz powszechniej stosowana automatyzacja testów diagnostycznych przyczynia się do znacznego wzrostu wydajności i efektywności wykonywanych analiz. Test o nazwie Multiplex PCR pozwala na jednoczesne wykrywanie odpowiednich fragmentów DNA oraz namnożonego DNA rośliny gospodarza, co stanowi wewnętrzną kontrolę poprawności przebiegu reakcji. Test Multiplex PCR-ELISA, dzięki połączeniu metod molekularnej i serologicznej, daje wyższą specyficzność w porównaniu z testami serologicznymi i jest czulszy od standardowego testu PCR (Mills, Russell 2003). W pierwszym etapie testu namnaża się trzy specyficzne fragmenty DNA bakterii różnej wielkości, a następnie identyfikuje za pomocą testu ELISA. Test Multiplex PCR-ELISA poza wysoką specyficznością pozwala wyeliminować reakcje fałszywie pozytywne. W opracowanej przez Lee i innych (2001) metodzie „dig-labeled PCR” namnożony fragment DNA z przyłączoną digoksygeniną jest nanoszony na nylonową błonę i wykrywany za pomocą reakcji immunoenzymatycznej. W odróżnieniu od techniki „dig-labeled PCR” w metodzie PCR-ELOSA reakcję immunoenzymatyczną przeprowadza się w mikropłytkach, stosując oprócz digo-ksygeniny także biotynę, streptawidynę oraz koniugat przeciwciał z peroksydazą. Wynik reakcji odczytywany jest kolorymetrycznie. Technika ELOSA okazała się o 13% czulsza w stosunku do technik PCR z użyciem elektroforezy i pozwala z jednakową czułością wykrywać szczepy bakterii zarówno pokrytych śluzem, jak i szczepy pozbawione śluzu (Baer i in. 2001). Ujemną stroną większości metod molekularnych jest brak możliwości odróżnienia bakterii żywych od martwych. Możliwość taką dają metody: fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ – FISH (Lee i in. 1997), techniki BIO-PCR z zastosowaniem pomiaru przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym – Real-Time PCR (Schaad i in. 1999) oraz metoda namnażania kwasu nukleinowego w stałej temperaturze – NASBA (Van Beckhoven i in. 2002). W metodzie FISH odpowiedni sposób barwienia komórek bakteryjnych za pomocą dwóch barwników fluorescencyjnych pozwala różnicować komórki na martwe i żywe. Pierwszy z barwników połączony z przeciwciałem łączy się z powierzchnią komórek. Drugi, połączony z tzw. sondą, wnika do Ziemniak Polski 2010 nr 1 wnętrza żywych komórek i łączy się z bakteryjnym kwasem rybonukleinowym RNA. Technika Real-Time PCR jest jedną z najnowszych technik stosowanych coraz powszechniej do identyfikacji wielu bakteryjnych patogenów roślin. Jej istotą jest na-mnażanie materiału genetycznego w oparciu o klasyczną technikę PCR z zastosowaniem barwników fluorescencyjnych (np. TaqMan, Molecular Beacon, SYBR Green I itd.). Przyrost produktów ocenia się ilościowo poprzez pomiar fluorescencji w czasie prowadzenia reakcji. Technika ta ma wiele zalet, ponieważ pozwala na ilościowe oznaczanie bakterii i jest szybsza niż tradycyjny PCR. Wadą jest wysoki koszt urządzenia oraz odczynników. W metodzie TaqMan BIO-PCR w pierwszym etapie namnaża się bakterie na pożywce, a następnie prowadzi standardową reakcję Real-Time PCR. Połączenie BIO-PCR z systemem TaqMan pozwala na zwiększenie czułości testu nawet do 10 komórek bakteryjnych w mieszaninie reakcyjnej oraz osłabienie wpływu substancji zakłócających przebieg reakcji PCR (Schaad i in. 1999). Rozwój nowych technologii, opracowanie nowych materiałów i znaczników spowodowało, że spośród metod immunologicznych coraz częściej doceniane ze względu na szybkość i specyficzność są testy typu Lateral flow, nazywane również immunochromatograficznymi testami paskowymi (Verheijen i in. 1998, Wang i in. 2005). Są to testy stosowane do jakościowej lub półilościowej identyfikacji patogenów bakteryjnych. W zależności od konstrukcji testu pozwalają one na wykrywanie jednej lub więcej bakterii wyizolowanej z ekstraktu na tym samym pasku. Ekstrakt z tkanki ziemniaka nanosi się na końcówkę paska pokrytego przeciwciałami połączonymi ze znacznikiem pozwalającym zaobserwować barwną linię, świadczącą o obecności danego patogenu. W testach tych stosuje się najczęściej złoto koloidalne – jeden z najczulszych znaczników stosowanych w diagnostyce bakteriologicznej. Ze względu na czułość testu odpowiadającą czułości metod IF i ELISA oraz kilkuminutowy czas analizy testy tego typu są coraz chętniej stosowane jako wstępne testy przesiewowe. Ich dodatkową zaletą jest łatwość użycia i możli- 3 wość stosowania poza laboratorium, np. w polu, przechowalni, bez konieczności stosowania dodatkowych urządzeń. Wadą jest natomiast relatywnie wysoki koszt pojedynczego testu w stosunku do innych testów laboratoryjnych. W Pracowni Diagnostyki Molekularnej i Biochemii IHAR w Boninie opracowano nowy test filtracyjny typu Flow-Through do szybkiej i specyficznej identyfikacji czystych szczepów bakterii Cms (Przewodowski, Barnyk 2009). Do jego opracowania wykorzystano porowatą błonę filtracyjną zatrzymującą komórki bakteryjne oraz złoto koloidalne jako znacznik. Cząsteczki złota koloidalnego połączone z przeciwciałami anty-Cms tworzą na ich powierzchni barwną otoczkę. Tak wybarwione bakterie są następnie przepuszczane przez błonę filtracyjną i obserwowane w postaci barwnych plam na powierzchni. Technika ta pozwala skoncentrować bakterie na małej powierzchni z dużej objętości ekstraktu. Test ten w odróżnieniu od testu typu Lateral flow umożliwia jednoczesną analizę wielu próbek przy minimalnym nakładzie kosztów, a obserwacja wybarwionych komórek bakteryjnych może być prowadzona przy użyciu klasycznego mikroskopu optycznego. Efektem badań prowadzonych w Pracowni Diagnostyki Molekularnej i Biochemii ZNiOZ w Boninie jest również test immunofiltracyjny będący połączeniem immunofiltracji oraz metody immunofluorescencji pośredniej. Metodę opracowano, wykorzystując porowate błony filtracyjne, na które punktowo naniesiono przeciwciała skierowane na komórki bakterii Cms (Przewodowski 2009). Filtracja ekstraktu z bulw ziemniaka przez taką błonę pozwala wyłapać komórki bakterii Cms przy jednoczesnym usunięciu innych bakterii. Wyłapane bakterie znakuje się następnie za pomocą przeciwciał anty-Cms połączonych z barwnikiem fluorescencyjnym i obserwuje pod mikroskopem. Błonę z wyłapanymi komórkami bakterii można też umieścić na półselektywnej pożywce i w ten sposób uzyskać czyste szczepy bakterii Cms. Literatura 1. Baer D., Mitzel E., Pasche J., Gudmestad N. 2001. PCR detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus – infected tuber samples in a plate capture assay. – Am. J. Potato Res. 78 (4): 269-277; 4 Ziemniak Polski 2010 nr 1 2. De Boer S. H., Copeman R. J. 1980. Bacterial ring rot testing with the indirect fluorescent antibody staining procedure. – Am. Potato J. 57: 457-465; 3. Firrao G. 1990. Cloned diagnostic probe for Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Bull. OEPP 20: 207- -213; 4. Lee I-M., Bartoszyk I. M., Gundersen R. E., Mogen B., Davis R. E. 1997. Nested PCR for Ultrasensitive Detection of the Potato Ring Rot. Bacterium Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. – Appl. Environ. Microbiol. 7: 2625-2630; 5. Lee I.-M., Lukaesko L. A., Maroon C. J. M. 2001. Comparison of dig-labeled PCR, nested PCR, and ELISA for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in field grown potatoes. – Plant Dis. 85: 261266; 6. Mills D., Russell B. W. 2003. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato Stems and Tubers by Multiplexed PCR-ELISA. – Am. J. Potato Res. 80: 223-234; 7. Przewodowski W. 2009. Szybki immunologiczny test do identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. [W:] Nasiennictwo i ochrona ziemniaka. Konf. nauk.-szkol. Darłówko, 21- -22.05.2009. IHAR ZNiOZ Bonin: 78; 8. Przewodowski W., Barnyk A. 2009. Szybki test do identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. – Prog. Plant Prot. 49 (2): 696-700; 9. Schaad N. W., Berthier-Schaad Y., Sechler A., Knorr D. 1999. Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR and an automated real-time fluorescence detection system. – Plant Dis. 83: 1095-1100; 10. Schneider B. J., Zhao J. L., Orser C. S. 1993. FEMS Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by DNA amplification. – Microbiol. Letters 109 (2-3): 207-212; 11. Slack S. A., Sanford H. A., Manzer F. E. 1979. The latex agglutination test as rapid serological assay for Corynabacterium sepedonicum. – Am. Potato J. 56: 441-446; 12. Wang S., Zhang C., Wang J., Zhang Y. 2005. Development of colloidal gold-based flow-through and lateral-flow immunoassays for the rapid detection of the insecticide carbaryl. – Analytica Chimica Acta 546: 161-166; 13. Van Beckhoven J. R., Stead D. E., Van der Wolf J. M. 2002. Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus by AmpliDet RNA, a new technology based on real time monitoring of NASBA amplicons with a molecular beacon. – J. Appl. Microbiol. 93 (5): 840-849; 14. Verheijen R., Stouten P., Cazemier G., Haasnoot W. 1998. Development of a one step strip test for the detection of sulfadimidine residues. – Analyst 123: 24372441
