Strukturalne aspekty miRNA swoistych dla guzów mózgu

dr hab. Piotr Mucha, prof. UG
Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii, Wita Stwosza 63, Gdańsk 80-308
tel. 0585235432, e-mail: [email protected]
Gdańsk, 23.04.2015
Recenzja pracy doktorskiej mgr Agnieszki Belter zatytułowanej „Strukturalne aspekty miRNA
swoistych dla guzów mózgu”
Ubiegły wiek był okresem wielu przełomów w nauce, które na zawsze zmieniły nasze widzenie świata w
którym żyjemy. Jednym z najbardziej spektakularnych było odkrycie na początku lat 80-tych XX w. przez S.
Altmana i T. Cecha (NN 1989 r.) rybozymów – cząsteczek RNA o właściwościach katalitycznych RNA.
Odkrycie rybozymów całkowicie zmieniło dotychczasową „ugruntowaną” wiedzę na temat roli RNA w
metabolizmie komórki. Przed odkryciem rybozymów rola kwasów nukleinowych w komórce wydawała się
być dobrze określona. DNA magazynował i przy pomocy białek „uaktywniał” zapisaną w nim informację, a
RNA w postaci mRNA, tRNA i rRNA pełniły funkcję pomocniczą umożliwiając przepisanie kodu
genetycznego na sekwencje białek. Odkrycie Altmana i Cecha uzmysłowiło nam, że to, co uważaliśmy za
dobrze poznany aspekt funkcjonowania komórki okazało się jedynie czubkiem góry lodowej. Ta pozostająca
poza zasięgiem wzroku część „góry”, to właśnie tak niedocenione RNA, które jak się później okazało, jest
pierwszoplanowym graczem uczestniczącym w procesie regulacji ekspresji informacji genetycznej, a nie
jedynie biernym obserwatorem lub ewentualnie pomocnikiem. Dzięki odkryciu rybozymów rodzina RNA
rozrosła się błyskawicznie i obecnie liczy przynajmniej kilkunastu członków w postaci różnych rodzajów
cząsteczek RNA. Jednym z najmłodszych jest mikroRNA (miRNA). Obecnie trudno znaleźć etap ekspresji
informacji genetycznej, w który w jakiś sposób nie byłby zaangażowany jakiś rodzaj cząsteczek RNA.
Odkrycie miRNA było istotnym krokiem na drodze do poznania molekularnych mechanizmów ekspresji i
regulacji informacji genetycznej. MiRNA są krótkimi, liczącymi ok. 20 nt niekodującymi ssRNA
regulującymi na poziomie post-transkrypcyjnym procesy komórkowe, takie jak wzrost, różnicowanie,
proliferacja czy apoptoza. Ze względu na udział w regulacji ekspresji informacji genetycznej, zaburzenia
aktywności mikroRNA mogą mieć istotne znaczenie w procesach inicjacji i rozwoju chorób nowotworowych.
Zwiększone ryzyko nowotworzenia może być wynikiem aktywacji onkogenów, jak i hamowania genów
supresorowych. Oznacza to, że w zależności od funkcji miRNA, zarówno spadek, jak i wzrost ich stężenia w
komórce mogą sprzyjać lub być objawem procesu kancerogenezy.
1
Choroby nowotworowe są jedną z „plag” związanych ze zdrowiem współczesnego człowieka. Wśród nich
jednymi z najgorzej rokujących są nowotwory OUN, a guzy mózgu (zwłaszcza te złośliwe) stanowią jedną z
najpoważniejszych przyczyn jego zaburzeń. Schorzenia te rozwijają się często niepostrzeżenie, a objawy
neurologiczne bywają trudne do stwierdzenia. Z tego powodu ich wczesna diagnostyka i terapia są dla
pacjenta kwestią życia lub śmierci. W ciągu ostatnich lat obserwuje się intensywny rozwój badań nad
patogenezą guzów mózgu. Ich wyniki pozwalające w coraz pełniejszym stopniu zrozumieć mechanizm
powstawania guzów mózgu, przyczyniają się do opracowywania znacznie skuteczniejszych metod leczenia,
jak również oceny możliwości zapobiegania ich powstawania i wzrostu. W ostatnich latach dokonuje się
przełom w dziedzinie genetyki polegający na coraz lepszym rozumieniu biologicznej roli niekodującego
RNA. Odkrycie miRNA zmieniło sposób postrzegania procesu nowotworzenia. Obecnie znamy wiele
przykładów związku zaburzeń ekspresji mikroRNA z występowaniem różnych chorób, co stanowi podstawę
poszukiwań nowych strategii terapeutycznych. Komórkowy świat miRNA jest prawdziwą terra incognita. Z
jak skomplikowanym fenomenem mamy do czynienia niech świadczy fakt, że liczba genów kodujących
miRNA u człowieka szacowana jest na ok. 1000, a jednocześnie miRNA zaangażowane jest w regulację
przynajmniej połowy (a prawdopodobnie znacznie więcej) mRNA genów białkowych. Korelując ten fakt z
niewielkim rozmiarem cząsteczek miRNA wyraźnie widać, że regulacja aktywności mRNA daleko wykracza
poza klasyczną komplementarność (tworzenie par WC) oddziałujących ze sobą sekwencji.
Glejak wielopostaciowy (ang. Glioblastoma Multiforme, GBM) jest najczęściej występującym u ludzi,
najbardziej złośliwym oraz źle rokującym pierwotnym guzem mózgu. Jego naciekający wzrost i intensywna
migracja zmienionych nowotworowo komórek w obrębie otaczającej tkanki nerwowej sprawiają, że walka z
nim należy do wyjątkowo trudnych. Ze względu na specyficzny sposób wzrostu guza, jego całkowite
chirurgiczne usunięcie jest problematyczne. W komórkach GBM miRNA mogą pełnić funkcje zarówno
supresorów nowotorowych, jak i czynników onkogennych, co predeterminuje je jako potencjalny cel
terapeutyczny oraz narzędzie w diagnostyce i terapii guzów mózgu. Z jak poważnym problemem problemem
medycznym mamy do czynienia w przypadku GBM, niech świadczy dość powszechne określenie jakie
przylgnęło do tej choroby, że „glejak to wyrok śmierci rozciągnięty w czasie”.
W nurt badań nad strukturą i rolą miRNA w kontekście procesu onkogenezy w guzach mózgu włączyła się
Doktorantka. Rozprawa doktorska mgr Agnieszki Belter zatytułowana „Strukturalne aspekty miRNA
swoistych dla guzów mózgu” powstała w Zespole Kwasów Nukleinowych Zakładu Biologii RNA Instytutu
Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu, kierowanym przez prof. dr hab. Mirosławę
Naskręt-Barciszewską, będącą również promotorem rozprawy. Promotorem pomocniczym była
2
dr Katarzyna Rolle. Zarówno środowisko naukowe Zespołu, jak i ICHB PAN, jednych z najbardziej
liczących się polskich i światowych ośrodków zajmujących się tematyką RNA z całą pewnością ułatwiło
Doktorantce pracę nad fascynującym i jednocześnie mało dotychczas poznanym problemem funkcji
niekodujących, w tym miRNA w procesie onkogenezy guzów mózgu.
Recenzowana dysertacja zawiera wyniki badań Doktorantki dotyczących typowania miRNA istotnych dla
guzów GMB, oceną ich przydatności jako celu molekularnego terapii, charakterystyce strukturalnej i
biochemicznej wytypowanych miRNA i ich prekursorów, projektowania i charakterystyki rybo- i
DNAzymów skierowane przeciwko wytypowanym miRNA. Mimo, iż ten zwięzły opis mieści się w kilku
linijkach tekstu, każdy kto spędził trochę czasu w laboratorium biochemicznym zdaje sobie sprawę, że
realizacja tych badań wymagała od Doktorantki ogromnego nakładu pracy i pełnego zaangażowania w
realizowane badania.
W ramach przedstawionej do recenzji dysertacji Doktorantka wykonała analizę mikromacierzową
profilu miRNA tkanek guza mózgu i porównując go z tymi uzyskanymi z tkanek zdrowych wytypowała
miRNA, których poziom został istotnie zmieniony w wyniku procesu nowotworzenia. Wytypowane miRNA
zostały następnie scharakteryzowane przez Doktorantkę jako potencjalne cele terapii przeciwnowotworowej.
Doktorantka metodami spektroskopowymi (NMR, CD, UV), biochemicznymi (ograniczone cięcie enzymami
restrykcyjnymi lub jonami ołowiu) oraz przy pomocy algorytmów komputerowych i zaprojektowanych
narzędzi typu anty-miRNA, scharakteryzowała strukturę i zachowanie w komórce wytypowanych miRNA.
Doktorantka pokazała również, że miRNA mogą wiązać się z białkami komórkowymi nie będącymi
elementami kompleksu RISC, klasycznej ścieżki w oparciu o którą działają miRNA. Zaprojektowała i
scharakteryzowała narzędzia w postaci rybo- i DNAzymów, hamujące aktywność wybranych miRNA w
komórkach nowotworowych. Wszystkie wymienione aspekty przeprowadzonych przez Doktorantkę
eksperymentów mają charakter nowości naukowej.
Badania doktorantki miały charakter zarówno badań podstawowych, dostarczających nowych informacji o
strukturze i mechanizmach działania miRNA w komórce, jak również aplikacyjnych, o czym świadczą dwa
patenty mające chronić potencjalne farmakologiczne zastosowanie badanych rybozymów i miRNA. Badania
Doktorantki potencjalnie mogą przyczynić się do stworzenia nowych narzędzi terapeutycznych w postaci
leków opartych o cząsteczki RNA. Z tego punktu widzenia wybór tematu pracy doktorskiej uważam za
bardzo trafną i bardzo dobrze umotywowaną pod względem merytorycznym decyzję. Zrealizowanie ogromu
zaplanowanych badań eksperymentalnych i obliczeniowych/teoretycznych z pewnością wymagało od
3
Doktorantki nie tylko dużej wiedzy, lecz również dużego wysiłku i czasu spędzonego zarówno przy stole
laboratoryjnym, jak również przed monitorem komputera.
Formalna ocena rozprawy. Recenzowana rozprawa zawiera 210 stron tekstu. Praca zawiera 9
nienumerowanych rozdziałów, wśród których znajdują się: wprowadzenie i cel pracy (4 strony), wykaz
skrótów stosowanych w pracy (3 str), tzw. opracowanie literaturowe opisujące Strukturę i funkcję małych
RNA (25 str), materiały i metody (40 str), najobszerniejszy-wyniki i dyskusja (102 str), podsumowanie (1
str), referencje (18 str, 251 pozycji literaturowych), streszczenie (2 str) oraz abstrakt (2 str). W rozprawie
zawarta jest również informacja o aktywności publikacyjnej doktorantki w postaci 1 publikacji w PLOS One
(IF 3,5), gdzie Doktorantka jest pierwszym autorem, 3 manuskryptów (bez informacji o aktualnym statusie),
dwóch zgłoszeń patentowych (polskiego i międzynarodowego) oraz posteru konferencyjnego. Pokazuje to
dobry jakościowo dorobek naukowy doktorantki, a także umiejętność komercjalizowania uzyskanych
wyników badań poprzez ich patentowanie. Fakt, że Doktorantka jest pierwszym autorem publikacji w dobrym
czasopiśmie, co świadczy o jej samodzielności i dużej znajomości badanych przez nią zagadnień oraz wagi
badanego problemu.
Wstęp dysertacji zawiera krótki rys historyczny odkryć związanych z różnymi rodzajami RNA oraz
charakterystykę strukturalną samej cząsteczki RNA. W tym rozdziale Doktorantka przedstawia także krótki
opis korelacji pomiędzy strukturą i komórkową funkcją RNA. Najbardziej wartościowym fragmentem tej
części rozprawy jest charakterystyka miRNA i ich rola w komórkach GMB. Fragment ten mógłby posłużyć
jako rdzeń niezwykle użytecznego artykułu przeglądowego o nowatorskim pomyśle na terapię guzów mózgu.
W najobszerniejszej części dysertacji zatytułowanej „Wyniki i dyskusja”, Doktorantka przedstawia wyniki
badań nad miRNA wyselekcjonowanymi jako potencjalne cele terapii przeciwnowotworowej w komórkach
GMB. Lektura tej części pracy doktorskiej pokazuje dużą wiedzę i doświadczenie eksperymentalne
Doktorantki, pozwalające jej na rozwiązanie postawionych przed nią problemów i zwięzłe przedstawienie
efektów swojej pracy. Szczególnie wyraźnie widać to w miejscach, gdzie Doktorantka interpretuje uzyskane
przez siebie wyniki, zastanawia się nad przyczynami ewentualnych niepowodzeń i proponuje rozwiązania
alternatywne. W tej części rozprawy Doktorantka precyzyjnie opisuje wyniki swoich eksperymentów
związanych z profilowaniem miRNA w komórkach GMB, analizą strukturalną wyselekcjonowanych
miRNA, badaniem stabilności miRNA oraz ich oddziaływania z białkami komórkowymi, a także aktywność
zaprojektowanych przez siebie rybo- i DNAzymów anty-miRNA. Doktorantka wykazuje się dużą
sprawnością i w projektowaniu i wykonywaniu opisywanych eksperymentów mających dać jej odpowiedź na
postawione pytania. W wypadku niepowodzeń Doktorantka potrafi wytłumaczyć ich przyczyny i/lub
4
zaproponować rozwiązania alternatywne. Efektem tego są niezwykle ciekawe i wartościowe wyniki
uzyskane przez Doktorantkę na temat aspektów strukturalnych i biochemicznych cząsteczek miRNA w
guzach GMB. Podsumowując tą część rozprawy muszę stwierdzić, że stanowi ona wynik ogromu pracy
włożonej przez młodą ale już doświadczoną badaczkę, potrafiącą wykorzystywać własną wiedzę do
rozwiązywania postawionych przed nią problemów z pogranicza biochemii i biologii molekularnej.
Z obowiązku recenzenta muszę przedstawić również kilka uwag krytycznych, które nasunęły mi się
po lekturze. Uchybień formalnych jest niewiele. Dysertacja napisana jest „elegancką polszczyzną”, ze
zrozumieniem opisywanych problemów oraz dużą starannością edytorską. Szata edytorska wsparta
rysunkami i fotografiami o bardzo dobrej jakości jest mocną stroną rozprawy.
Dostrzeżone w tekście dysertacji uchybienia.
Określenie cpm dotyczy cząstek beta (elektronów), a nie cząsteczek (str 9). Określenie konformacji wiązania
glikozydowego w nukleotydzie jako cis
i trans uważam za niezbyt fortunne (str. 15). Te określenia
wykorzystywane są raczej do opisu rozkładu podstawników wokół wiązania podwójnego (np. w alkenach), a
i to tylko wtedy gdy z atomami węgla związany jest jeden atom wodoru. W wypadku nukleotydów używane
są określenia syn i anty. Skrót CNS to kalka z języka angielskiego, a odpowiada jej polskie określenie OUN.
Inną kalką językową jest określenie procesowanie widm (chodzi o analizę widm NMR przy pomocy programu
komputerowego, str 65). W całej pracy przewija się niefortunne określenie używane przez Doktorantkę, że
cząsteczka miRNA przyjmuje, „tworzy” lub „ma” strukturę. Każda cząsteczka ma jakąś strukturę. Struktura
nieuporządkowana to też struktura. Rozumiem, że pod pojęciem „posiadania struktury”, Doktorantka rozumie
strukturę uporządkowaną.
Przy profilowaniu miRNA guza GMB, w kontekście pobierania próbek z samego guza i jego obrzeża,
nasunęło mi się pytanie czy sam guz jest strukturą homogenną histologicznie. A jeżeli nie, to na podstawie
jakich cech morfologicznych były wybierane miejsca w obrębie samego guza z których pobierano próbki?
W jaki sposób ustalono granicę między guzem i jego obrzeżem?
Czy doktorantka byłaby w stanie odpowiedzieć na pytanie lub przedstawić własne przemyślenia czy zmiana
poziomu miRNA (zarówno wzrost stężenia, jak i spadek) są przyczyną czy skutkiem procesu nowotworzenia?
Zastosowanie starych sprawdzonych metod, jak temperaturowo zależnej spektroskopii UV do oznaczenia
wartości Tm, a zarazem rozróżnienia spinki od dupleksu, uważam za bardzo dobry pomysł. Jak widać czasami
5
wyrafinowane metody, takie jak NMR nie potrafią rozwiązać takich problemów. Czy elektroforeza PAGE
również nie pomogłaby w rozwiązaniu problemu spinka czy dupleks?
Na str. 127-129 Doktorantka pisze, że równowaga spinka-dupleks ustala się przy konkretnej wartości
stężenia dla wytypowanych miRNA. Z rysunku 2.14 wynika, że taka równowaga ustala się nie przy
konkretnym stężeniu, ale w pewnym zakresie stężeń. Faktem natomiast jest, że przy różnych stężeniach
miRNA, proporcje pomiędzy spinką i dupleksem będą różne.
Czy Doktorantka miałaby jakiś pomysł na rozwiązanie problemu dużego stężenia jonów magnezu (dużo
wyższe od komórkowego), koniecznego dla efektywnego działania zaprojektowanych przez siebie
rybozymów anty-miRNA? Jakie metody można by zastosować w celu zwiększenia stabilności rybo- i
DNAzymów anty-miRNA w komórce?
Poproszę Doktorantkę o wyjaśnienie faktu, że wyniki badań eksperymentalnych pokazują dominację
dupleksu np. dla miR-21, a w opisie tabeli 2.4 widnieje informacja, że zaznaczona na czerwono dominująca
struktura spinki, będąca efektem obliczeń komputerowych jest zgodna z wynikami eksperymentalnych badań
strukturalnych. Zgodziłbym się natomiast z wnioskiem jaki wyciągnęła Doktorantka, że w wypadku stężeń
komórkowych rzędu 200 pM dominującą strukturą powinna być spinka. Rysunek 4.16 jest opisany jako
hydroliza pre-miR-21, a powinno być miR-21. Jak skomentuje Doktorantka fakt, że zastosowane LNA jest
znacznie skuteczniejsze w obniżaniu poziomu endogennej puli miR-21, niż zaprojektowane rybozymy? Co
przemawia za rozwijaniem technologii rybo- bądź DNAzymów anty-miRNA, a nie antysensownych oligo,
chociażby takich jak LNA? Interesującym osiągnięciem Doktorantki jest pokazanie , że miRNA oddziałują z
białkami komórkowymi spoza kompleksu RISC. Czy Doktorantka ma jakiekolwiek informacje bądź sugestie
jakiego rodzaju/klasy są to białka?
Kolejnym intrygującym problemem związanym z potencjalnym zastosowaniem RNA jako leku, jest jego
wprowadzanie do wnętrza komórki. Doktorantka stosowała w tym celu m.in. lipofektaminę. Mimo, że metoda
ta jest niezwykle skuteczna, ani ona, ani np. peptydy penetrujące błonę komórkową (CPP) nie znalazły się
dotychczas na liście związków dopuszczonych do stosowania klinicznego. Transfekowanie komórek
wektorami wirusowymi też znajduje dość ograniczone zastosowanie. Czy Doktorantka potrafi wytłumaczyć
dlaczego?
Powyższe uwagi i zastrzeżenia wynikają jedynie z konieczności wnikliwej i krytycznej analizy rozprawy
doktorskiej, mają w większości charakter polemiczny i w żadnym stopniu nie umniejszają efektów
naukowych osiągniętych przez Kandydatkę.
6
Reasumując, Kandydatka do stopnia naukowego doktora postawiła przed sobą ambitne zdania badawcze i
skutecznie je zrealizowała. Doktorantka wykazała się przy tym nie tylko ogromnym zasobem wiedzy
związanym z prowadzonymi badaniami, lecz również potrafiła tą wiedzę efektywnie wykorzystać
praktycznie.
Połączenie
wiedzy
umożliwiającej
wykorzystanie
szerokiego
wachlarza
technik
eksperymentalnych i niezwykle dużych praktycznych umiejętności Doktorantki czynią z niej
doświadczonego i samodzielnego badacza. Uzyskane wyniki uważam za niezwykle wartościowe. Pozwalają
one na stopniowe odkrywanie tajemnic świata niekodujących RNA. Z całą pewnością przyczynią się one do
lepszego zrozumienia mechanizmów regulacji ekspresji informacji genetycznej kontrolowanych przez
miRNA. Mogą również przyczynić się do opracowania nowej klasy leków XXI w. opartych na RNA, gdzie
miRNA będzie zarówno celem terapeutycznym, jak i czynnikiem farmakologicznym pozwalającym na
regulowanie zaburzeń procesów metabolicznych komórki.
Z pełnym, przekonaniem stwierdzam, że recenzowana przeze mnie dysertacja zawiera elementy nowości o
wysokich walorach naukowych, spełnia ustawowe i zwyczajowe wymagania stawiane rozprawom
doktorskim i wnoszę do Rady Naukowej IChB PAN o dopuszczenie mgr Agnieszki Belter do dalszych etapów
przewodu doktorskiego. Równocześnie ze względu na wartość naukową uzyskanych wyników, umiejętne i
efektywne połączenie badań podstawowych (eksperymentalnych i teoretycznych) z aspektem aplikacyjnym
w postaci dwóch patentów, wnoszę o wyróżnienie rozprawy doktorskiej mgr Agnieszki Belter.
7