Stwardnienie rozsiane (SM - Sclerosis Multiplex) jest ciężką

Nr rejestracyjny: 2016/23/N/NZ4/03355; Kierownik projektu: lek. Marcin Marek Bakalarz
Stwardnienie rozsiane (SM - Sclerosis Multiplex) jest ciężką, przewlekłą chorobą neurologiczną, o
podłożu autoimmunologicznym. Dotyczy głównie osób w wieku od 20 do 40 r.ż, jest jedną z
głównych przyczyn niepełnosprawności ludzi młodych. Polska zaliczana jest do krajów o wysokiej
częstości występowania SM, jest to co najmniej 100 przypadków/100 000. Szacuje się, że obecnie
choruje na nią 50-80 tys Polaków, a na całym świecie 2,5 mln ludzi. Istotą choroby jest
powstawanie ognisk zapalnych oraz degradacja osłonek mielinowych nerwów (demielinizacja) w
obrębie istoty białej ośrodkowego układu nerwowego, co prowadzi do upośledzenia przewodnictwa
nerwowego. Jak dotąd, pomimo licznych badań, nie ma pewności co do przyczyny tej choroby.
Aktualnie wiele badań obejmuje wpływ czynników środowiskowych na wystąpienie SM.
Niewątpliwie najwięcej dowodów ma hipoteza związku zakażenia wirusem Epsteina-Barr (EBV)
na zapadalność na SM, ponadto w ostatnim czasie w wielu najnowszych badaniach wykazano, że
przebyta infekcja EBV jest niezbędna do wystąpienia tej choroby. EBV jest powszechnie
występującym wirusem w środowisku ludzkim, należy do grupy Herpes, jego materiał genetyczny
to DNA, wywołuje mononukleazę zakaźną, często przechodzi w stan latencji. Do zakażenia
wirusem dochodzi na drodze kropelkowej. EBV zaraża głownie limfocyty B, w każdym wypadku
infekcji wirus powoduje wytworzenie limfocytów B pamięci, w których wirus utrzymuje się przez
wiele lat. W ostatnim czasie bardzo duże znaczenie ma hipoteza o roli limfocytów B w rozwoju
stwardnienia rozsianego, ma ona swoje potwierdzenie w aktualnych celach terapeutycznych tej
choroby, bowiem mechanizm działania najnowszych leków takich jak ocrenlizumab, rituximab oraz
ofatumumab opiera się właśnie na modulacji liczby i działania limfocytów B. EBV był pierwszym
wirusem dla którego opisano sekwencje miRNA. MikroRNA (miRNA) są małymi, niekodującymi
RNA, regulującymi ekspresję genów na etapie posttranskrypcyjnym, a w związku z tym syntezę
białek. Białka te mogą potencjalnie brać udział w reakcji autoimmunologicznej odpowiadającej za
uszkodzenie mieliny, występujące w stwardnieniu rozsianym. Uważa się, że u ssaków miRNA są
odpowiedzialne za regulację ekspresji co najmniej 30% klasycznych genów. Dotychczas zebrane
dane sugerują, że miRNA odgrywają istotną rolę w regulacji rozwoju komórek systemu
odpornościowego. MiRNA są kodowane nie tylko w ludzkim i ssaczym genomie, ich źródłem może
być także wirusowy materiał genetyczny. Co ciekawe, najwięcej dowodów wskazujących na
istnienie miRNA pochodzenia wirusowego uzyskano w przebiegu infekcji EBV. Obecnie opisano
aż 44 różne miRNA kodowane przez DNA wirusa Epstein-Barr. W badaniach naukowych
opisywano, że wirusowe miRNA wpływa na układ odpornościowy człowieka, co potencjalnie może
predysponować do rozwoju SM. Celem mojego projektu naukowego jest analiza związku pomiędzy
EBV a SM poprzez określenie ekspresji wirusowego mikroRNA u osób chorych na SM w
porównaniu do osób zdrowych.
W pierwszym etapie projektu pobierzemy krew od grupy 75 osób chorujących na wszystkie
postacie stwardnienia rozsianego oraz z grupy kontrolnej składającej z 20 osób zdrowych lub
chorujących na inne choroby neurologiczne. Tylko pacjenci nie leczeni lekami
immunomodulującymi w ciągu 6 miesięcy przed pobraniem próbek będą włączeniu do
badania. W kolejnym etapie z krwi wyizolujemy komórki monojądrzaste, a za pomocą separacji
magnetycznej odseparujemy limfocyty B będące miejscem bytowania EBV. Następnym krokiem
będzie wyizolowanie z limfocytów B całkowitego RNA, jego jakość i ilość będzie za każdym
razem kontrolowana systemem fluorescencyjnym. Następnie mRNA zostanie przepisane na
komplementarne DNA (cDNA) z pomocą enzymu odwrotnej transkryptazy. Komplementane DNA
jest niezbędne do przeprowadzenia ilościowej łańcuchowej reakcji polimerazy (qPCR). Czynności
te zostaną przeprowadzone przy użyciu spacjalnych kitów, zawierających m.in specyficzne sondy
dla EBV miRNA. Wyniki reakcji zostaną poddane obróbce za pomocą oprogramowania Data
Assist, co pozwoli określić względny poziom ekspresji wirusowego miRNA u chorych na SM i w
grupie kontrolnej. Rezultaty zostaną poddane analizie biostatystycznej.
Mamy nadzieje, że uzyskane wyniki pozwolą lepiej zrozumieć patogenezę stwardnienia rozsianego,
możliwe jest, że uzyskamy markery, które mogą mieć ważny wpływ na określenie
prawdopodobieństwa wystąpienia choroby, jak i późniejszego rokowania w jej przebiegu.