Strukturalne aspekty miRNA swoistych dla guzów mózgu Agnieszka Belter Kierując się chęcią zrozumienia molekularnych podstaw nowotworów glejowych mózgu, w oparciu o analizę mikromacierzową, określiłam profil miRNA w tkankach GBM. Jest on istotnie zmieniony w porównaniu z profilem miRNA w komórkach zdrowych pochodzenia mózgowego. Wytypowałam miRNA, miR-21, miR10b, miR15b, miR-93 oraz miR-296, których poziom jest znacząco wyższy w tkankach guza w porównaniu ze zdrową kontrolą. Próbując zrozumieć wielofunkcyjność, a zarazem specyficzność ich działania, z wykorzystaniem metod biochemicznych oraz spektroskopii NMR, UV oraz CD określiłam ich strukturę. Po raz pierwszy pokazałam, że miR-21, miR-93, miR-296, miR-10b oraz miR-15b przyjmują strukturę drugorzędową, miR-21, miR-93 oraz miR-296 zarówno strukturę spinki do włosów jak i dupleks, miR10b i miR-15b w badanych warunkach jedyne homodupleksy. Spinki do włosów oraz dupleksy miR-21, miR-93 oraz miR-296 współistnieją w warunkach wykonanych eksperymentów, a równowaga między tymi formami zależy od stężenia RNA, temperatury oraz siły jonowej badanego roztworu RNA. Biorąc pod uwagę fakt, że stężenie pojedynczego miRNA w komórce z reguły jest niższe niż 200 pM postuluję, że spinka do włosów miRNA jest dominującą w komórce. Do niedawna uważano, że miRNA funkcjonują jedynie w kompleksie RISC. Pokazałam, że miRNA mogą występować w komórce w postaci spinki do włosów i/lub dupleksu, co może przekładać się na ich właściwości, dostępność i funkcje. Istnieje zależność między trwałością miRNA przyjmujących strukturę spinki do włosów, a energią tych spinek. Struktura miRNA chroni je przed działaniem nukleaz komórkowych, w efekcie odgrywa istotną rolę w regulacji poziomu miRNA w komórce. Ponad to, struktura miRNA wpływa na termodynamikę oddziaływań mRNAmiRNA, w efekcie na zależną od miRNA regulację ekspresji genów. Motyw spinki do włosów znany jest jako miejsce kontaktu RNA z innymi kwasami nukleinowymi i białkami. Zaobserwowałam podobieństwo sekwencji miRNA i innych krótkich RNA których funkcja determinowana jest przez ich strukturę, m.in. tRNA, minihelis tRNA, aptamerów RNA. Na tej podstawie zasugerowałam, że spinki do włosów miRNA, podobnie jak wspomnaine RNA, mogą bezpośrednio, niezależnie od kompleksu RISC, oddziaływać z białkami. Potwierdziłam to eksperymentalnie. Sugeruje to nowy mechanizm działania miRNA i jest krokiem do zrozumienia zależnych od miRNA mechanizmów regulacji komórkowej oraz patogenezy chorób, w tym nowotworów glejowych mózgu, u podłoża których leżą te krótkie niekodujące RNA. Dodatkowo, w odpowiedzi na brak skutecznych metod leczenia nowotworów glejowych mózgu, ich oporności na konwencjonalne metody leczenia, zaprojektowałam katalityczne kwasy nukleinowe, rybozymy typu hammerhead oraz DNAzymy, skierowane zarówno na pre-miRNA jak i ich formy dojrzałe. Precyzyjnie, z dokładnością do 1 nt, i wydajnie rozpoznają one oraz hydrolizują swoje cele. Ich skuteczność potwierdziłam w warunkach komórkowych. Otrzymane wyniki wskazują, że dojrzałe miRNA są łatwiejszym celem działania dla katalitycznych kwasów nukleinowych niż pri- i pre-miRNA. Uzyskany poziom wyciszenia miRNA jest sumarycznym efektem działania katalitycznych kwasów nukleinowych na poziomie miRNA i ich prekursorów. Obrazuje to przewagę narzędzi anty-miRNA działających zarówno na poziomie dojrzałych miRNA i ich prekursorów nad tymi, które hydrolizują jedynie pre- i/lub pre-miRNA. Efektywność i precyzja działania katalitycznych kwasów nukleinowych oraz łatwość ich dostarczenia do komórek z użyciem kationów lipidowych świadczą dużym potencjale aplikacyjnym tych narzędzi w terapii chorób związanych z zaburzeniami poziomu miRNA.