DRUK _01_ Kowal str. 275-290
advertisement
Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 3, str. 275–290 PRACA POGLĄDOWA – Review Article MAŁGORZATA KOWAL Znaczenie mikroRNA w onkogenezie Significance of microRNAs in tumorigenesis Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku AM w Lublinie Kierownik: Prof. dr hab. med. Anna Dmoszyńska STRESZCZENIE MikroRNA (miRNA) są grupą ~22 nukleotydowych, niekodujących cząsteczek RNA, które regulują ekspresję genów strukturalnych na poziomie posttranskrypcyjnym. Wyniki badań wskazują, Ŝe miRNA odgrywają istotną rolę w wielu podstawowych procesach fizjologicznych komórki, obejmujących proliferację, dojrzewanie i śmierć. Nieprawidłowości w funkcjonowaniu miRNA zaburzają komórkową hemostazę, co moŜe przyczynić się do nowotworzenia, w której mogą one pełnić rolę genów supresji nowotworowej lub onkogenów. Praca przedstawia aktualny stan wiedzy na temat dojrzewania miRNA, mechanizmów regulacji ekspresji genów za ich pośrednictwem oraz roli tych cząsteczek w onkogenezie. SŁOWA KLUCZOWE: miRNA – Regulacja ekspresji genów – Onkogeneza SUMMARY MicroRNAs (miRNAs) constitute a group of ~22 nucleotides, noncoding RNA molecules that regulate the expression of structural genes on post-transcriptional level. Results of studies indicate that miRNAs regulate basic cellular functions including proliferation, differentiation, and death. Abnormalities in miRNA function impinge upon the normal cellular hemostasis, and influence tumorigenesis by acting as oncogenes and tumor suppressors. This review presents the current understanding of miRNA biogenesis, regulatory mechanisms and the role of them in oncogenesis. KEY WORDS: miRNA – Regulation of gene expression – Oncogenesis WSTĘP W roku 1998 Amerykanie Fire i Mello donieśli o odkryciu u nicienia Caenorhabditis elegans, mechanizmu umoŜliwiającego niszczenie mRNA niosącego informacje z określonego genu (1). Ten mechanizm, który otrzymał nazwę interferencji RNA (RNAi), zostaje uruchomiony, gdy w komórce pojawiają się dwuniciowe fragmenty RNA (dsRNA) o identycznej sekwencji jak mRNA genu docelowego. Degradacja cząsteczek mRNA jest równoznaczna z posttranskrypcyjnym wyciszeniem ekspresji genu, a tym samym z zahamowaniem syntezy białka kodowanego przez ten gen. Interferencja RNA jest jednym z mechanizmów chroniących komórki przed obcymi kwasami nukleinowymi np. zakaŜeniem wirusami a takŜe przed działaniem tzw. 276 M. KOWAL ruchomych genów, czyli transpozonów (2). W ostatnich latach udowodniono, Ŝe zjawisko interferencji RNA ma podstawowe znaczenie dla regulacji przepływu informacji zawartej w genach, wpływając na endogenny rozwój komórek organizmów roślin, zwierząt i człowieka (3). Ponadto RNAi moŜe kontrolować modyfikację komórkowego DNA i związanej z nim chromatyny (2). W niektórych organizmach obserwuje się przenoszenie sygnałów RNAi zarówno pomiędzy komórkami (transfer poziomy, horyzontalny), a w pewnych przypadkach przez linię rozrodczą z jednego pokolenia na następne (transfer pionowy, wertykalny). Zjawisko RNAi jest uruchamiane przez róŜnej długości fragmenty dsRNA W przyrodzie dsRNA mogą powstawać w wyniku polimeryzacji RNA na matrycowym RNA np. wirusa lub na skutek hybrydyzacji nakładających się transkryptów np. powtarzające się sekwencje transpozonów. Po połączeniu z białkiem Dicer, dsRNA jest przez nie enzymatycznie cięte na 21–28 nukleotydowe (nt) odcinki z wystającymi (overlapping) 2-nt końcami 3’ (4). Są one określane jako dupleksy małych lub krótkich, interferujących RNA (small/short interfering RNAs duplexes, siRNAs) (3,4). Jedna z nici dupleksu siRNA przyłącza się do kompleksu RISC (RNA induced silencing complex). Następnie kompleks RISC/siRNA wiąŜe się z fragmentem 3’-UTR (3’ untranslated region) mRNA genu docelowego. To połączenie w zaleŜności od stopnia komplementarności powoduje albo degradację mRNA albo jedynie zahamowanie translacji przy zachowaniu integralności transkryptu (5). MikroRNA W zaleŜności od pochodzenia lub pełnionej funkcji, obecnie opisywane są trzy rodzaje naturalnie występujących małych fragmentów RNA (3). Poza wspomnianymi egzo- i endogennymi siRNAs są to: rasiRNAs (repeat-associated short interfering RNAs oraz zakodowane w genomie mikroRNA (miRNA, miR) (3,6). Endogenne transkrypty zawierające komplementarne lub w przybliŜeniu komplementarne 20 do 50 par zasad przyjmując dwuniciową strukturę „szpilki do włosów”, herpin (ang. hairpin), mogą tworzyć formy dsRNA, z których powstają miRNA. Małe, niekodujące cząsteczki miRNA uruchamiają mechanizm RNAi. U roślin działanie miRNA polega głównie na niszczeniu homologów mRNA. Regulacja ekspresji genów u zwierząt za pośrednictwem miRNA obejmuje przede wszystkim hamowanie translacji (3). Wyciszenie genu w odpowiedzi na dsRNA moŜe być teŜ następstwem modyfikacji komórkowego DNA i histonów (2, 7). Uruchomienie tego ostatniego typu odpowiedzi pojawia się w obecności rasiRNA. Są one generowane przez hybrydyzację transkryptów z powtarzających się sekwencji transgenów lub transpozonów. Ten rodzaj RNAi moŜe reprezentować komórkowy mechanizm obrony przeciw potencjalnie szkodliwym obcym genetycznie elementom np. transpozonom (8). Po raz pierwszy miRNA opisali w roku 1993 Lee i wsp.(9) oraz Wightman i wsp. (10) badając stadia rozwojowe Caenorhabditis elegans. Od tego czasu zidentyfikowa- Znaczenie mikroRNA w onkogenezie 277 no więcej niŜ 3000 miRNA u zwierząt, roślin i wirusów (11). W ludzkim genomie dotychczas odkryto 300 miRNA ale ich liczbę oceniania się na więcej niŜ 1000 (12, 13). UwaŜa się, Ŝe miRNA regulują 30% genów ludzkiego genomu, biorących udział w prawidłowym rozwoju komórki (14). Podkreśla się, Ŝe nieprawidłowości dotyczące miRNA mogą być odpowiedzialne za patogenezę wielu chorób występujących u człowieka, w tym równieŜ nowotworów (11). Geny kodujące miRNA mogą lokalizować się w intronach genów lub w obszarach pozagenowych (15). Najprawdopodobniej występujące w intronie geny miRNA wykorzystują do transkrypcji promotor i elementy regulatorowe gospodarza (16). Regulacja miRNA w policystronowych skupiskach prawdopodobnie odbywa się wspólnie, analogicznie do bakteryjnych operonów (15). Biogeneza miRNA W procesie dojrzewania miRNA wyróŜnia się dwa etapy, z których kaŜdy jest katalizowany przez enzymy z duŜej rodziny rybonukleazy III (RNazy). Ryc. 1. Są to Drosha i Dicer (17, 18). Te specyficzne wobec dsRNA endonukleazy powodują powstawanie struktur z dwunukleotydowym „wysunięciem” na końcu 3’. Drosha W pierwszym jądrowym etapie dojrzewania, z liczącego kilkaset nukleotydów (nt) transkryptu pierwotnego, tzw. pri-miRNA (primary miRNA), który moŜe zawierać więcej niŜ jedno miRNA, powstaje ok. 70 nt pre-miRNA (prekursor), o strukturze herpin (6,15). Przebieg tego etapu katalizuje jądrowy enzym Drosha, o wielkości 130–160 kDa (17). Drosha zawiera dwie tandemowe domeny o aktywności RNazy III, domenę wiąŜącą dsRNA Binding Domain (dsRBD) oraz końcowy segment z wolną grupą aminową o nieznanej funkcji (19). Drosha tworzy z decydującym o specyficzności białkiem dsRBD DGCR8 (DiGeorge syndrome Critical Region Gene 8) kompleks mikroprocesora (20). Kompleks rozpoznaje i wycina z jądrowych pri-miRNA, fragmenty pre-miRNA, które następnie są transportowane do cytoplazmy przy udziale jądrowego czynnika eksportu tzw. eksportyny-5 (Exp5) (ang. exportin-5), zaleŜnego od wiąŜącego GTP kofaktora Ran (21). Dicer W drugim etapie dojrzewania w cytoplazmie przy udziale kolejnej RNazy III, enzymu Dicer, z fragmentu pre-miRNA powstają ok. 21–25 nt dojrzałe cząsteczki miRNA (15). Białka Dicer są duŜe, ok. 200 kDa i zawierają domeny o aktywności ATPazy/helikazy RNA, domeny PAZ (Piwi-Argonaute-Zwille) i DUF283, dwie tandemowe domeny o aktywności RN-azy III i C-końcową domenę dsRBD (22). Dicer jest enzymem zaleŜnym od ATP, który wykazuje powinowactwo do fragmentów dsRNA, 278 M. KOWAL posiadających 2nt wysunięcia na końcu 3’. Te fragmenty są rozpoznawane przez domenę PAZ. Dicer przecina oba łańcuchy pre-miRNA w odległości ok. 21 nt od miejsca wiązania. Struktura pre-miRNA decyduje o miejscu działania enzymu i sekwencji powstającego dupleksu miRNA (23). Gen miRNA Jądro Eksportyne 5 Cytoplazma Dupleks miRNAmiRNA* Dupleks siRNA miRNA Rybosom Docelowe mRNA Zahamowanie translacji Degradacja mRNA Ryc. 1. Schemat biogenezy miRNA i posttranskrypcyjnej supresji (wg 23) Fig. 1. The model of biogenesis and post-transcriptional suppression of miRNA (acc 23) Znaczenie mikroRNA w onkogenezie 279 Kompleks RISC Utworzony dupleks zostaje wcielony w duŜy, białkowy kompleks RISC lub microribonucleoprotein, miRNP (11). Tylko jeden z łańcuchów dupleksu jest trwale połączony z RISC i ten staje się dojrzałą cząsteczką miRNA. O wyborze określonego łańcucha decyduje stabilność par zasad 2–4 nt na zakończeniach 5’ dupleksu (24). Łańcuch charakteryzujący się niŜszą stabilnością jest preferencyjnie łączony z RISC, stając się aktywną cząsteczką miRNA. Za rozpoznanie i wyciszenie aktywności genu jest głównie odpowiedzialny łańcuch antysensowy (8). Drugi z łańcuchów zwany „pasaŜerem” lub miRNA* jest usuwany w 2 alternatywnych mechanizmach. Kompleks RISC zawierający białko Ago2 jest zdolne pociąć łańcuch „pasaŜera”. Kompleks RISC z innymi białkami niŜ Ago2, przez mechanizm „bypassów” moŜe usunąć łańcuch „pasaŜera”, który prawdopodobnie bierze udział w rozwoju dupleksu (25). Budowa kompleksu RISC Podstawą kompleksu RISC są białka rodziny Argonaute, z podrodziną Ago i Piwi (26). Te ostatnie o nieznanej funkcji stwierdzono dotychczas w jądrach komórek układu krwiotwórczego i w komórkach macierzystych. U człowieka wyróŜnia się 8 białek Ago, z których powszechnie w wielu rodzajach komórek występują cztery z nich (Ago1-4) (27). Białka Ago o wielkości ~ 100 kDa mają 2 domeny: PAZ i Piwi. Podobnie jak w białkach Dicer domena PAZ (Piwi- Argonaute-Zwille) odpowiada za specyficzne wiązanie dupleksów RNA z wystającymi 2 nt końcami 3’. Domena Piwi, wspólna dla podrodzin Ago/Piwi prawdopodobnie decyduje o endonukleolitycznej aktywności kompleksu RISC (27). W większości organizmów poza białkami Argonaut w skład kompleksu RISC wchodzą równieŜ inne komponenty białkowe. U Drosophila większymi cząsteczkami są: VIG (Vasa intronic gene product), Tudor-SN (staphylococcal-nuclease-domaincontaining protein) oraz dFXR (fragile-X-related), będące ortologiem ludzkiego białka FMRP (fragile X mental retardation protein). FMRP i dFXR są białkami wiąŜącymi RNA, które działają jako modulatory translacji tj. mogą powodować represję translacji indukowaną przez miRNA (3, 28). Precyzyjne działanie tych róŜnych białek w procesie „wyciszenia RNA” nie jest do końca wyjaśnione. Jest prawdopodobne, Ŝe u róŜnych gatunków kompleksy RISC są zbudowane podobnie. U ssaków obok kompleksów RISC wykrywa się alternatywne helikazy Gemin3 i Gemin4, współistniejące z miRNA i ludzkim homologiem białka Ago, eIF2C2 (23). Mechanizm działania miRNA W końcowym etapie RNAi dochodzi do nukleolitycznej destrukcji docelowego mRNA, w którym główną rolę odgrywają białka kompleksu RISC. W kompleksie RISC dzięki pojedynczemu łańcuchowi miRNA zostaje odnaleziona komplementarna lub bliska komplementarności sekwencja docelowego mRNA (29). W zaleŜności od 280 M. KOWAL stopnia komplementarności z obszarem 3’-UTR mRNA, wyróŜnia się 2 mechanizmy działania miRNA (30). Wysoce komplementarne sekwencje determinują aktywność niezidentyfikowanego białka tzw. Slicera, który jest odpowiedzialny za przecięcie mRNA, co najczęściej stwierdza się w komórkach roślinnych (31). Dotychczasowe badania wskazują, Ŝe Ago2 moŜe być poszukiwanym Slicerem. Natomiast jeśli połączenie zasad nie jest doskonałe, efektem działania miRNA jest zahamowanie translacji danego transkryptu mRNA bez jego niszczenia, co jest prawie regułą w komórkach zwierzęcych. Za ten proces odpowiedzialne są prawdopodobnie wszystkie białka rodziny Ago. Odstępstwami od tej zasady są miR-196 i miR-172, które po zahamowaniu translacji, niszczą odpowiednio mRNA genu HOX8B i APETALA2(AP2) (31, 32). RóŜnica w działaniu kompleksów RISC (degradacja lub zahamowanie translacji mRNA) najprawdopodobniej związana jest ze zróŜnicowaną budową białek Ago. Czynnościowe kompleksy RISC/siRNA mogą mieć róŜną budowę i wielkość. Struktury złoŜone tylko z białek Ago i siRNA mają wielkość 100–160 kDa. Zdarza się, Ŝe kompleksy RISC łączą się z rybosomami i tworzą 300–500 kDa tzw. „holo-RISC” (33). Te ostatnie są aktywne zarówno w formie związanej z rybosomami a takŜe po odłączeniu wolnego RISC. Początkowo wydawało się, Ŝe tworzenie dojrzałych cząsteczek miRNA jest uzaleŜnione od integralności nukleotydowej prekursorów miRNA, w mniejszym stopniu zaleŜy od specyficznej sekwencji w obrębie fragmentu herpin, charakteryzującej premiRNA (34). Iwan i Naraba (35), sekwencjonując 173 pre-miRNA u 96 osób w 10 przypadkach stwierdzili polimorfizm dotyczący regionu herpin. W większości przypadków nie miało to wpływu na proces tworzenia miRNA. Natomiast w miR-30c-2 obserwowano polimorfizm C na A sekwencji dojrzałego miRNA. Taki polimorfizm zmieniał powinowactwo do genu docelowego, przyczyniając się do powaŜnych, biologicznych następstw. Rola miRNA Jest wiele dowodów na to, Ŝe miRNA odgrywają duŜą rolę w regulacji ekspresji genów. Geny miRNA stanowią od 1 do 5% genów występujących u robaków, myszy i ludzi, co odpowiada ok. 1000 genów w ludzkim genomie (13). Komórki zwierzęce wykazują wysoki poziom miRNA, oceniany na 800 do 50 000 molekuł na komórce C.elegans (36). Poziom miRNA jest dynamicznie regulowany w odpowiedzi na fizjologiczne oraz rozwojowe sygnały. Prawdopodobnie kaŜdy rodzaj komórek ma specyficzne środowisko miRNA, kontrolujące ekspresję genów (37). Według ostatnich obliczeń przypuszcza się, Ŝe pojedynczy miRNA moŜe być odpowiedzialny za regulację ok. 200 genów (38). Wynika z tego, Ŝe u ludzi ponad 1/3 genów kodujących białka podlega regulacji miRNA. UwaŜa się, Ŝe miRNA działając na poziomie posttranskrypcyjnym są fundamentalną składową genetycznych programów. Często są nazywane kluczem uczestnictwa w regulatorowej sieci genów. Znaczenie mikroRNA w onkogenezie 281 MiRNA a nowotworzenie Potencjalny związek między miRNA i nowotworami był brany pod uwagę z chwilą stwierdzenia, Ŝe miRNA odgrywają waŜną rolę we wzroście i róŜnicowaniu komórki. Badając stadia rozwojowe u C.elegans stwierdzono, Ŝe do prawidłowego rozwoju larwy nicienia jest potrzebne zahamowanie ekspresji genu strukturalnego lin-14, do czego niezbędna jest obecność po raz pierwszy opisanego miRNA lin-4 (9,10). Kolejnym genem miRNA, zaangaŜowanym w regulację rozwoju nicienia był let-7, którego homologi zostały następnie wykryte w genomach nie tylko robaków, ale takŜe ssaków (39). Te obserwacje były dowodem na to, Ŝe miRNA są konserwatywnymi filogenetycznie regulatorami ekspresji genów. Ponadto wyniki tych badań sugerowały moŜliwość udziału miRNA w rozwoju nowotworów. Utrata funkcji przez miRNA lin-4 powodowała nieprawidłowe róŜnicowanie niektórych linii komórkowych oraz pojawienie się zarodkowych komórek w późniejszych stadiach rozwojowych (9). Te nieprawidłowości przypominają zmiany obserwowane w tkankach nowotworowych, które powstają na skutek wadliwego programu róŜnicowania. Przykładem mogą być choroby nowotworowe krwi, gdzie konsekwencją zahamowanego dojrzewania jest patologiczne gromadzenie niedojrzałych komórek. Do często występujących w nowotworach zjawisk naleŜą zaburzenia w zaprogramowanej śmierci komórki, apoptozie. Wynikiem nadmiernej ekspresji miRNA Bantam jest negatywna regulacja proapoptycznego genu hid, co prowadzi do komórkowej proliferacji, przejawiającej się nadmiernym wzrostem tkanek w obrębie skrzydeł i oka u Drosophili (40). Najbardziej przekonywującym dowodem udziału genów w onkogenezie jest stwierdzenie u chorego z nowotworem nabytych mutacji. Zmiany genetyczne mogą ujawnić się jako punktowe mutacje lub duŜe zmiany chromosomowe, obejmujące amplifikacje oraz delecje. Pierwsze badania kliniczne uwzględniające ewentualny udział miRNA w patogenezie dotyczyły przewlekłej białaczki limfocytowej B-komórkowej (PBL-B). Do najczęstszych nieprawidłowości chromosomowych naleŜy delecja 13q14, która występuje w ponad połowie przypadków. Delecja 13q14 jest takŜe obserwowana w ok. 50% przypadków chłoniaka z komórek płaszcza (mantle cell lymphoma), w 1640% szpiczaka plazmocytowego i w 60% raka gruczołu krokowego. MoŜe to sugerować istnienie jednego lub więcej genów supresorowych, biorących udział w powstawaniu tych nowotworów. Calin i wsp (41) wykazali, Ŝe taką aktywność mają 2 cząsteczki miRNA: miR-15a i miR-16-1, które umiejscowione są na długim ramieniu chromosomu 13 (13q14,3), pomiędzy 2 i 5 egzonem genu LEU2, czyli dokładnie w obszarze ulegającym delecji w PBL-B. MiR-15a i miR-16-1 wykazują zmniejszoną ekspresję odpowiednio w około 25% i 45% przypadkach PBL-B (42). Jednak stwierdzenie, Ŝe te 2 miRNA reprezentują cel delecji, nie do końca jest prawdziwe. Bowiem w przypadkach wykazujących niską ekspresję miR-15a i miR-16-1 bez współistniejącej delecji, analiza genomu nie wykazała nieprawidłowości w badanych sekwencjach prekursorowych (43). Zmniejszona ekspresja moŜe być wynikiem zredukowanej ekspresji obydwu transkryptów pri-miRNA. Na uwagę zasługuje fakt, Ŝe na chromosomie 3q25-26 stwierdza się bardzo podobne skupienie genów miRNA, obejmujące miR-15b 282 M. KOWAL i miR-16-2 (44). Ten ostatni ma identyczną jak miR-16-1 sekwencję oligonukleotydów, podczas gdy miR-15b róŜni się czterema nt od miR-15a. Obydwa miR-15b i miR-16-2 wykazują podobne do miR-15a i miR-16-1 działanie oraz bardzo niską ekspresję w PBL-B (42). Lokalizacja genów miRNA W ludzkim genomie miejscem lokalizacji dla ponad połowy genów ze 186 badanych miRNA (52,5%) są najczęściej miejsca łamliwe (fragile sites) lub obszary często ulegające amplifikacji, delecji lub rearanŜacji w przebiegu transformacji nowotworowej, tzw. obszary genomu związane z nowotworem (cancer-associated genomic regions, CAGR) (42, 45). Takim przykładem moŜe być umiejscowienie miR-142s w miejscu połączenia złamania w translokacji t(8,17), której następstwem jest utrata kontroli nad przeniesionym genem c-Myc, co powoduje powstanie agresywnej postaci białaczki B-komórkowej. Tabela 1. Przykłady lokalizacji miRNA w miejscach złamań, delecji, amplifikacji, które występują w ludzkich nowotworach (wg 41) Table 1. The examples of miRNAs located in breakpoint, deleted, amplified regions involved in human cancers (acc 41) Chromosom 3p21.3 – D 3p23-21.31 - D 5q32 - D 9q33 - D 13q14.3 - D 7q32 – F 15q21- F 9q22.1- F miRNA nowotwór miRNA-26a Rak nabłonkowy miR-26a; miR-138-1 Rak nosogardzieli miR-145/miR-143 MDS miR-123 Rak płuc miR-15a/miR-16a PBL-B miR- 183 miR- 190 miR – 24-1 miR-17/miR-18/miR-19a/ miR13q32-33 - A 20/miR-19b-1/ Chłoniak grudkowy miR-92-1 17q22-t(8;17) miR-142s; miR-142as Białaczka prolimfocytowa 20q13 - A miR-297-3 Rak okręŜnicy 17q23 - A miR-21 neuroblastoma miR – miRNA, D – delecja, A – amplifikacja, F – miejsce złamań (fragile site), MDS – (mielodysplastic syndrome) zespół mielodysplastyczny, PBL-B – przewlekła białaczka limfocytowa B-komórkowa Stwierdzono, Ŝe w komórkach nowotworowych miRNA z lokalizacją w regionach delecji wykazuje niski poziom ekspresji (45). Wykazano stale zredukowany poziom miR-143 i -145 w gruczolakowatości i róŜnych stadiach zaawansowania raka jelita grubego. Chcąc określić wpływ lokalizacji w obszarze delecji na ekspresję miRNA, Calin i wsp (45) badali próbki przewlekłej białaczki limfocytowej B-komórkowej (PBL-B) ze znaną delecją 13q14 oraz linię komórkową raka płuc. W większości przypadków PBL-B ekspresja miR-16a była niska lub jej nie stwierdzano. Natomiast ekspresja miR-26a (3p21) i miR-99a (21q11.2), których lokalizacje nie wykazują związku Znaczenie mikroRNA w onkogenezie 283 z PBL-B, we wszystkich próbkach była względnie porównywalna. W przeciwieństwie do braku lub niskiej ich ekspresji wykrywanej w liniach komórkowych raka płuc, co korelowało z lokalizacją miRNA w obszarach z homozygotyczną delecją lub utratą hetezygotyczności (LOH, loss of heterozygosity) obserwowaną w raku płuc. Ekspresja miR-16a była podobna w większości komórek raka płuc. Lu i wsp. (46) przedstawili zróŜnicowane wyniki badań ekspresji 217 miRNA w zaleŜności od tego czy pochodziły z tkanek zdrowych, czy teŜ nowotworowych. Calin i Croce (42) stwierdzili znamienne statystycznie róŜnice w ekspresji miRNA w komórkach PBL-B vs limfocyty B, CD5+ uwaŜane za ich prawidłowe odpowiedniki. Niektóre z miRNA mogą mieć określone znaczenie w patogenezie PBL-B. miR-190 Tabela 2. miRNA mające znaczenie w biologii PBL-B (wg 49, 54) Table 2. The miRNAs with impact on CLL biology (acc 49, 54) Lokalizacja Znaczenie 13q14.3 RóŜnicowanie komórek PBL-B z prawidłowymi limfocytami B, CD5+, współistnienie z czynnikami rokowniczymi i progresją choroby, indukcja apoptozy za pośrednictwem BCL2, mutacje linii zarodkowej 1q31.1 RóŜnicowanie komórek PBL-B z prawidłowymi limfocytami B, CD5+ Xp11.3 Współistnienie z czynnikami rokowniczymi i progresją choroby 9q22.32 Współistnienie z mutacjami linii zarodkowej 1q32.2 ObniŜona ekspresja współistnieje z mutacjami somatycznymi Współistnienie z czynnikami rokowniczymi, obniŜona ekspresja koreluje 1q32.2 z progresją choroby za pośrednictwem Tcl1 6p12.2 ObniŜona ekspresja współistnieje z mutacjami somatycznymi 1q31.3 Współistnienie z czynnikami rokowniczymi, obniŜona ekspresja koreluje z progresją choroby za pośrednictwem Tcl1 15q21 RóŜnicowanie komórek PBL-B z prawidłowymi limfocytami B, CD5+ miR-155 21q21 miRNA miR-16-1 miR-15a miR-213 miR-221 miR-27b miR-29b-2 miR-29b miR-206 miR-181b Współistnienie z czynnikami rokowniczymi, wysoka ekspresja koreluje z progresją choroby Profil miRNA pozwala na ustalenie nie tylko pochodzenia komórek w poszczególnych nowotworach, ale takŜe ich stadium rozwoju i róŜnicowania. Panel 217 miRNA okazał się przydatny w ustaleniu rozpoznania 12 z 17 nowotworów nieznanego pochodzenia, w których zawiodło badanie histologiczne. Dla porównania badanie z uŜyciem panelu mRNA okazało się prawidłowe w 1 na 17 przypadków. Zastosowanie techniki miRNA jest pomocne w diagnostyce róŜnicowej ostrej białaczki limfoblastycznej. Stwierdzenie anomalii molekularnych np. transkryptu BCR/ABL, rearanŜacji genów w białaczce mieszano-liniowej (mixed lineage) i T komórkowej, pozwala na ustalenie precyzyjnego rozpoznania. NiezaleŜnie od rodzaju komórek nowotworowych, więcej niŜ połowa z badanych miRNA miała znamiennie niŜszy poziom ekspresji w porównaniu z tkankami prawidłowymi (46). MoŜe to świadczyć o roli miRNA w końcowym róŜnicowaniu i o względnie niecałkowitym etapie zróŜnicowania komórek nowotworowych. To przypuszczenie potwierdza fakt zwiększenia ekspresji wielu miRNA 284 M. KOWAL w komórkach ostrej białaczki promielocytowej, róŜnicujących się pod wpływem kwasu all-trans retinoinowego (11). MiRNA jako onkogeny lub geny supresji nowotworowej Według Calin i wsp (45) cząsteczki miRNA mogą uczestniczyć w onkogenezie jako klasyczne onkogeny (OG) lub klasyczne geny supresji nowotworu (tumor supressor gene, TSG). proliferacja apoptoza nacieczenie angiogeneza Ryc. 2. Schemat działania miRNA: jako onkogeny i/lub geny supresji nowotworowej (objaśnienia w tekście) (wg 47) Fig. 2. The pattern of miRNA activity: as oncogenes and/or tumor suppressors (the explanations in text) (acc 47) Niektóre miRNA stają się uczestnikami „zapaści posttranskrypcyjnej”, w której ich zaburzona ekspresja powoduje posttranskrypcyjne nieprawidłowości OG lub TSG. Zdarza się, Ŝe ten sam gen miRNA moŜe być OG lub TSG w zaleŜności od rodzaju komórki i genu docelowego, którego zwiększona lub obniŜona ekspresja jest końcowym efektem nieprawidłowej ekspresji miRNA (45, 47). KaŜda cząsteczka miRNA oddziaływuje na więcej niŜ jeden gen docelowy i kaŜdy z nich współdziała z więcej niŜ jednym miRNA w róŜnego rodzaju komórkach. Wg grupy Croce (41, 42, 43, 47) cały ten kompleks genów tworzy specyficzną sieć regulatorową. Aktywność antyapoptotyczna i sprzyjająca proliferacji oraz nierzadko umiejscowienie w obszarach ulegających amplifikacji lub nadekspresja w nowotworach upodabnia miRNA do onkogenów. W rzeczywistości ten miRNA w określonych komór- Znaczenie mikroRNA w onkogenezie 285 kach moŜe mieć aktywność supresyjną, jeśli głównym celem są geny supresorowe. DuŜa ilość miRNA obniŜa regulację genu supresorowego (47). Taki sam efekt powoduje utrata heterozygotyczności dotycząca genu docelowego. W niektórych nowotworach obserwowane zmiany w ekspresji miRNA nie zawsze odzwierciedlają bezpośredni udział w onkogenezie. Zmiany te mogą wpływać na regulację genów, mających istotne znaczenie w patogenezie. Zwiększoną ilość miRNA w komórkach nowotworowych jako pierwsi opisali Eis i wsp (48). W chłoniakach rozlanych z duŜych komórek B (diffuse large B cell lymphoma, DLBCL) obserwowali zwiększoną 10-30 krotnie liczbę kopii miR-155 w porównaniu ze zdrowymi limfocytami B. Zlokalizowany w konserwatywnym regionie genu BIC (B-cell integration cluster), gen miR-155 moŜe pośrednio lub bezpośrednio redukować syntezę białka genu supresorowego lub zmniejszać czynność proapoptyczną. Potencjalnymi genami docelowym są mRNA dwóch czynników transkrypcyjnych: PU.1 (wymagany do późnego róŜnicowania limfocytów B) oraz C/EBPbeta (kontrolujący rozwój limfocytów B). Poziom ekspresji miR-155 jest znamiennie najwyŜszy w DLBCL z aktywowanych komórek B, który charakteryzuje się gorszym rokowaniem w porównaniu z chłoniakami o fenotypie GC (germinal center (48). Przykładem podobnej aktywności moŜe być równieŜ policystronowe skupisko (cluster) mir-17-92, zlokalizowane na chromosomie 13 (13q31), w regionie częstych amplifikacji obserwowanych w chłoniakach złośliwych B-komórkowych i w raku płuc (11, 49). Wykazano, Ŝe ekspresja kaŜdego z 6 miRNA skupiska mi-17-92 jest duŜo wyŜsza w komórkach nowotworowych w porównaniu z prawidłowymi. Ponadto aktywacja ekspresji tego skupiska miRNA jest regulowana na poziomie transkrypcyjnym, przez produkt onkogenu c-Myc (50). W wielu modelach komórkowych wykazano, Ŝe indukcja ekspresji c-Myc dodatnio koreluje z indukcją skupiska mir-17, co przyśpiesza rozwój guza. NaleŜy podkreślić, Ŝe do onkogenezy jest wymagana kooperacja pomiędzy poszczególnymi miRNA tego specyficznego skupiska genów. Dwa spośród nich miR-175p i miR-20 są negatywnymi regulatorami czynnika transkrypcyjnego E2F1, który jest bezpośrednio aktywowany lub hamowany przez produkt białka c-Myc (50). W niektórych przypadkach ekspresja E2F1 jest wystarczająca do indukowania apoptozy. Następstwem jednoczesnej aktywacji transkrypcji przez c-Myc i tłumiącej translacji przez skupisko mir-17-92 moŜe być regulacja aktywności czynnika transkrypcyjnego, wynikiem której jest proliferacja. W tym konkretnym przypadku geny mir-17-92 działają albo jako geny supresorowe albo onkogeny. W raku wątroby obserwuje się LOH w locus chromosomu, gdzie umiejscowiony jest mir-17-92, co moŜe sugerować Ŝe miRNA skupiska mają aktywność genów supresorowych (51). Onkogenne właściwości mir-17-92 potwierdzili Hayashita i wsp (52), stwierdzając w raku drobnokomórkowym płuc amplifikację obszaru z lokalizacją mir-17-92 oraz zwiększoną ekspresję poszczególnych miRNA tego skupiska. MiRNA jako TSG z antyproliferacyjną i proapoptyczną aktywnością, często w komórkach nowotworowych są zlokalizowane w obszarach ulegających delecji lub obniŜonej regulacji. W określonych komórkach te miRNA mogą działać jak onkogeny jeśli głównym ich celem są onkogeny. Brak miRNA doprowadza do nadekspresji onkogenu. Ten sam efekt moŜna obserwować w następstwie 286 M. KOWAL amplifikacji lub aktywacji genu docelowego (47). W innych komórkach głównym celem dla tych samych miRNA moŜe być TSG. Delecja zwiększa poziom białek supresorowych, zapobiegając w ten sposób nowotworowej transformacji. Trzy geny RAS będące potencjalnymi onkogenami, podlegają regulacji miRNA let-7 (11). W 143 przypadkach raka płuc obserwowano zmniejszenie ekspresji let-7, czemu towarzyszyło zwiększenie stęŜenia białka onkogenu RAS, który często ulega mutacji w nowotworach płuc. Znamiennie niska ekspresja let-7 korelowała ze skróceniem czasu przeŜycia chorych operowanych z powodu raka płuc (53). Warto podkreślić, Ŝe poziom ekspresji miRNA był bardziej niezaleŜnym czynnikiem rokowniczym w odniesieniu do czasu przeŜycia, aniŜeli wiek chorego, utkanie histologiczne guza i wywiad obciąŜony paleniem tytoniu. Większy wpływ na czas przeŜycia miały jedynie stadia zaawansowania choroby. W badaniach in vitro udowodniono działanie miRNA let-7 jako TSG, który hamuje wzrost linii komórkowych raka płuc. Podobnie miR-15a i miR-16-1, zlokalizowane na chromosomie 13, w obszarze często ulegającym delecji, działają jak TSG dla genu bcl-2, potencjalnego inhibitora śmierci komórek (47). W PBL-B, brak lub niska ekspresja tych dwóch genów miRNA skutkuje zwiększoną ekspresją bcl-2 i patologicznym przeŜyciem komórek. Obydwa miR-15 i miR-16, będące naturalnymi antysensami wobec bcl-2, mogą być uŜyte w leczeniu nowotworów z nadekspresją genu (47). Prawdopodobnie zwiększona ilość białka BCL-2 jest wypadkową działania miRNA oraz stabilizacji mRNA przez nadmierną ekspresję nukleolinu (54). Białko to w prawidłowych limfocytach B jest wykrywane jedynie w jądrze. W komórkach PBL-B stwierdza się je takŜe w cytoplazmie, gdzie poziom jest 26-krotnie wyŜszy. MiRNA a rozwój nowotworu PBL-B jest obecnie najlepiej zbadanym ludzkim nowotworem, w którym udowodniono udział miRNA zarówno w zapoczątkowanie procesu transformacji, jak i w progresji. Unikalny profil ekspresji miRNA wykazuje ścisły związek z czynnikami prognostycznymi i progresją choroby (43). Spośród 190 analizowanych genów, 13 z nich róŜnicuje przypadki PBL-B o róŜnym rokowaniu w zaleŜności od stanu mutacji części zmiennej łańcucha cięŜkiego immunoglobulin (IgVH) oraz niskiej lub wysokiej ekspresji ZAP-70 (odpowiednio < lub > 20%). Zastanawiające jest współistnienie wysokiej ekspresji miR-15a i miR-16-1 z brakiem mutacji IgVH oraz wysoką ekspresją ZAP-70, które charakteryzują przypadki o złym rokowaniu. Ponadto wysoka ekspresja tych dwóch miRNA powinna korelować z niską ekspresją genu bcl-2, co implikuje dobre rokowanie, podobnie jak i izolowana delecja 13q14. Wyniki te pozostają w logicznej sprzeczności i wymagają dalszych badań. Z tej samej puli róŜnicujących 13 miRNA, 9 pozwala na wyodrębnienie przypadków z krótkim okresem od rozpoznania do rozpoczęcia leczenia tj. ok. 40 m-cy vs ze znamiennie długim okresem taj ok. 88 mcy, P<0.01. Z wyjątkiem miR-29 pozostałe miRNA mają zwiększoną ekspresję, co sugeruje, Ŝe obniŜona regulacja docelowego mRNA ma znaczenie w progresji choroby. Znaczenie mikroRNA w onkogenezie 287 Ostatnie badania wykazały odwrotną korelacją między miR-29b i miR-181b a ekspresją białka i mRNA onkogenu Tcl1 (55). Współdziała on z inną onkoproteiną Akt, mającą decydujące znaczenie w przenoszeniu antyapoptotycznych sygnałów w limfocytach B i T (56). W przypadkach PBL o agresywnym przebiegu stwierdzono ścisłą korelację wysokiej ekspresji Tcl1 z niezmutowanym stanem IgVH i dodatnim ZAP-70, a takŜe z delecją 11q (57). PowyŜsze obserwacje sugerują, Ŝe interakcje między miR29 i miR-181 a Tcl1 wydają się odgrywać istotną rolę w patogenezie agresywnych postaci PBL. Będące naturalnymi inhibitorami Tcl1, obydwa miRNA mogą być w przyszłości opcją terapeutyczną dla przypadków PBL z nadekspresją Tcl1. Calin i wsp (43) w 15%, tj. u 11 z 75 badanych z PBL-B, obserwowali mutacje somatyczne oraz linii zarodkowej w 12% miRNA. Obok stwierdzanych nieprawidłowości w sekwencjach miRNA, u 73% chorych (tj. u 8 z 11) obserwowano rodzinne występowanie PBL-B, innych nowotworów układu krwiotwórczego lub guzów litych. Jest prawdopodobne, Ŝe częste mutacje dotyczące miRNA, niekiedy w linii zarodkowej, mogą stwarzać genetyczne predyspozycje do zachorowania na PBL-B oraz współistnienia z innymi nowotworami. Aby w pełni zrozumieć działanie miRNA w nowotworach konieczna jest identyfikacja docelowych genów, które są odpowiedzialne za fenotypowy efekt traconych bądź nabywanych funkcji przez miRNA. PIŚMIENNICTWO 1. Fire A., Xu S., Montgomery MK., Kostas SA., Driver SE., Mello CC. : Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998; 391: 806-11. 2. Mello CC., Conte D. Jr.: Revealing the world of RNA interference. Nature 2004; 431: 338-342. 3. Meister G., Tuschi T.: Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature 2004; 431: 343-349. 4. Meltzer PS.: Small RNAs with big impacts. Nature 2005; 435: 839-843. 5. Bartel DP.: MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 2004; 116: 281– 297. 6. Ketting RF., Plasterk RHA.: What’s new about RNAi? Meeting on siRNAs and miRNAs. EMBO reports 2004; 5: 762-765. 7. Lippman Z., Martienssen R.: The role of RNA interference in heterochromatic silencing. Nature 2004; 431: 364-370. 8. Zamore PD.,Tuschl T.,Sharp PA.,Bartel DP.: RNAi: double-stranded RNA directs the ATPdependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 2000; 101: 25-33. 9. Lee RC., Feinbaum RL., Ambros V.: The C.elegans heterochromatic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 1993; 75: 843-854. 10. Wightman B., Ha I., Ruvkun G.: Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell 1993; 75: 855-862. 11. Hwang HW., Mendell JT.: MicroRNAs in cell proliferation, cell death, and tumorigenesis. Br.J.Cancer 2006; 94: 776-780. 288 M. KOWAL 12. Bentwich I., Avniel A., Karov Y., Aharanov R., Gilad S., Barad O., Barzilai A., Einat P., Einav U., Meiri E., Sharon E.., Spector Y., Bentwich Z.: Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet 2005; 37: 766-770. 13. Berezikov E., Guryev V., van de Belt J., Wienholds E., Plasterk RH., Cuppen E.: Phylogenetic shadowing and computational identifaction of human microRNA genes/ Cell 2005; 120: 21-24. 14. Lewis BP., Burge CB., Bartel DP.: Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell 2005; 120: 15-20. 15. Lee Y., Jeon K., Lee JT., Kim S., Kim VN.: MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellular localization. EMBO J.2002; 21: 4663-4670. 16. Lagos-Quintana M., Rauhut R., Meyer J.,Borkhardt A., Tuschl T. : New microRNAs from mouse and human. RNA 2003; 9: 175-179. 17. Lee Y et al: The nuclear Rnase III Drosha initiates microRNA processing. Nature 2003; 425: 415–419 18. Hutvanger G et al: A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA. Science 2001; 293: 834–838. 19. Tomari Y., Zamore PD.: MicroRNAa and the regulation of cell death. Trends Genet 2004; 20: 617–624. 20. Kim VN.: MicroRNA biogenesis: coordinated crooping and dicing. Nat Rev Mol Cell Biol 2005; 6: 376–385. 21. Bohnsack MT., Czaplinski K., Gorlich D.: Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs. RNA 2004; 10: 185–191. 22. Bernstein E., Caudy AA., Hammond SM., Hannon GJ.: Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 2001; 409: 363–366. 23. Lin H., Hannon GJ.: MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature 2004; 5: 522-531. 24. Schwarz DS., Hutvagner G., Du T., Xu Z., Aronin N., Zamore PD.: Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 2003; 115: 199-208. 25. Gregory RI., Chendrimada TP., Cooch N., Shiekhattar R.: Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing. Cell 2005; 123: 631-640. 26. Carmell MA., Xuan Z., Zhang MQ., Hannon GJ.: The Argonaute family : tentacies that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 2002; 16: 2733–2742. 27. Meister G., Landthaler M., Patkaniowska A., Dorsett Y., Teng G., Tuschl T.: Human Argonaute2 mediates RNA clevage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular Cell 2004; 15: 185-197. 28. Caudy AA., Myers M., Hannon G., Hammond SM.: Fragile X-related protein and VIG associate with the RNA interference machinery. Genes Dev 2002; 16: 2491-2496. 29. Martinez J., Patkaniawska A., Urlaub H., Luhrmann R., Tuschl T.: Single-stranded anisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell 2002; 110: 563-574. 30. Hutvagner G., Zamore PD.: A microRNA in w multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science 2002; 297: 2056-2060. 31. Hammond SM.: Dicing and slicing. The core machiner of the RNA interference pathway. FEBS letters 2005; 579: 5822-5829. 32. Yang M., Li Y., Padgett RW.: Micro RNAs: small regulators with a big impact. Cytokine & Growth Factor Rev 2005; 16: 387-393. 33. Djikeng A., Shi H., Tschudi C., Shen S., Ullu E.: An siRNA ribonucleoprotein is found associated with polyribosomes in Trypanosoma brucei. RNA 2002; 9: 802-808. Znaczenie mikroRNA w onkogenezie 289 34. Zeng Y., Cullen BR.: Sequence rewuirements for microRNA processing and function in human cells. RNA 2003; 9: 112-123. 35. Iwai N., Naraba H.: Polymorphisms in human pre-miRNAs. BBRC 2005; 331: 1439-1444. 36. Lim LP.,Lau NC.,Weinstein EG et al: The microRNAs of Caenorhabditis elegans. Genes Dev 2003; 17: 991-1008 37. Chen CZ.: MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors. N Engl J Med. 2005; 353: 1768– 1771. 38. Shivdasani RA.: MicroRNAs: regulators of gene expression and cell diefferentiation. Blood 2006; 108: 3646–3653. 39. Pasquinelli AE.,Reinhart BJ.,Slack F. et al: Conservation of the sequence and temporal epression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature 2000; 408: 86-89. 40. Brennecke J.,Hipfner DR.,Stark A.,Russell RB.,Cohen SM.: Bantam encode a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptic gene hid in Drosophila. Cell 2003; 113: 25-36. 41. Calin GA., Dumitru CD., Shimizu M. et al :Frequent deletions and down-regulation of microRNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. PNAS 2002; 99: 15524-15529. 42. Calin GA., Croce CM.: Genomics of chronic lymphocytic leukemia microRNAs as new players with clinical significance. Semin Oncol 2006; 33: 167-173. 43. Calin GA., Ferracin M., Shimizu M et al: A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 2005; 353: 1793-1801. 44. Chen CZ., Lodish HF.: MicroRNAs as regulators of mammalian hematopoiesis. Semin Immun 2005; 17: 155-165. 45. Calin GA.,Sevignani C.,Dumitru CD et al: Human microRNAs genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. PNAS 2004; 101: 2999-3004. 46. Lu J., Getz G., Miska EA., et al: Micro RNA expression profiles classify human cancers. Nature 2005; 435: 834-838. 47. Cimmino A., Calin GA., Fabbri M. et al: miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2. PNAS 2005; 102: 13944-1349. 48. Eis PS., Tam W., Sun L et al: Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas. PNAS 2005; 102: 3627-3632. 49. Ota A., Tagawa H., Karnan S. et al.: Identification and characterization of a novel gene, C13orf25, as a target for 13q31-q32 amplification in malignant lymphoma. Cancer Res 2004; 64: 3087– 3095. 50. O’Donnell KA., Wentzel EA., Zeller KI., Dang CV., Mendell JT: c-Myc regulated microRNAs modulate E2F1 expression. Nature 2005; 435: 839-843. 51. Lin YW., Sheu JC., Liu LY et al: Loss of heterozygosity at chromosome 13q in hepatocellular carcinoma, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Eur J Cancer 1999; 35: 1730– 1734. 52. Hayashita Y., Osada H., Tatematsu Y et al: A polycystronic microRNA cluster, miR-17-92, is overexpressed in human lung cancers and enhances cell proliferation. Cancer Res 2005; 65: 9628-9632. 53. Takamizawa J., Konishi H., Yanagisawa K. et al.: Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res 2004; 64: 37533756. 54. Otake Y., Soundararajan S., Sengupta TK. et al: Overexpression of nucleolin in chronic lymphocytic leukemia cells induces stabilization of bcl2 mRNA. Blood 2007; 109: 3069-3075. 55. Pekarsky Y., Santanam U., Cimmino A. et al.: Tcl1 expression in chronic lymphocytic leukemia is regulated by miR- 29 and miR- 181. Cancer Res. 2006; 66: 11590-3. 290 M. KOWAL 56. Laine J., Kunstle G., Obata T., Sha M., Noguchi M.: The proto-oncogene TCL1 is an Akt kinase coacivator. Mol Cell 2000; 6: 395–407. 57. Herling M., Patel KA., Khalili J et al: TCL1 shows a regulated expression pattern in chronic lymphocytic leukemia that correlates with molecular subtypes and proliferative state. Leukemia 2006; 20: 280–285. Praca wpłynęła do Redakcji 20.06.2007 i została zakwalifikowana do druku 12.09.2007 r. Adres Autora Małgorzata Kowal Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku Akademii Medycznej w Lublinie Ul. Staszica 11, 20-081 Lublin Tel. 081-5342397, fax 081-5345605 [email protected]
