SEMINARIUM 1 Budowa i właściwości makrocząsteczek życia Skład chemiczny oraz budowa kwasów nukleinowych: definicje pojęć: kwas deoksyrybonukleinowy, kwas rybonukleinowy, ryboza, deoksyryboza, zasady azotowe; właściwości zasad azotowych:- pirymidynowe: cytozyna, uracyl, tymina; - purynowe: adenina i guanina; wiązanie fosfodiestrowe, wiązanie β-N-glikozydowe, wiązania wodorowe, koniec 3’, koniec 5’ nici kwasu nukleinowego, nukleozyd, nukleotyd, budowa helisy DNA, komplementarność zasad; rodzaje struktur DNA: BDNA, A-DNA, Z-DNA, struktura RNA, struktura szpilki do włosów. Skład chemiczny oraz budowa białek: wzór ogólny aminokwasu, wiązanie peptydowe, aminokwasy egzogenne, aminokwasy endogenne, hydrofobowe aminokwasy alifatyczne, hydrofobowe aminokwasy aromatyczne, polarne aminokwasy obdarzone ładunkiem, polarne aminokwasy pozbawione ładunku, struktura białka: I-rzędowa, II-rzędowa, III-rzędowa, IV-rzędowa, funkcje białek. Skład chemiczny oraz budowa cukrów: Cukry: cukry proste - aldozy, ketozy, cukry złożone - dwucukry, oligosacharydy, polisacharydy, izomery, aldehyd-3-glicerynowy, ryboza, glukoza, galaktoza, piranozowe formy pierścieniowe, furanozowe formy pierścieniowe, disacharydy, laktoza, maltoza, sacharoza, celobioza, polisacharydy glikogen, celuloza, funkcje cukrów. Skład chemiczny oraz budowa kwasów tłuszczowych i tłuszczy: nasycone kwasy tłuszczowe, nienasycone kwasy tłuszczowe, niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe, kwasy -3, kwasy -6, tłuszcze właściwe (triacyloglicerole, triglicerydy) funkcje lipidów, podział lipidów, tłuszcze właściwe, woski, fosfolipidy, glikolipidy. Spektrofotometryczne metody oznaczania kwasów nukleinowych i białek: spektrofotometria absorpcyjna, spektrofotometria w świetle widzialnym (VIS), kolorymetria, spektrofotometria w świetle nadfioletowym (UV), absorbancja, prawo Lamberta-Beera, spektrofotometryczne oznaczanie kwasów nukleinowych i białek, widmo absorpcyjne, długość fali, oznaczanie czystości próbek kwasów nukleinowych, krzywa wzorcowa. SEMINARIUM 2 Struktura molekularna organelli komórkowych budowa i zasada działania mikroskopu świetlnego, mitochondrium, siateczka śródplazmatyczna, rybosomy, peroksysom, lizosom pierwotny, lizosom wtórny, błona komórkowa, budowa, aparat Golgiego, jądro komórkowe, macierz jądrowa, otoczka jądrowa, wymiana jądrowoplazmatyczna, jąderko, cytoszkielet, mikrotubule, mikrofilamenty, aktyna, białka wiążące aktynę (ABPs = actin-binding proteins), tubulina, białka towarzyszące mikrotubulom (nietubularne – tektyny i MAPs = microtubule-binding proteins), białka motoryczne mikrotubul (dyneiny, kinezyny), centrosom, centriole Struktura czynnościowa komórki eukariotycznej czynność błony komórkowej, transport przez błonę komórkową, dyfuzja prosta, dyfuzja ułatwiona, transport aktywny, symporter sodowo glukozowy, adenozynotrójfosfataza sodowo potasowa, transportery ABC, przedziały komórkowe, transport białek w komórce, transport do jądra komórkowego, bałka Ran, receptory transportu jądrowego, transport do mitochondrium, kompleks TOM, transport do peroksysomów, białka PEX, transport do siateczki wewnątrzplazmatycznej, białko translokacyjne, transport pęcherzykowy, kompleks COPI, kompleks COPII, klatryna, białka SNARE, czynność aparatu Golgiego, receptor M6P, wymiana białek przez aparat Golgiego, peptyd sygnałowy, peptydaza sygnałowa, sortowanie białek, endocytoza, egzocytoza, czynność lizosomów, czynność mitochondrium, łańcuch oddechowy, synteza adenozynotrójfosforanu, fosforylacja oksydacyjna, łańcuch transportu elektronów w trakcie łańcucha oddechowego, gradient protonowy błony wewnętrznej mitochondrium i jego źródło. SEMINARIUM 3 Molekularna organizacja informacji genetycznej: Genom człowieka. Genom, genom jądrowy, genom mitochondrialny, proteom, transkryptom. Sekwencje w genomie człowieka: sekwencje kodujące, sekwencje niekodujące, sekwencje powtarzające się: tandemowe (satelitarne, minisatelitarne, mikrosatelitarne) i rozproszone (SINE, LINE), VNTR. RNA komórki: hnRNArna, snoRNA, miRNA, siRNA. 1 Poziomy organizacji chromatyny: nukleosom, solenoid (włókno 30nm), supersolenoid, zwinięta spirala, chromatyda, chromosom metafazowy. Budowa chromosomu metafazowego, kinetochory, białka CENP-A. Cytogenetyka. Cytogenetyka klasyczna – prążkowanie – prążki: G, HRT, R, Q, C, AgNOR). Cytogenetyka molekularna - ISH, FISH, odmiany metody FISH: fiber FISH, SKY-FISH, M-FISH, porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH), mikromacierze CGH), cytometria przepływowa. Przygotowanie kariogramu; fitohemaglutynina, kolchicyna, transformacja blastyczna, kariotyp, kariogram, idiogram. Lyonizacja, ciałko Barra, pałeczka Dobosza. SEMINARIUM 4 Molekularne podstawy regulacji podziałów komórkowych kolchicyna, mitoza – profaza, prometafaza, metafaza, anafaza, telofaza, cytokineza, wrzeciono podziałowe, mikrotubule aparatu mitotycznego, włókna mikrotubularne – ciągłe, kinetochorowe, międzychromosomowe, astralne, centrosfera (astrosfera), pierścień komórkowy (dot. cytokinezy), polimeryzacja/depolimeryzacja mikrotubul kinetochorowych, dynamiczna niestabilność mikrotubul, cykliny (cykliny mitotyczne = A, B, cykliny G1 = C, D, E), cyklinozależne kinazy (Cdks 2-9), fosforylacja, defosforylacja, punkty kontrolne cyklu komórkowego, inhibitory Cdks, rodzina białek p16 i p21, p27, pRb, p53, APC (kompleks promujący anafazę, anaphase promoting complex), czynnik promujący mitozę = mitosispromoting factor (MPF), fosfataza Cdc25 (cdc = cell division cycle), CDK1 = kinaza p34, kinaza aktywująca cyklinę = cyclin activating kinase, CAK, kinaza Wee1, , gen supresorowy, onkogen, interfaza, faza G1, faza S, faza G2, faza G0, faza M, ubikwitynozależna proteoliza białek regulatorowych cyklu komórkowego, Mejoza porównanie podziałów komórkowych (mitoza – mejoza), I podział mejotyczny; profaza I – leptoten, zygoten, pachyten, diploten, diakineza; metafaza I; anafaza I; telofazaI; II podział mejotyczny; profaza II, metafaza II; anafaza II; telofaza II, crossing – over, nondysjunkcja. Regulacja molekularna podziału komórki ze szczególnym uwzględnieniem białek Rho, kinaz Aurora oraz Polo – like. Dojrzewanie oocytu i plemników ssaków Molekularne aspekty śmierci komórki Autofagia, śmierć martwicza (nekrotyczna) komórek, katastrofa mitotyczna, programowana śmierć komórki (apoptoza), kaspazy – rodzaje, budowa – struktura domenowa, homoaktywacja i heteroaktywacja, kaskada aktywacji kaspaz, szlaki indukowania programowanej śmierci komórki: 1) receptorowy (w tym promowanie przeżycia komórki skutkiem fosforylacji NFkB i pozytywnej ekspresji regulowanej przez ten czynnik transkrypcyjny genów, aktywacja kaspazy 2 poprzez RIP i RAIDD/CRADD), 2) pseudoreceptorowy (udział granzymu B w a) aktywacji kaspazy 3, b) aktywacji Bid, c) inaktywacji DFF45/ICAD/aktywacji endonukleazy DFF40/CAD), 3) mitochondrialny (w tym – łączenie ze ścieżką receptorową na poziomie kaspazy inicjującej, megakanały – ANT, VDAC, BPR, enzymy (heksokinaza, kinaza kreatynowa), białka macierzy - cyklofilina D, apoptosom – udział kofaktorów (cytochromu c, dATP/ATP) w stymulacji autooligomeryzacji Apaf1 i katalitycznej aktywacji kaspazy 9), 4) sfingomielinowo-ceramidowy (sfingomielinaza – obojętna lub kwaśna, sfingomielina, ceramid, fosfolipaza A2, kinazy MAPKs, kinazy stresu SAPK/JNK, CAPK = ceramide activated protein kinase, CAPP = ceramede-activated protein phosphatase), 5) indukowany stresem (sygnał wywołujący, aktywacja kaspazy 12), 6) bez udziału kaspaz (AIF, granzym A, granzym B – aktywacja DFF), p53, (w tym jego fosforylacja, tetrameryzacja, degradacja ubikwitynozależna, struktura domen – 1) domena aktywująca transkrypcję = TAD, 2) domena aktywacyjna 2 = AD2, 3) domena bogata w reszty proliny, ważna dla aktywności apoptotycznej, 4) centralna domena wiązania z DNA = BDB, 5) domena sygnalna, warunkująca jądrową lokalizację p53, 6) domena warunkująca oligomeryzację, 7) domena zaangażowana w regulację wiązania DNA poprzez domenę centralną; mutacje w genie p53 – zespół Li-Fraumeni), Mdm2, ASPP = apoptotic specific regulator of p53, ARF = alternative reading frame (dotyczy alternatywnej ekspresji genu p16 = INK4a), JMY = junction mediating and regulatory protein, p53 cofactor, pRb, Bad, Bax, Bid, tBid, E2F, DISC, FADD, Fas-L, TRADD, TRAIL, Bak (ang. Bcl2 homologous antagonist/killer), Noxa, Apaf(s), DED (domena), i inne hasła zestawione poniżej (dot. apoptozy); Rozwinięcie akronimów opisujących nazwy wskazanych w sylabusie genów/białek uczestniczących w regulacji apoptozy Acinus – ang. apoptosis chromatin condensation inducer in the nucleus, białko jądrowe indukujące apoptotyczną kondensację chromatyny; AIF – ang. apoptosis inducing factor, czynnik indukujący apoptozę, białko uczestniczące w szlaku indukcji apoptozy bez udziału kaspaz, po proteolitycznym uwolnieniu z wewnętrznej błony mitochondrialnej osiąga cytoplazmę, skąd, dzięki domenie NLS (nuclear localization sequence, sekwencja lokalizacji jądra) może być translokowane do jądra komórkowego; 2 Apaf-1/APAF-1 – ang. apoptosis protease activating factor -1, 1 czynnik aktywujący proteazy w apoptozie; cytoplazmatyczne białko wiążące uwolniony z mitochondrium cytochrom c i ATP w oligomerycznym kompleksie apoptosomu, koniecznym dla aktywacji kaspazy 9; ANT – ang. adenine nucleotide translocator, translokaza nukleotydów adeninowych, element megakanałów mitochondrialnych obecny w błonie wewnętrznej mitochondrium; Bad – ang. Bcl-2 antagonist of cell death, jedno z białek proapoptotycznych; Bax – ang. the Bcl-2-associated protein, cytoplazmatyczne białko o aktywności proapoptotycznej, po zmianie konformacji przestrzennej włączane jest w zewnętrzną błonę mitochondrialną, gdzie, wchodząc w kontakt z poryną VDAC, pozytywnie reguluje otwieranie megakanałów w miejscu styku obu błon mitochondrialnych (PTPs – ang. permeability transition pores); otwieranie megakanałów w szlaku mitochondrialnym indukowania apoptozy prowadzi do obniżenia potencjału transbłonowego, ograniczenia produkcji ATP, spadku zawartości wewnatrzmitochondrialnej puli związków tiolowych, wzrostu stężenia Ca 2+ w macierzy mitochondrialnej, czemu towarzyszy wypływ z przestrzeni międzybłonowej do cytozolu białek promujących apoptozę (cytochrom c, prokaspazy-2, -3, -9, białka Smac/DIABLO, AIF); Bcl-2 – ang. B-cell leukemia/lymphoma 2, produkt protoonkogenu Bcl-2 o aktywności antyapoptotycznej, w szerszym rozumieniu białka rodziny Bcl-2, zarówno o aktywności pro-, jak i antyapoptotycznej; BH 1-4 – ang, Bcl-2 homology 1-4, domeny homologii w rodzinie białek Bcl-2, decydują o zdolności do dimeryzacji tych białek, ułatwiając tworzenie homo- i heterodimerów, jak również oddziaływanie z innymi białkami regulującymi apoptozę. W oparciu o występowanie domen homologii i właściwości wynikające z ich budowy, białka rodziny Bcl-2 dzieli się na 3 klasy (podrodziny): I (podrodzina Bcl-2) – białka antyapoptotyczne (w tym białko Bcl-2), w większości zawierające domeny BH 1-4; II (podrodzina Bax) – białka proapoptotyczne pozbawione domeny BH4, bądź zawierające pewne jej motywy (w tym białka Bax, Bak); III (podrodzina BH3) – białka proapoptotyczne zawierajace jedyną domenę homologii BH3 (w tym białka Bad, Bid); Bid – ang. the BH3 interacting-domain death agonist, białko rodziny Bcl-2 o aktywności proapoptotycznej, zawierające w strukturze wyłącznie domenę homologii BH3, współdziałające z białkiem Bax, ułatwia jego wbudowanie w zewnętrzną błonę mitochobdrialną; BPR – ang. benzodiazepine peripheral receptor, obwodowy receptor benzodiazepiny, element megakanałów mitochondrialnych obecny w błonie zewnętrznej mitochondrium, buduje kompleks z udziałem białka VDAC, białek enzymatycznych (kinaza kreatynowa, syntaza kardiolipiny, heksokinaza, kinaza glicerolowa, peroksydaza glutationowa 4, dehydrogeneza/izomeraza 3-beta hydroksy steroidów) i niektórych białek macierzy (cyklofilina D); CAD – ang. caspase –activated Dbase, deoksyrybonukleaza zależna od Mg2+, homolog DFF opisany w komórkach limfoidalnych myszy; CANP – ang. Ca2+-activated neutral proteinase, zależna od Ca2+ obojętna endopeptydaza, kalpaza, enzym proteolityczny uczestniczący, obok kaspaz, w apoptozie; bierze udział w degradacji białek cytoszkieletu, cytokin, enzymów szlaków sygnalizacji komórkowej, ale także w proteolitycznej aktywacji kaspaz (3, 7, 9); CPAN – ang. caspase-activated nuclease, nukleaza aktywowana przez kaspazę, endonukleaza zależna od Mg2+ aktywowana przez kaspazę 3 (patrz też CAD, DFF); DD – ang. death domain, domena śmierci; DED – ang. death effector domain, efektorowa domena śmierci; DFF – ang. defragmentation factor, czynnik defragmentacji DNA, deoksyrybonukleaza, zależna od Mg2+, odpowiedzialna za efektywną fragmentację chromatynowego DNA w komórkach apoptotycznych, dokonuje cięć DNA między nukleosomami; enzym opisany w komórkach HeLa, składa się z dwóch podjednostek – katalitycznej (DFF40/CAD = defragmentation factor 40 kDa/caspase activated DNase) i regulatorowej DFF45/ICAD = defragmentation factor 45 kDa/inhibitor of caspase activated DNase), podjednostka regulatorowa wobec podjednostki katalitycznej pełni funkcję białka opiekuńczego, zapewniającego właściwe fałdowanie, oraz jej inhibitora; prawidłowa czynność podjednostki katalitycznej DFF/CAD możliwa jest w następstwie proteolitycznej inaktywacji podjednostki regulatorowej tego enzymu, z udziałem kaspaz (lub GrB); DISC – ang. death inducing signalling complex, kompleks inicjujący apoptozę, odpowiednikiem heterokompleksu DISC w szlaku mitochondrialnym jest apoptosom; FADD – ang. Fas-associated death domain, białko adaptorowe z domeną smierci wiążące się z receptorem Fas; Fas-L – ang. Fas-ligand, ligand receptora Fas; GrB – ang. granzyme B, granzym B, proteaza serynowa uczestnicząca w pseudoreceptorowym szlaku indukcji apoptozy, kierowana do uśmiercanej komórki przez limfocyty T i komórki NK, uwalniana 3 jednocześnie z poryną, która umożliwia wnikanie enzymu; w komórce docelowej granzym B, podobnie do kaspaz, dokonuje cięć substratów między resztą kwasu asparaginianowego i resztą kolejnego aminokwasu, przez co może uruchamiać kaskadę kaspaz, inaktywować podjednostkę regulatorową (inhibitorową) jądrowej endonukleazy DFF (DFF45/ICAD), czy dokonywać proteolitycznego cięcia białka Bid, z utworzeniem jego aktywnej pochodnej tBid; Kaspazy – ang. caspases = cysteine-dependent aspartate-directed proteases, rodzina proteaz cysteinowych odgrywających kluczową rolę w szlakach indukowania programowanej śmierci komórki (ale także w regulacji dojrzewania wielu komórek, w tym erytrocytów i mioblastów, czy rozwoju stanu zapalnego); numeracja kaspaz nawiązuje do kolejności w jakiej były one opisywane, kaspazy dzieli się na 3 grupy czynnościowe: 1) aktywatory cytokin związane ze stanami zapalnymi (kaspazy-1, -4, -5, -11, -12, -13, -14), 2) inicjatory (kaspazy-2, -8, -9, -10, [-12]), 3) efektory fazy wykonawczej apoptozy (kaspazy-3, -6, -7); NS – ang. nuclear scaffold, zależna od Ca2+ peptydaza, odpowiedzialna w apoptozie za degradację lamin (białek karioszkieletu, będących głównymi składowymi blaszki jądrowej); PIGs – ang. p53 induced genes, geny których ekspresja zależna jest od białka p53, kodujące białka enzymatyczne (oksydoreduktazy), których produkty (reaktywne formy tlenu) należą do grupy czynników uruchamiających mitochondrialny szlak programowanej śmierci komórki; p53 – ang. protein 53, ale też tumor protein 53 = TP53 (u człowieka produkt genu TP53, 17p13.1), białko o masie cząsteczkowej 53 kDa szacowanej na podstawie jego izolacji w żelu poliakrylamidowym, jego rzeczywista masa, określana na podstawie zawartości reszt aminokwasowych jest nieco mniejsza (43,7 kDa); czynnik transkrypcyjny znany jako supresor nowotworowy, uczestniczący w regulacji cyklu komórkowego (strażnik genomu), w odpowiedzi na uszkodzenie DNA aktywuje białka uczestniczące w jego naprawie, jednocześnie hamując cykl komórkowy w punkcie G1/S, gdy uszkodzenie DNA nie może być naprawione, inicjuje apoptozę, pozytywnie regulując ekspresję genów kodujących białka o aktywności proapoptotycznej; PUMA – ang. the p53 upregulated modulator of apoptosis, białko rodziny Bcl-2 o aktywności proapoptotycznej, wiążąc białka tej rodziny o działaniu antyapoptotycznym (Bcl-xL, Bcl-2, Mcl-1, Bcl-w, A1), przez co niezdolne są one hamować czynność białek Bax, czy Bak, uczestniczy w regulacji mitochondrialnej ścieżki indukowania apoptozy; Smac/DIABLO – ang. second mitochondrial activator of caspase/direct IAP binding protein with low pI, wtórny mitochondrialny aktywator kaspazy/białko wiążące bezpośrednio IAP o niskim pI, moitochondrialne białko proapoptotyczne uwalniane po otwarciu megakanałów do cytoplazy, gdzie wiąże i inaktywuje białkowe inhibitory kaspaz (IAPs – ang. inhibitor of apoptosis proteins); tBid – ang. truncated Bid, skrócona (aktywna) forma białka Bid; TRADD – ang. TNF-R1 associated death domain, białko adaptorowe z domeną śmierci wiążące się z receptorem TNF-R1; TRAIL – ang. TNF-related apoptosis-indicing ligand, ligand z rodziny TNF indukujący apoptozę; VDAC – ang. voltage-dependent anion channel, poryna obecna w błonie zewnętrznej mitochondrium, wchodząc w kompleksy z białkami rodziny Bcl-2 modyfikuje otwieranie megakanałów; SEMINARIUM 5 Molekularne mechanizmy ekspresji genów (replikacja, transkrypcja i translacja) Genom, genotyp, fenotyp, gen, allel Replikacja DNA: Helisa DNA, model semikonserwatywny replikacji, zasada komplementacji zasad, widełki replikacyjne, bąbel replikacyjny, fragmenty Okazaki, nić wiodąca, nić opóźniona, kierunek replikacji, enzymy biorące udział w replikacji DNA; ori; telomery, naprawa błędów replikacyjnych Transkrypcja: kod genetyczny, rodzaje RNA, etapy transkrypcji, kierunek transkrypcji, enzymy biorące udział w transkrypcji, czynniki transkrypcyjne, aktywator, represor, elementy cis- i trans-; obróbka posttranskrypcyjna Translacja: etapy translacji, enzymy biorące udział w translacji, obróbka posttranslacyjna Reakcja PCR: etapy reakcji PCR, warunki reakcji, modyfikacje reakcji PCR, zasady projektowania starterów reakcji PCR, 4