Łańcuchowa reakcja polimerazy w czasie rzeczywistym
advertisement
PRACE POGL¥DOWE Aleksandra WYCZA£KOWSKA-TOMASIK Jolanta ¯EGARSKA £añcuchowa reakcja polimerazy w czasie rzeczywistym zastosowanie w badaniach naukowych i diagnostyce medycznej Real-time polymerase chain reaction applications in research and clinical molecular diagnostics Klinika Immunologii, Transplantologii i Chorób Wewnêtrznych, Instytut Transplantologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny Warszawa, Polska Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Leszek P¹czek Dodatkowe s³owa kluczowe: PCR w czasie rzeczywistym badania naukowe diagnostyka medyczna ekspresja genu ³adunek wirusów ³adunek bakterii Additional key words: real time PCR research clinical molecular diagnostics gene expression viral load bacterial load Adres do korespondencji: Dr n. med. Aleksandra Wycza³kowska-Tomasik Klinika Immunologii, Transplantologii i Chorób Wewnêtrznych Instytut Transplantologii 02-006 Warszawa, ul. Nowogrodzka 59 Tel.: 0225021190; Fax.: 0225022127 e-mail: [email protected] Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 4 Ostatnie lata przynios³y szybki rozwój jednej z technik biologii molekularnej, ³añcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. real time polymerase chain reaction, real time PCR). Zosta³a ona wprowadzona do powszechnego u¿ytku. Za pomoc¹ PCR w czasie rzeczywistym mo¿na wykryæ i okreliæ ilociowo bardzo ma³e iloci specyficznych sekwencji kwasów nukleinowych. W badaniach naukowych g³ównym zastosowaniem tej metody jest szybka i dok³adna detekcja zmian w ekspresji genów, bêd¹cej wyrazem mechanizmów fizjologicznych lub patofizjologicznych. Dla celów klinicznych metodê tê wykorzystuje siê do pomiaru ³adunku wirusów lub bakterii, b¹d oceny statusu nowotworowego. Resent years have brought fast development of one of the molecular biology methodology, real time polymerase chain reaction. It has been introduced in common use. Real time PCR allows to detect and qualify very small amounts of specific nucleic acid sequences. As a research tool, a major application of this method is the rapid and accurate detection of genes expression changes as a result of physiological and pathophysiological mechanisms. In clinical diagnostics, this method is used to measure viral or bacterial load or to assess cancer status. W ostatnich latach nast¹pi³ gwa³towny rozwój jednej z technik biologii molekularnej, ³añcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. real time polymerase chain reaction, real time PCR) i zosta³a ona wprowadzona do powszechnego u¿ytku. Za pomoc¹ PCR w czasie rzeczywistym mo¿na wykryæ i okreliæ ilociowo bardzo ma³e iloci specyficznych sekwencji kwasów nukleinowych. W badaniach naukowych g³ównym zastosowaniem tej metody jest szybka i dok³adna detekcja zmian w ekspresji genów, bêd¹cej wyrazem mechanizmów fizjologicznych lub patofizjologicznych. Dla celów klinicznych metodê tê wykorzystuje siê do pomiaru ³adunku wirusów lub bakterii, b¹d oceny statusu nowotworowego. PCR w czasie rzeczywistym jest oparta na rewolucyjnej metodzie PCR, pozwalaj¹cej na amplifikacjê fragmentu DNA ponad bilion razy, opracowanej przez Kary'ego Mullisa w po³owie lat osiemdziesi¹tych XX wieku [13,23,25]. Za to odkrycie w 1993 roku otrzyma³ on Nagrodê Nobla w dziedzinie chemii [13,23]. PCR, tak¿e PCR w czasie rzeczywistym, wykorzystuje polimerazê DNA w celu amplifikacji specyficznego fragmentu DNA oraz primery, czyli krótkie, specyficzne dla danej sekwencji oligonukleotydy. Reakcja PCR sk³ada siê z powtarzaj¹cych siê cykli, a ka¿dy z nich z³o¿ony jest z trzech faz. Pocz¹tkowo, w temperaturze 95oC dochodzi do rozpadu podwójnej nici DNA na dwie pojedyncze nici (denaturacja). Nastêpnie temperatura jest obni¿ana do oko³o 50-75oC i do pojedynczej nici DNA, tzw. matrycy, przy³¹czaj¹ siê primery (przy³¹czanie, ang. annealing). W kolejnym etapie polimeraza DNA w temperaturze 72-78oC rozpoczyna ich wyd³u¿anie, poprzez dobudowanie pojedynczych komplementarnych nukleotydów (wyd³u¿anie) i w ten sposób powstaje nowa niæ DNA [17]. Przed nastêpnym cyklem PCR nowe dwuniciowe DNA musi ulec ponownie degradacji. Takich cykli PCR jest kilkadziesi¹t, a reakcja zachodzi w termocyklerze. Zak³adaj¹c, ¿e skutecznoæ reakcji jest idealna, iloæ specyficznego dwuniciowego DNA by³aby podwojona po ka¿dym cyklu PCR. Poniewa¿ polimeraza DNA nie mo¿e u¿yæ RNA jako matrycy, potrzebny jest wówczas inny enzym odwrotna transkryptaza, który podczas reakcji odwrotnej transkrypcji na matrycy RNA syntetyzuje pojedyncz¹ komplementarn¹ niæ DNA. PCR w czasie rzeczywistym, w odró¿nieniu od klasycznego PCR, posiada system monitoruj¹cy zaawansowanie amplifikacji przy pomocy technologii fluorescencyjnej. Prekursorami badania kinetyki reakcji PCR byli Higuchi i wsp. [13,25]. W 1992 roku stworzyli oni system zdolny do detekcji produktów PCR podczas ich akumulacji. System ten zawiera³ w mieszaninie reakcyjnej interkaluj¹c¹ cz¹steczkê bromku etydyny. Termocykler zaadaptowano do nawietlania 209 próbek wiat³em UV. Detekcja powsta³ej fluorescencji natomiast odbywa³a siê przy u¿yciu po³¹czonej z komputerem kamery [10,11,25]. Podczas amplifikacji wzrasta³a iloæ dwuniciowego DNA (dsDNA), z którym interkalowa³ bromek etydyny. Wi¹za³o siê to ze wzrostem fluorescencji. Wynikiem by³ wykres zale¿noci miêdzy fluorescencj¹ a numerem cyklu. Bromek etydyny szybko zast¹piono mniej toksycznym, bardziej specyficznym i bardziej czu³ym barwnikiem fluorescencyjnym SYBR Green I. Barwnik ten ³¹czy siê z dsDNA, nie wi¹¿e siê natomiast z jednoniciowym DNA (ssDNA). W wyniku po³¹czenia barwnika z DNA nastêpuje wzrost fluorescencji. Ograniczeniem tej metody jest fakt, ¿e SYBR Green I rozpoznaje równie¿ sekwencje niespecyficzne, wynikiem tego jest przy³¹czanie siê barwnika do ka¿dej dwuniciowej cz¹steczki DNA. W celu wyeliminowania wszelkich nieprawid³owoci procesu stosuje siê analizê krzywej topnienia, która pozwala odrzuciæ produkty niespecyficzne [16,25]. Problem specyficznoci fluorescencyjnej amplifikowanego fragmentu zosta³ rozwi¹zany poprzez zastosowanie specyficznych sond znakowanych fluorescencyjnie. Obecnie w metodzie real-time PCR oprócz barwników interkaluj¹cych DNA bromku etydyny i SYBR Green I wykorzystuje siê sondy hybrydyzuj¹ce, np. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), TaqMan, Molecular Beacons, Scorpions, TaqMan Minor Groove Binder (TaqMan MGB; pol. wi¹¿¹ca mniejsz¹ bruzdê) [16,17,25]. W zale¿noci od zastosowanej sondy mamy do czynienia z ró¿nym przebiegiem reakcji. Zostanie ona omówiona na przyk³adzie sondy TaqMan. Metoda ta oparta jest na zastosowaniu sondy podwójnie znakowanej barwnikami fluorescencyjnymi. Sondê stanowi zazwyczaj oligonukleotyd o d³ugoci 20-30 zasad. Na jej koñcu 5' znajduje siê barwnik zwany reporterem, a na koñcu 3' tzw. quencher (wygaszasz). Wród najczêciej stosowanych barwników wystêpuj¹, jako reporter: 6-karboksyfluoresceina (FAM), VIC, 2,7-dimetoksy-4,5-dichloro-6-karboksyfluoresceina (JOE) i jako quencher 6-karboksytetrametylrodamina (TAMRA). Dodatkowo wystêpuje tzw. barwnik pasywny 6-karboksy-N,N,N',N'-tetrametylorodamina (ROX). Jest on wewnêtrznym odnonikiem w reakcji, stosowany do normalizacji i porównania z barwnikiem reporterowym w celu korekty b³êdów, wynikaj¹cych z pipetowania lub zmiennych stê¿eñ próbek [16,17,25]. Podczas reakcji PCR sonda wi¹¿e siê z matryc¹ pomiêdzy miejscami wi¹zania primerów (rycina 1A). W momencie, gdy oba barwniki s¹ po³¹czone z nienaruszon¹ sond¹, emisja fluorescencji reportera jest zahamowana przez quencher (rycina 1B). Podczas fazy wyd³u¿ania dochodzi do degradacji sondy przez polimerazê DNA (rycina 1C). Sonda ulega przeciêciu w miejscu miêdzy reporterem a quencherem. W wyniku tego nastêpuje uwolnienie reportera i emisja fluorescencji. PCR w czasie rzeczywistym jest bardzo czu³a i precyzyjna oraz pozwala na monitorowanie reakcji w czasie, w którym ona rze210 A Q R R B Q Taq R C Q Taq Rycina 1 Zasada dzia³ania real-time PCR z zastosowaniem sondy TaqMan (R: reporter, Q: quencher, Taq: polimeraza Taq). The rule of effect of real-time PCR with the use of TaqMan probe (R: reporter, Q: quencher, Taq: polimerase Taq). Ct Rycina 2 Kinetyka przyrostu iloci produktów w reakcji PCR prowadzonej w aparacie ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Kinetic of products' quantity increase in PCR reaction in the ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). czywicie zachodzi. W tej metodzie powielana jest specyficzna badana sekwencja w próbce, a nastêpnie monitorowane zaawansowanie amplifikacji przy pomocy technologii fluorescencyjnej. Reakcja PCR zwi¹zana jest z emisj¹ sygna³u fluorescencyjnego proporcjonalnego do iloci produktu powstaj¹cego w ka¿dym cyklu reakcji, a tym samym do iloci matrycy. Iloæ kopii badanego fragmentu kwasu nukleinowego jest monitorowana w ka¿dym cyklu reakcji amplifikacji. Numer cyklu reakcji PCR, przy którym poziom fluorescencji wzronie powy¿ej sygna³u podstawowego i przekroczy zdefiniowany próg, (Ct; ang. threshold cycle) jest stosowany do obliczenia iloci DNA obecnego w mieszaninie reakcyjnej na jej pocz¹tku. Ct najczêciej jest to moment wejcia kinetyki reakcji w fazê logarytmicznego przyPrzegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 4 rostu iloci produktu (rycina 2) [4,9]. W sk³ad mieszaniny reakcyjnej real-time PCR wchodz¹: sonda znakowana barwnikami fluorescencyjnymi, odpowiednio dobrane primery, enzym polimeraza DNA oraz matryca DNA. Poza tym mieszaninê tê stanowi bufor reakcyjny, zawieraj¹cy niezbêdne do pracy enzymu jony metali, jak równie¿ dwufosforany dezoksyrybonukleotydów (dNTPs). Reakcja zachodzi w aparacie, na który sk³adaj¹ siê: termocykler, posiadaj¹cy mo¿liwoæ szybkich zmian temperatury, urz¹dzenie do wzbudzania energii fluorochromów diodê, lampê emituj¹c¹ wiat³o (LED) lub laser, a tak¿e fotodetektor. Obecny jest tak¿e komputer z odpowiednim oprogramowaniem, s³u¿¹cym do analizy danych. Obecnie dostêpnych jest wiele aparatów tego A. Wycza³kowska-Tomasik i wsp. typu: ABI Prism 7000 (Applied Biosystems), ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems), Mx4000 (Stratagene), Mx3000P (Stratagene), iCycler iQ (Bio-Rad), LightCycler (Roche), SmartCycler (Cepheid), Rotor-Gene (Corbett) i DNA Engine Opticon 2 (MJ Research) [25]. Sposób prowadzenia reakcji real-time PCR mo¿liwy jest na dwa sposoby. Pierwszy z nich to wzglêdne oznaczenie ilociowe. Polega ono na wyznaczeniu ró¿nicy Ct genu badanego i genu referencyjnego (kontrola wewnêtrzna, tzw. housekeeping gene), o konstytutywnej, sta³ej ekspresji, w danej grupie badanej (DCt). Najczêciej stosowanymi genami referencyjnymi s¹: dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa (GAPDH), ß-aktyna, cyklofilina, 18S rRNA i receptor dla transferyny. Nastêpnie otrzymana wartoæ dla grupy badanej porównywana jest z grup¹ kontroln¹ (DDCt) [15,16]. Drugi sposób przeprowadzenia powy¿szego oznaczenia polega na wykorzystaniu krzywej standardowej. Obok prób badanych, reakcji poddaje siê równie¿ próbki standardu o znanym stê¿eniu. Nastêpnie aparat na podstawie krzywej standardowej wylicza stê¿enia matrycy DNA w ka¿dej próbie badanej [9,14]. Istnieje wiele metod biologii molekularnej, s³u¿¹cych do oceny ilociowej kwasów nukleinowych, min.: hybrydyzacje Northern i Southern, HPLC, PCR-ELISA, RNase protection assay, hybrydyzacja in situ oraz ró¿ne systemy PCR z elektroforez¹ na ¿elu. Wiêkszoæ z nich posiada pewne wady: s¹ czasoch³onne, pracoch³onne, nie wystarczaj¹co czu³e, nieilociowe, wymagaj¹ u¿ycia materia³ów radioaktywnych lub obarczone s¹ du¿ym ryzykiem zanieczyszczeñ. PCR w czasie rzeczywistym posiada wiele zalet w porównaniu z innymi metodami. Jedn¹ z wa¿niejszych jest mo¿liwoæ analizy ilociowej kwasów nukleinowych w bardzo szerokim zakresie, co najmniej 5 jednostek logarytmicznych. Poza tym charakteryzuje siê wyj¹tkow¹ czu³oci¹, pozwalaj¹c¹ na wykrycie mniej ni¿ 5 kopii badanej sekwencji [25]. Cechuje siê ponadto powtarzalnoci¹, jest szybka i zautomatyzowana. W koñcu, reakcja przeprowadzana jest w systemie zamkniêtym i nie wymaga dodatkowych manipulacji po zakoñczeniu PCR. Dziêki temu zminimalizowaniu ulega ryzyko kontaminacji próbek. Oczywicie, PCR w czasie rzeczywistym posiada te¿ ograniczenia. Etapami krytycznymi, warunkuj¹cymi prawid³owy przebieg dowiadczenia s¹: zaprojektowanie eksperymentu, standaryzacja protoko³ów ilociowego RT-PCR, wybór odczynników, przygotowanie matrycy oraz analiza danych. Jeli którykolwiek z tych etapów zostanie przeprowadzony w sposób nieprawid³owy, otrzymane dane mog¹ byæ niemiarodajne i prowadziæ do b³êdnych wniosków. ród³em b³êdów przy ocenie ekspresji genów bywa niewystarczaj¹ca jakoæ RNA. Pobranie materia³u biologicznego, jego zabezpieczenie, transport i przechowywanie, a tak¿e izolacja RNA maj¹ wp³yw na jakoæ RNA. Stanowi to jeden z najwa¿niejszych czynników, warunkuj¹cych powtarzalnoæ i wiarygodnoæ wyników. RNA, które mo¿na wykorzystaæ do PCR w czasie rzeczywistym Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 4 powinno spe³niaæ nastêpuj¹ce kryteria: byæ najlepszej jakoci, wolne od DNA, wolne od inhibitorów odwrotnej transkrypcji oraz wolne od nukleaz (wa¿ne przy d³ugim przechowywaniu) [5]. Jakoæ RNA powinna byæ oceniona poprzez elektroforezê na ¿elu agarozowym lub, najlepiej, w systemie takim jak Agilent Bioanalyzer, który stanowi nowy standard kontroli jakoci. W zwi¹zku z tym, ¿e materia³em biologicznym, z którego izoluje siê RNA jest czêsto niejednorodna tkanka, z³o¿ona z wielu ró¿nych subpopulacji komórek, ró¿nych linii, w ró¿nym stopniu zró¿nicowanych, wyniki PCR w czasie rzeczywistym s¹ urednione. Za szczególnie heterogenne próbki uwa¿a siê te pochodz¹ce z biopsji tkanki litej, w tym guzów [4]. Ekspresja mRNA jest zmienna nie tylko w ró¿nych komórkach, ale i u ró¿nych osobników tej samej grupy. Istotny dla wyników jest równie¿ etap odwrotnej transkrypcji, min. wybór primerów. Zarówno primery typu random, jak i oligodT, czy specyficzne dla danej sekwencji, maj¹ swoje zalety i wady, a ich wybór powinien zale¿eæ od konkretnej sytuacji [4]. Niska skutecznoæ reakcji przeprowadzenia RNA w cDNA mo¿e byæ znacz¹cym ograniczeniem reakcji RT-PCR. Reakcjê PCR mog¹ tak¿e zak³ócaæ inhibitory obecne w materiale biologicznym (hemoglobina, wapñ, acyklowir, mocznik). Problemem mo¿e byæ nieodpowiednie wykorzystanie kontroli wewnêtrznej. Prawdopodobnie nie istnieje pojedynczy gen, który spe³nia³by kryteria wymagane dla uniwersalnego genu referencyjnego. Wszystkie w pewnym stopniu podlegaj¹ regulacji oraz ¿aden z nich nie ulega ekspresji w sposób konstytutywny we wszystkich typach komórek i we wszystkich warunkach, niezale¿nie od zaprojektowanego dowiadczenia. Coraz wiêcej badañ wskazuje na to, ¿e b³êdem mo¿e byæ u¿ycie tylko jednego genu referencyjnego [26]. Tak¿e wybrany gen mo¿e wykazywaæ zmienn¹ ekspresjê w danych warunkach eksperymentalnych. Wykazano np., ¿e ekspresja mRNA dla GAPDH ró¿ni siê istotnie pomiêdzy osobnikami oraz pomiêdzy tkank¹ zdrow¹ i tkank¹ guza w raku jelita grubego u ludzi [6]. Tak wiêc jeli geny referencyjne maj¹ byæ wykorzystane, powinny byæ poddane walidacji w specyficznych warunkach danego dowiadczenia oraz najprawdopodobniej nale¿y wybraæ wiêcej ni¿ jeden z nich [5]. Nieprawid³owa normalizacja prowadzi do subiektywnych wyników, które nie odzwierciedlaj¹ biologicznej istotnoci. Mimo, ¿e w³aciwa normalizacja jest niezwykle istotna dla uzyskania wiarygodnych wyników, nie istnieje jedna, uniwersalna strategia, któr¹ mo¿na by zastosowaæ w ka¿dym dowiadczeniu. Pozostaje wiêc w gestii badacza znaleæ i sprawdziæ metodê najw³aciwsz¹ dla warunków jego dowiadczenia. Nie bez znaczenia pozostaje równie¿ odpowiednia analiza danych. Po przeprowadzeniu reakcji PCR mo¿e zajæ potrzeba korekcji linii bazowej lub threshold, co zmienia wartoæ Ct. W przeciwnym razie, wyniki zostan¹ zafa³szowane. Threshold powinien przecinaæ krzyw¹ amplifikacji w fazie ekspotencjalnej. Czasami jest wskazane ustalenie kilku wartoci threshold dla jednej p³ytki poddanej reakcji PCR [5]. PCR w czasie rzeczywistym posiada ogromn¹ moc, daje wiarygodne i powtarzalne wyniki, ale sukces w zastosowaniu tej metody mo¿e zapewniæ tylko niezwyk³a dba³oæ w zaprojektowaniu, zastosowaniu oraz walidacji dowiadczenia. Wydaje siê, ¿e istnieje pal¹ca potrzeba stworzenia ujednoliconych zaleceñ dotycz¹cych izolacji RNA, odwrotnej transkrypcji, analizy danych, oceny wyników oraz protoko³ów standaryzacji. W publikacji pracy, w której zastosowano tê metodê powinny byæ podane dok³adne informacje dotycz¹ce zastosowanych procedur dowiadczalnych. W przeciwnym razie, PCR w czasie rzeczywistym zamiast staæ siê metod¹ o ogromnym potencjale, pozostaje jedynie narzêdziem badañ naukowych. W badaniach naukowych PCR w czasie rzeczywistym wykorzystywany jest do oceny ekspresji genów. Oczekuje siê, ¿e ocena ekspresji genów pozwoli na zrozumienie z³o¿onej sieci regulacyjnej, identyfikacjê genów zwi¹zanych z nowymi procesami biologicznymi lub prowadz¹cych do rozwoju choroby. PCR w czasie rzeczywistym i mikromacierze s¹ to dwie niedawno rozwiniête metody, które zyska³y du¿¹ popularnoæ i które siê w tym celu czêsto stosuje. Mikromacierze pozwalaj¹ na jednoczesn¹ analizê tysiêcy genów w dwóch odmiennie znakowanych populacjach RNA, natomiast PCR w czasie rzeczywistym zapewnia równoczesny pomiar ekspresji genów w wielu ró¿nych próbkach dla ograniczonej liczby genów i jest metod¹ z wyboru, gdy dostêpna jest jedynie ma³a liczba komórek. Obie techniki w porównaniu do konwencjonalnych metod ilociowych, takich jak: hybrydyzacja Northern, czy kompetycyjny RTPCR, posiadaj¹ wiele korzyci szybkoæ, wydajnoæ, mo¿liwoæ automatyzacji. Niemniej jednak, PCR w czasie rzeczywistym jako metoda s³u¿¹ca do oceny ekspresji mRNA posiada pewne ograniczenia, o których wspomniano powy¿ej. Najm³odsz¹ dziedzin¹ diagnostyki medycznej jest diagnostyka molekularna, bêd¹ca najczulsz¹ i najszybsz¹ metod¹ odkrywaj¹c¹ pierwotne przyczyny choroby. Czo³owe miejsce w diagnostyce molekularnej zajmuje PCR w czasie rzeczywistym. Zalet¹ tej metody jest jej szybkoæ i prostota badania oraz mo¿liwoæ odczytu wyników bezporednio na ekranie monitora, bez koniecznoci wykonywania elektroforezy na ¿elu. Pozwala to na przeprowadzenie pomiarów ilociowych wirusów, bakterii i innych mikroorganizmów. PCR w czasie rzeczywistym wykorzystywany jest do okrelenia zmian ³adunku wirusa. Poniewa¿ ³adunek wirusa i ciê¿koæ choroby s¹ ze sob¹ powi¹zane, metoda ta pozwala oceniæ progresjê choroby i skutecznoæ leczenia przeciwwirusowego. Okrelenie liczby kopii wirusa (oznaczenie poziomu wiremii) jest jednym z najwa¿niejszych wskaników efektywnoci leczenia. Metody biologii molekularnej s¹ najlepszym sposobem potwierdzenia lub wykluczenia zaka¿enia zw³aszcza wówczas, gdy przeciwcia³a nie s¹ wykrywalne, mimo, ¿e zaka¿enie nast¹pi³o. Ma to miejsce we wczesnym okresie infekcji oraz u chorych z niedoborami odpornoci. Technika ta przy u¿yciu abso211 lutnej oceny ilociowej mo¿e równie¿ s³u¿yæ do ró¿nicowania pomiêdzy aktywn¹ a przetrwa³¹ infekcj¹. Pozwala tak¿e na wykazanie zwi¹zku pomiêdzy unikaln¹ sekwencj¹ wirusa a objawami klinicznymi pacjenta. Przyk³adem wirusów oznaczanych z wykorzystaniem PCR w czasie rzeczywistym s¹ Hepatitis B Virus (HBV), Hepatitis C Virus (HCV), Cytomegalovirus (CMV), Human Immunodeficiency Virus (HIV), Epstein-Barr Virus (EBV) [3,7,8,16,18-22,24]. Ilociowa diagnostyka zaka¿enia niektórymi wirusami, takimi jak Enterovirus czy Parvovirus B19 umo¿liwia wykluczenie powa¿nych zagro¿eñ dla pacjentów z obni¿on¹ odpornoci¹, np. leczonych immunosupresyjnie po przeszczepieniu narz¹dów. Powy¿sz¹ metod¹ oznaczane s¹ równie¿: Dengue Virus, HPA-Coronavirus (SARS), HSV 1/2, Orthopox, Varicella-Zoster Virus i West Nile Virus [2]. Wykorzystanie real-time PCR w parazytologii pozwala na precyzyjn¹ ocenê poziomu inwazji paso¿yta. Mo¿liwe jest to w przypadku Toxoplasma gondii. Z du¿¹ dok³adnoci¹ mo¿na oceniæ iloæ komórek paso¿yta zarówno we krwi jak i p³ynie mózgowo-rdzeniowym czy owodniowym [3, 12]. Przyk³adem stosowania powy¿szej metody s¹ równie¿ inne pierwotniaki Entamoeba histolityca, Plasmodium sp. [2]. Zastosowanie technik biologii molekularnej pozwala na ³atwe potwierdzenie lub wykluczenie infekcji bakteryjnej bez koniecznoci zak³adania hodowli. Szybkie i wczesne wykrycie patogenu pozwala na natychmiastowe w³¹czenie celowanego leczenia antybiotykiem, ogranicza stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum, a tym samym przyczynia siê do ograniczenia wystêpowania szczepów antybiotykoopornych. Metoda ta jest szczególnie przydatna w przypadkach tych drobnoustrojów, które rosn¹ bardzo wolno lub nie namna¿aj¹ siê w hodowli, np. Mycobacterium tuberculosis [8]. PCR w czasie rzeczywistym jest wykorzystywana do wykrywania bakterii takich jak: Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Bacillus anthracis, Campylobacter sp., Chlamydia trachomatis, Listeria monocytogenes, Mycobacterium paratuberculosis, Salmonella sp. [2]. Analiza mutacji pozwala monitorowaæ opornoæ na antybiotyki wród: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Helicobacter pylori, Enterococcus faecalis, i Enterococcus faecium [25]. ród³em b³êdów mo¿e byæ jednak fakt, ¿e metoda ta wykrywa DNA zarówno ¿ywych, jak i martwych patogenów. Z metod biologii molekularnej czêsto korzystaj¹ równie¿ onkolodzy. PCR w czasie rzeczywistym pozwala na wykrycie i ocenê ilociow¹ translokacji chromosomalnych lub transkryptów genów fuzyjnych w celu stwierdzenia minimalnej choroby resztkowej (minimum residual disease, MRD) lub progresji choroby. Technikê tê stosuje siê w celu wykrycia minimalnej choroby resztkowej u 212 pacjentów poprzez pomiar AML-1/MTG8 produktu genu fuzyjnego w ostrej bia³aczce szpikowej, wiele rearan¿acji produktów genu w ostrej bia³aczce limfoblastycznej, a tak¿e oceny odpowiedzi pacjenta na leczenie interferonem- alfa przez pomiar produktu genu fuzyjnego BCR-ABL w przewlek³ej bia³aczce szpikowej [25]. Metoda ta s³u¿y tak¿e do oceny liczby kopii DNA w nowotworach z³oliwych oraz analizy ekspresji genów w guzach litych przy u¿yciu tkanki pobranej za pomoc¹ biopsji ig³owej. Mo¿e to byæ istotne dla okrelenia skuteczniejszych metod leczniczych oraz lepszej stratyfikacji ryzyka nawrotu choroby. PCR w czasie rzeczywistym pomaga tak¿e w wyborze schematu leczenia przeciwnowotworowego w zale¿noci od typu stwierdzonych zaburzeñ genetycznych w komórkach nowotworowych. Przyk³adem jest rodzina genów koduj¹cych bia³ka opornoci na leki, MRP (ang. multidrug resistance-associated protein). Komórki nowotworowe, które wykazuj¹ ekspresjê tych genów potrafi¹ usuwaæ leki przeciwnowotworowe ze swojego wnêtrza. Ma to niekorzystny wp³yw na przebieg leczenia [8]. Omawiana metoda biologii molekularnej wykorzystywana jest równie¿ w testach wykrywaj¹cych mutacje, jak równie¿ polimorfizm, zw³aszcza polimorfizm zmian pojedynczego nukleotydu w okrelonym miejscu sekwencji DNA, SNP (ang. single -nucleotide polymorphism). Przyk³adem zastosowania PCR w czasie rzeczywistym jest wykrywanie mutacji genu CLN2, które wystêpuj¹ w zwyrodnieniowej chorobie uk³adu nerwowego, pónoniemowlêcej postaci ceroidolipofuscynozy [1,8]. PCR w czasie rzeczywistym z powodzeniem wykorzystywany jest równie¿ w badaniach nad lekami. Okrelana jest kinetyka ekspresji badanego genu w odpowiedzi na lek oraz odpowied transporterów lub enzymów metabolicznych zwi¹zanych z dystrybucj¹ lub wydalaniem. Za pomoc¹ tej metody oznaczeniom ilociowym poddawane s¹ np. dehydrogenaza dihydropyrimidynowa (DPD), reduktaza metylenotetrahydrofolanu (MTHFR), N-acetylotransferaza 2 (NAT2) i S-metylotransferaza tiopurynowa (TPMT) [2]. W chwili obecnej badania naukowe i diagnostyka laboratoryjna dysponuj¹ bardzo dok³adn¹ i czu³¹ metod¹, jak¹ jest PCR w czasie rzeczywistym. Niestety istniej¹ pewne problemy zwi¹zane z jej stosowaniem. Jednym z nich jest wysoki koszt aparatu i odczynników, co sprawia, ¿e w Polsce jej dostêpnoæ jest ograniczona. Wobec braku ujednoliconych zaleceñ, powa¿ny problem mo¿e stanowiæ niedostateczna dba³oæ i precyzja na którymkolwiek z etapów dowiadczenia: izolacji RNA, odwrotnej transkrypcji, walidacji, analizy danych oraz oceny wyników, co prowadzi do subiektywnych wyników, które nie odzwierciedlaj¹ biologicznej istotnoci. Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 4 Pimiennictwo 1. Bal J. (red.): Biologia molekularna w medycynie. Elementy genetyki klinicznej. Wyd. Nauk. PWN Wwa 2001. 2. Biuletyn informacyjny firmy Artus. 3. Bretagne S.: Molecular diagnostics in clinical parasitology and mycology: limits of the current polymerase chain reaction (PCR) assays interest of the realtime PCR assays. Clin Microbiol Infect 2003, 9, 505. 4. Bustin S.A., Benes V., Nolan T. et al.: Quantitative real-time RT-PCR - a perspective. J. Mol. Endocrinol. 2005, 34, 597. 5. Bustin S.A., Nolan T.: Pitfalls of Quantitative RealTime Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction. J. Biomol. Tech. 2004, 15, 155. 6. Bustin S.A.: Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J. Mol. Endocrinol. 2000, 25, 169. 7. Chen F.H., Samson K.T., Chen H. et al.: Clinical applications of real-time PCR for diagnostic and treatment of human cytomegalovirus infection in children. Pediatr Allergy Immunol, 2004, 15, 210. 8. Dembiñska-Kieæ A., Naskalski J.W. (red.): Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej. Urban & Partner Wroc³aw 2002. 9. Giulietti A., Overbergh L., Valckx D. et al.: An overview of real-time PCR: Applications to cytokine gene expression. Methods, 2001, 25, 386. 10. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S. et al.: Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology, 1992, 10, 413. 11. Higuchi R., Fockler C., Dollinger G. et al.: Kinetic PCR: Real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993, 11, 1026. 12. Kozak-Ciêszczyk M.: Diagnostyka molekularna w parazytologii. Kosmos. Problemy Nauk Biologicznych, 2005, 54(1/266), 49. 13. Kubista M., Andrade J.M., Bengtsson M. et al.: The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med, 2006, 27(2-3), 95. 14. Larinov A., Krause A., Miller W.: A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics 2005, 6, 62. 15. Livak K.J., Schmittgen T.D.: Analysis of relative gene expression data using real-time PCR and the 2 (-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001, 25, 402. 16. Mackay I.M., Arden K.E., Nitsche A.: Real-Time PCR in virology, Nucleic Acids Res. 2002, 30, 1292. 17. Mackay I.M.: Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin Microbiol Infect, 2004, 10, 190. 18. Moghaddam A., Reinton N., Dalgard O.: A rapid real - time PCR assay for determination of hepatitis C virus genotypes 1, 2 and 3a. J. Viral. Hepat. 2006, 13, 222. 19. Najioullah F., Thouvenot D., Lina B.: Development of real-time PCR procedure including an internal control for the measurement of HCMV viral load. J. Virol. Methods 2001, 92, 55. 20. Niesters H.G.M., van Esser J., Fries E. et al.: Development of real-time quantitative assay for detection of Epstein-Barr Virus. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 712. 21. Nitsche A., Steuer N., Schmidt C.A. et al.: Detection of Human Cytomegalovirus DNA by real-time quantitative PCR. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 2734. 22. Ryan J.L., Fan H., Glaser S.L. et al.: Epstein-Barr Virus Quantitation by Real-Time PCR Targeting Multiple Gene Segments. J. Mol. Diagn. 2004, 6, 378. 23. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F. et al.: Enzymatic amplification of ß-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985, 230, 1350. 24. Tanaka N., Kimura H., Saito Y. et al.: Quantitative analysis of cytomegalovirus load using real-time PCR assay. J. Med. Virol. 2000, 60, 455. 25. Valasek M.A., Repa J.J.: The power of real-time PCR. Advan. Physiol. Edu. 2005, 29, 151. 26. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F. et al.: Accurate normalization of real-time quantitative RTPCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology 2002, 3, 0034.1. A. Wycza³kowska-Tomasik i wsp.
