Molekularne metody diagnostyki zakażenia wirusem B19 u ciężarnych
advertisement
Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia, tom 2, zeszyt 3, 212-214, 2009 Molekularne metody diagnostyki zakażenia parvowirusem B19 u ciężarnych EWA BROJER, PIOTR GRABARCZYK, ALEKSANDRA KALIŃSKA, MARIA MIKULSKA Streszczenie Parvowirus B19 (B19V) występuje powszechnie, jednak zakażenie w trakcie ciąży może być przyczyną poważnych komplikacji, takich jak nieimmunologiczny obrzęk płodu, obumarcie płodu czy poronienie. W pracy przedstawiono aktualne poglądy dotyczące stosowania metod molekularnych w diagnostyce B19V. Szczególną uwagę zwrócono na trudności w wykrywaniu polimorficznych form wirusa. Słowa kluczowe: parvowirus B19, diagnostyka, real-time PCR, sekwencjonowanie Parwowirus B 19 (B19V) powoduje częste zakażenia, szczególnie wiosną i latem. Na ogół ich przebieg jest łagodny lub bezobjawowy. U dzieci zakażeniu może towarzyszyć rumień zakaźny. Zakażenie może mieć charakter epidemii szerzących się zwłaszcza wśród dzieci, np. w przedszkolach i żłobkach. Obserwuje się takie epidemie co około 4 lata. B19V ma cytotoksyczny wpływ na komórki progenitorowe linii czerwonokrwinkowej (erytroblasty i megakariocyty). Z tego powodu u niektórych osób zakażenie może prowadzić do poważnych powikłań. Do grup ryzyka należą kobiety w ciąży, chorzy ze zwiększoną erytropoezą, osoby z osłabioną odpornością – zakażone HIV, otrzymujące chemioterapię lub leki immunosupresyjne. Wirus przenosi się przede wszystkim drogą kropelkową – na zakażenie są więc szczególnie narażone kobiety przebywające z małymi dziećmi – ich matki, opiekunki, pracownicy szkół i przedszkoli. B19V przenosi się też przez krew oraz z matki na płód. Częstość przeciwciał wzrasta z wiekiem, od 2-15% u dzieci do 30-60% u dorosłych. Około 30-40% kobiet w wieku rozrodczym nie ma przeciwciał – prawdopodobieństwo, że ulegną zakażeniu B19V w trakcie ciąży szacuje się na 1-2%, a w czasie epidemii może ono sięgać nawet 10%. Ryzyko transmisji na płód ocenia się na około 30-50%, a ryzyko choroby płodu na około 4%. W Polsce serologiczne markery B19V u kobiet ciężarnych badane były przez Marciniak i wsp, 2008. Wśród 1800 kobiet przeciwciała IgG wykryto u 35%, a IgM u 13,5%. Spośród tych ostatnich 18% kobiet urodziło dzieci z wodogłowiem lub powiększeniem komór mózgu, u 8,5% płodów stwierdzono nieimmunologiczny obrzęk, a obumarcie płodu u 4,5%. Autorzy postulują powszechne badania przeciwciał. Przeciwciała do B19V stanowią bardzo ważny marker diagnostyczny zakażenia, ale co należy podkreślić, przede wszystkim mają charakter neutralizujący i odgrywają istotną rolę w ograniczaniu zakażenia B19V. Jeśli matka ma przeciwciała przed poczęciem, to nie przenosi zakażenia na płód. Przeciwciała chronią przed ponownym zakaże- Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa niem; szacuje się, że przeciwciała > 6IU/ml spełniają funkcję ochronną. Dzieci z anemią sierpowatą, które miały przejściową kryzę aplastyczną nie mają kolejnych epizodów choroby, a u osób immunokompetentnych pojawienie się przeciwciał koreluje z zanikiem/ograniczaniem wiremii. Do przewlekłej infekcji dochodzi, gdy obserwowany jest brak przeciwciał (zwłaszcza do VP1) lub ich niskie stężenie. Z punktu widzenia diagnostycznego badanie przeciwciał do B19V ma duże ograniczenia. W „okienku serologicznym” – nie wykrywamy przeciwciał, mimo że zakażenie się rozwija i wirus jest obecny w organizmie (obecne i wykrywalne jest jego DNA). Przeciwciała IgM pojawiają się po ok. 7-10 dniach od zakażenia. Są więc na ogół markerem wczesnej jego fazy. Wiadomo jednak, że czasami bardzo długo się utrzymują. Ich wykrycie może więc oznaczać, że kobieta przeszła zakażenie przed poczęciem dziecka i płód jest bezpieczny. Dodatkowo należy podkreślić duże rozbieżności w wynikach testów serologicznych różnych producentów. Tylko jeden test, charakteryzujący się czułością na poziomie 89,1% i swoistością 99,4%, został dotychczas zaaprobowany przez FDA. Jak dotąd brak jest międzynarodowego standardu dla IgM. Należy pamiętać, że wykrycie IgG anty-B19V nie różnicuje aktualnie toczącej się i przebytej infekcji, a wyniki badania są nieinformatywne u osób z immunosupresją. Czułym i nowoczesnym narzędziem do wykrywania aktualnego zakażenia i badań dróg zakażenia są natomiast metody molekularne. Pierwszą techniką, używaną obecnie coraz rzadziej, była hybrydyzacja z sondami komplementarnymi do DNA wirusa. Obecnie zastąpiona jest przez techniki amplifikacji DNA. Umożliwiają one wykrycie pojedynczych kopii wirusa w różnym materiale (we krwi, surowicy, w materiale biopsyjnym). Najczęściej stosowana jest metoda PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy). W klasycznej postaci jest to metoda jakościowa, a w nowocześniejszej wersji, obecnie coraz powszechniej używanej ma charakter metody ilościowej (technika tzw. real time PCR). Obecnie podejmowane są próby ustalenia znaczenia kli- Molekularne metody diagnostyki zakażenia parwowirusem B19 u ciężarnych nicznego poziomu wiremii. Coraz bardziej powszechnie dostępne technik sekwencjonowania pozwalają analizować sekwencje genomu wirusa i umożliwiają prowadzenie dochodzeń epidemiologicznych, a także poznawania nowych genotypów wirusa. Do niedawna uznawano dwa „dogmaty” dotyczące zakażenia B19V: 1) zakażenie nie przewleka się oraz 2) genom wirusa cechuje się bardzo niskim stopniem polimorfizmu. Wprowadzenie do badań czułych technik molekularnych podważyło oba te dogmaty. Badania osób, które przeszły zakażenie, wykazują, że ostre zakażenie cechuje się bardzo wysoką wiremią (DNA-emią) dochodzącą do 1012 IU/ml, a po tym okresie poziom wiremii/DNA-emii spada, lecz może utrzymywać się na poziomie kilkuset – kilku tysięcy kopii w mililitrze nawet przez kilka lat. Utrzymywanie się wiremii obserwuje się przede wszystkim u osób z immunosupresją, lecz występuje ona też u zdrowych bezobjawowych nosicieli. W IHiT obserwowano zdrowego mężczyznę, u którego wiremia utrzymywała się przez ponad trzy lata. Przez większość tego okresu poziom DNA-emii wahał się od 7×102 do 8,4×103 IU/ml, a poziom przeciwciał anty-B19V IgG oscylował koło 200 IU/ml. Przez cały czas obserwacji nie stwierdzono żadnych objawów klinicznych (Hb, Ht, PLT, RBC, WBC, ALT w normie). Metody biologii molekularnej pozwoliły na odkrycie nowych wariantów B19V. Prototyp wirusa, odkryty przy okazji badań HBsAg w 1973 zaklasyfikowany został do genotypu 1. Genotyp 2 (A6) wykryto u pacjenta HIV (+) z przewlekłą anemią w 2002 roku, a jako genotyp 3 określono dwa izolaty: – V9 wykryty przez Nguyen i wsp. w 1999 u dziecka z anemią plastyczną oraz D91.1 opisany przez Servant i wsp. w 2002. Genotyp 1 występuje powszechnie na całym świecie; genotyp 2 wykryto w wielu krajach europejskich – Finlandii, Włoszech, Niemczech, Polsce, a także w Anglii oraz Brazylii, a genotyp 3 dotychczas identyfikowano w krajach afrykańskich (Ghana, RPA, Malawi), ale także w UK, Francji, Brazylii i w USA. Wkrótce po odkryciu nowych wariantów okazało się, że diagnostyka technikami biologii molekularnej napotyka istotne trudności. Zarówno dostępne molekularne testy komercyjne, jak i niektóre testy typu home made, nie wykrywają wariantów lub wykrywają je z mniejszą czułością. Testy obecnie stosowane w IHiT pozwalają wykryć wszystkie poznane warianty B19V. Genotyp 2 wykryto m.in. u chorej po przeszczepie nerki, u której obserwowano przejściową aplazję układu czerwonokrwinkowego w wyniku zakażenia B19V w czasie stosowania leczenia immunosupresyjnego. Po złagodzeniu immunosupresji uzyskano normalizację wyników i ustąpienie anemii. Wiremię B19V obserwowano u tej chorej przez ponad 5 lat. W trakcie tego okresu kobieta zaszła w ciążę, która przebiegała bez powikłań i ostatecznie urodzone dziecko było całkowicie zdrowe. W tym przypadku kobieta zaraziła się B19V przed poczęciem i miała przeciwciała skierowane do wirusa. 213 Obecnie stosowane metody molekularne pozwalają ilościowo badać DNA-emię B19V i monitorować przebieg zakażenia. Jest to też pomocne w rozróżnieniu zakażeń „istotnych i nieistotnych klinicznie”. U omawianej kobiety w okresie ciąży poziom DNA-emii nie przekraczał tysiąca IU/ml. Z naszych obserwacji prowadzonych od kilku lat wynika, że w przypadku diagnostyki B19V u chorych z anemią, aplazją czerwonokrwinkową, a także u zakażonych kobiet ciężarnych z obrzękiem nieimmunologicznym, jak i po poronieniu, poziom wiremii jest wysoki i zazwyczaj przekracza kilka tysięcy IU/ml. U osób immunokompetentnych w fazie ostrego zakażenia wykrywanemu DNA B19V towarzyszą przeciwciała: na ogół klasy IgM, ale niejednokrotnie tylko IgG. W takich przypadkach badanie DNA wirusa umożliwia odróżnienie zakażenia aktualnego od przebytego. Na podkreślenie zasługuje też zastosowanie diagnostyki zakażeń B19V u cieżarnych, które są eksponowane na zakażenie B19V. Coraz częściej takim kobietom, które są matkami dzieci z objawami zakażenia B19V (np. rumień zakaźny) lub które pracują w placówkach oświatowych, gdzie wystąpiły przypadki infekcji B19V, zalecane jest wykonanie badań serologicznych i DNA wirusa. W przypadku braku markerów zakażenia, zalecana jest izolacja takiej ciężarnej, w przypadku wystąpienia markerów wskazujących na aktualne zakażenie powinno się wnikliwie monitorować stan płodu w USG oraz powtarzać badania markerów zakażenia. Istotne z punktu widzenia poznawczego jest analizowanie polimorfizmu sekwencji genomu wirusa metodą sekwencjonowania. W ten sposób odkrywane są nowe warianty, ustalana jest ich epidemiologia, a w konsekwencji takich badań modyfikowane są testy diagnostyczne, tak by wszystkie poznane warianty były wykrywane. Jednocześnie dzięki sekwencjonowaniu możliwe jest ustalanie dróg zakażenia w konkretnych przypadkach klinicznych; np. udowodnienie przeniesienia zakażenia z matki na płód. Reasumując, metody biologii molekularnej pozwalają na potwierdzenie zakażenia i są nieodzowne do nowoczesnej diagnostyki zakażenia B19V. Warunkami koniecznymi dla ich przydatności jest, by były wykonane odpowiednio standaryzowanymi testami wykrywającymi różne genotypy, najlepiej metodą ilościową. Ze względu na wysoki poziom wiremii w zakażeniu B19V szczególnie istotne jest zastosowanie procedur ograniczających możliwość kontaminacji. Badanie należy wykonywać z materiału pobranego w odpowiedni sposób, by ograniczyć możliwość kontaminacji w fazie przedanalitycznej. Krew należy pobierać do probówek jednorazowych, próżniowych z żelem separującym, w których bez otwierania probówki laboratorium szpitalne, poprzez wirowanie w odpowiednich warunkach oddziela osocze od elementów komórkowych. Probówka jest transportowana do pracowni biologii molekularnej, gdzie rygorystycznie przes- 214 E. Brojer, P. Grabarczyk, A. Kalińska, M. Mikulska trzegane są wszelkie procedury zabezpieczające przed kontaminacją i dozwolone jest otwarcie probówki po raz pierwszy. Dla możliwie pełnej interpretacji badań molekularnych potrzebna jest też równoległa analiza markerów serologicznych i wywiadu o możliwości/czasie zakażenia. Istotną zaletą metod molekularnych jest możliwość udowodnienia przeniesienia zakażenia przez sekwencjonowanie. [3] Heegaard E.D., Brown K.E. (2002) Human parvovirus B19. Clinical Microbiology Reviews 15: 485-505. [4] Marcinek P., Nowakowska D., Szaflik K. et al. (2008) Analysis of complications during pregnancy in women with serological features of acute toxoplasmosis or acute parvovirosis. Ginekologia Polska 79 (3): 186-91. [5] Parsyan A., Candotti D. (2007) Human erythrovirus B19 and transfusion – an update. Transfusion Medicine 17: 263-78. [6] Tolfvenstam T., Papadogiannakis N., Norbeck O. et al. (2001) Fraquency of human parvovirus B19 infection in intrauterine fetal death. Lancet 357: 1494-7. Piśmiennictwo [1] Baylis S.A., Fryer J.F, Grabarczyk P. (2007) Effects of probe binding mutations in an assay designed to detect parvovirus B19: implications for the quantification of different virus genotypes. Journal of Virological Methods 139 (1): 97-9. [2] Enders M., Schalasta G., Baisch C. et al. (2006) Human parvovirus B19 infection during pregnancy – Value of modern molecular and serological diagnostics. Journal of Clinical Vi- J Pracownia Biologii Molekularnej IHiT Pracownia Serologii Wirusów 00-957 Warszawa, ul. Chocimska 5 e-mail: [email protected] e-mail: [email protected] rology 35: 400-6. Molecular diagnostics of parvovirus B19 during pregnancy Parvovirus B19 (B19V) is a common infection, that can cause serious complications during pregnancy such as hydrops fetalis, fetal death or abortion. Current opinions regarding B19V molecular diagnostics are presented. Special attention was paid to difficulties in variants detection. Key words: parvovirus B19, diagnostics, real-time PCR, sequencing
