zastosowanie multipleks pcr do identyfikacji szczepów mrsa i mrcns

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 301 - 309
Anna Budzyńska, Agnieszka Kaczmarek, Eugenia Gospodarek
1
ZASTOSOWANIE MULTIPLEKS PCR DO IDENTYFIKACJI
SZCZEPÓW MRSA I MRCNS W PODŁOŻU STOSOWANYM
W AUTOMATYCZNYM SYSTEMIE DO POSIEWU KRWI
Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera
w Bydgoszczy, Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu
Kierownik: dr hab. E. Gospodarek, prof. UMK
Wykrywanie techniką PCR patogenów obecnych w dodatnich posiewach
krwi systemu BACTEC lub BacT/Alert sprawia wiele trudności ze względu
na obecność licznych inhibitorów amplifikacji. Celem niniejszej pracy było
opracowanie skutecznej metody umożliwiającej szybkie wykrycie gronkowców w tego rodzaju próbkach i jednoczesne określenie ich oporności
na meticylinę.
Rozprzestrzenianie się meticylinoopornych szczepów Staphylococcus aureus (ang.
methicillin-resistant S. aureus, MRSA) i gronkowców koagulazo–ujemnych (ang. methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci, MRCNS) stanowi poważny problem
terapeutyczny i epidemiologiczny (6, 9, 13). Drobnoustroje te niejednokrotnie wykazują
oporność również na inne antybiotyki tj. makrolidy, tetracykliny, linkosamidy i aminoglikozydy. Szczepy MRSA oraz MRCNS to jedne z częstszych etiologicznych czynników
zakażeń i zgonów u chorych z bakteriemią. Stąd, istotne jest, aby w jak najkrótszym czasie
móc zidentyfikować izolowany z badanego materiału szczep do gatunku S. aureus lub do
mniej patogennej grupy CNS oraz uzyskać wynik oporności na meticylinę (6, 9, 13). Przed
podjęciem decyzji terapeutycznych należy wziąć pod uwagę istniejące ryzyko kontaminacji
podczas pobierania próbki krwi gronkowcami stanowiącymi naturalną mikroflorę skóry.
Dlatego odróżnienie CNS od S. aureus ma istotne znaczenie w postępowaniu terapeutycznym (13).
Dotychczas stosowane konwencjonalne metody identyfikacji gronkowców we krwi są
czasochłonne ze względu na konieczność prowadzenia wstępnej hodowli, np. w automatycznym systemie do posiewu krwi BACTEC (Becton Dickinson) czy BacT/Alert (Biomérieux),
a następnie hodowli na podłożach stałych, wykonania testów biochemicznych i oznaczenia lekooporności (6, 14). Mimo, iż hodowla uważana jest nadal za metodę referencyjną,
zastosowanie metod diagnostycznych opartych na biologii molekularnej, takich jak PCR,
1
Praca sfinansowana przez Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu w ramach grantu
UMK nr 15/2008.
302
A. Budzyńska, A. Kaczmarek, E. Gospodarek
Nr 4
pozwala zwiększyć czułość i ograniczyć czas konieczny do identyfikacji gronkowców we
krwi. Skrócenie czasu identyfikacji etiologicznego czynnika zakażenia umożliwia ograniczenie stosowania antybiotyków o szerokim zakresie działania, co z kolei zmniejsza ryzyko
pojawiania się szczepów wielolekoopornych (9, 16).
Celem pracy było określenie przydatności stosowania metody multipleks PCR do
identyfikacji meticylinowrażliwych i meticylinoopornych szczepów S. aureus i CNS
oraz sprawdzenie, czy wybór metody izolacji DNA gronkowców z podłoża stosowanego
w automatycznym systemie do posiewu krwi BACTEC, z dodatkiem krwi ludzkiej może
wpływać na wynik amplifikacji.
MATERIAŁ I METODY
M ateriał kliniczny. Badaniem objęto 20 szczepów S. aureus i 20 szczepów CNS
izolowanych z krwi pobranej od chorych leczonych w klinikach i poradniach przyklinicznych
Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy. W identyfikacji szczepów
wykorzystywano ocenę koagulazy związanej i wolnej oraz testy ID 32 STAPH (bioMérieux).
Wrażliwość na meticylinę oznaczono metodą krążkowo-dyfuzyjną według Kirby-Bauera
zgodnie z rekomendacjami Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) (5) i Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2).
Izolacja DNA chromosomalnego. Bakteryjne DNA izolowano z 500 μl zawiesiny
drobnoustrojów w bulionie tryptozowo-sojowym (TSB) (Becton Dickinson) o gęstości 0,5
w skali McFarlanda, a w dalszym etapie badań z 500 μl zawiesiny tych samych szczepów
bakterii w podłożu Standard aerobic systemu BACTEC, o gęstości 0,5 McFarlanda, zawierającym 10 ml pełnej krwi ludzkiej. Izolację DNA prowadzono stosując zestaw High Template
Preparation Kit (Roche) zgodnie z zaleceniami producenta, metodę wykorzystującą do lizy
Triton X-100 i lizostafinę (9) oraz metodę opartą na lizie alkalicznej (15).
Amplifikacja DNA. W reakcji multipleks PCR stosowano startery kodujące fragment
genu 16S rRNA specyficznego dla gronkowców zaliczanych do rodzaju Staphylococcus,
genu clfA swoistego dla drobnoustrojów z gatunku S. aureus oraz genu mecA, kodującego
oporność na meticylinę. Startery zostały zsyntetyzowane przez Pracownię Sekwencjonowania DNA IBB PAN i charakteryzowały się następującą kolejnością nukleotydów (13):
clfA 5’ - GCA AAA TCC AGC ACA ACA GGA AAC GA – 3’, clfA 5’ - CTT GAT CTC
CAG CCA TAA TTG GTG G – 3’, mecA 5’ - TCC AGG AAT GCA GAA AGA CCA AAG
C – 3’, mecA 5’ - GAC ACG ATA GCC ATC TTC ATG TTG G – 3’, 16S rRNA 5’ - CCT
ATA AGA CTG GGA TAA CTT CGG G – 3’, 16S rRNA 5’ - CTT TGA GTT TCA ACC
TTG CGG TCG – 3’.
Reakcję optymalizowano przy użyciu DNA izolowanym przy użyciu zestawu High
Template Preparation Kit z hodowli w podłożu TSB szczepu kontrolnego S. aureus ATTC
43300 MRSA. Stanowiło ono w dalszych etapach badań kontrolę dodatnią wszystkich analizowanych genów. W skład każdej próbki mieszaniny reakcyjnej wchodził: bufor inkubacyjny
1x, 2,0 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, sześć starterów, każdego w stężeniu 0,1 μM, 2,5 U
polimerazy termostabilnej GoTaq (Promega), 200 ng BSA (ang. Bovine Serum Albumine)
(Roche) oraz 5,0 μl izolowanego DNA. Kontrolę ujemną PCR stanowiła mieszanina reakcyjna z wodą zamiast DNA. Amplifikację prowadzono w objętości 25 μl w termocyklerze
Nr 4
303
PCR w identyfikacji MRSA i MRCNS
GeneAmp® PCR System 2700 (Applied Biosystems), zachowując następujące warunki
reakcji: początkowa denaturacja w temp. 94°C przez 3 minuty, a następnie 40 cykli o profilu:
denaturacja w temp. 94°C przez 30 sekund, przyłączanie starterów w temp. 53°C przez 30
sekund, synteza nici DNA w temp. 62°C przez minutę oraz końcowe wydłużanie nici przez
7 minut w temperaturze 72°C.
Obecność zamplifikowanych fragmentów sprawdzano wykonując rozdział elektroforetyczny w 1,5% żelu agarozowym (Sigma) wybarwionym bromkiem etydyny (10 mg/ml).
Elektroforezę prowadzono w buforze 1xTBE (BioRad) w obecności wzorca wielkości GeneRulerTM100bp (Fermentas). Wyniki dokumentowano w świetle UV za pomocą systemu
GelDoc 2000 (BioRad).
WYNIKI
W pierwszym etapie badań oceniano zastosowanie techniki multipleks PCR w identyfikacji meticylinowrażliwych i meticylinoopornych gronkowców izolowanych z zawiesiny drobnoustrojów w TSB każdą z wymienionych metod ekstrakcji DNA. O wykryciu
drobnoustrojów z rodzaju Staphylococcus świadczyła obecność produktu reakcji PCR
o wielkości 791 par zasad, o identyfikacji szczepu S. aureus - drobnoustrojów z 638 par
zasad, a o oporności na meticylinę - produkt o wielkości 499 par zasad (Ryc. 1). W tabeli I
przedstawiono wyniki klasycznej i molekularnej metody wykrywania drobnoustrojów z rodzaju Staphylococcus i identyfikacji gronkowców zaliczanych do gatunku S. aureus oraz
oznaczania meticylinooporności metodą krążkowo-dyfuzyjną i techniką PCR. Zgodność
wyników porównywanych metod dotyczyła 100% badanych szczepów. Prawidłowe wyniki amplifikacji uzyskano dla DNA po ekstrakcji każdą z trzech wymienionych wcześniej
metod.
W drugim etapie badań określano możliwość zastosowania w reakcji PCR materiału
genetycznego izolowanego przy użyciu każdej z metod z zawiesiny w podłożu Standard
(+)
16S rRNA
clfA
mecA
Ryc. 1. 2
3
4
5
6
7
8
9
10
(-)
M
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
Elektroforegram produktów amplifikacji regionu 16S rRNA (791 par zasad), genu clfA
(638 par zasad) i genu mecA (499 par zasad). Ścieżki 2-10 – badane próby (2 – MRSA; 3-4
– MSSA; 5-7 – MRCNS; 8-10 – MSCNS); (+) – kontrola dodatnia; (-) – kontrola ujemna;
M – wzorzec wielkości DNA GeneRuler 100bp (Fermentas).
304
Nr 4
A. Budzyńska, A. Kaczmarek, E. Gospodarek
Tabela I. Porównanie fenotypowej i genotypowej metody wykrywania drobnoustrojów
z rodzaju Staphylococcus, identyfikacji gronkowców S. aureus oraz określania
meticylinooporności metodą krążkowo-dyfuzyjną i techniką PCR.
Obecność
Obecność
Liczba Wynik testu
koagulazy Obecność
Gatunek
genu 16S
szczepów na katalazę
związanej genu clfA
rRNA
(CF)
S. aureus
CNS
4
4
6
6
S. aureus
1
ATTC
43300
S – wrażliwy, R - oporny
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
Metoda
krążkowo- Obecność
dyfuzyjna z
genu
cefoksytyną
mecA
(30µg)
S
R
+
S
R
+
R
+
Tabela II. Porównanie skuteczności trzech metod izolacji DNA gronkowców z TSB i podłoża stosowanego w automatycznym systemie do posiewu krwi BACTEC z dodatkiem krwi ludzkiej.
Obecność produktów amplifikacji DNA
izolowanego z zawiesiny bakterii
Metoda izolacji
Liczba szczepów
w podłożu Standard aerobic
w TSB
systemu Bactec z dodatkiem
pełnej krwi ludzkiej
4 MSSA
+
4 MRSA
+
High Template Preparation Kit
6 MSCNS
+
6 MRCNS
+
4 MSSA
+
+
4 MRSA
+
+
Z użyciem Triton X-100 i
lizostafiny
6 MSCNS
+
+
6 MRCNS
+
+
4 MSSA
+
+
4 MRSA
+
+
Oparta na lizie alkalicznej
6 MSCNS
+
6 MRCNS
+
-
aerobic systemu Bactec z dodatkiem pełnej krwi ludzkiej (Tabela II). W przypadku metody
izolacji z użyciem Triton X-100 i lizostafiny uzyskano prawidłowy profil amplifikacji dla
wszystkich badanych szczepów. Wykorzystując metodę izolacji opartą na lizie alkalicznej
dodatnie wyniki reakcji PCR uzyskano dla szczepów należących do gatunku S. aureus.
W przypadku próbek DNA izolowanych od CNS stwierdzono brak produktów amplifikacji.
Wyniki fałszywie ujemne otrzymano dla wszystkich próbek DNA izolowanych zestawem
Nr 4
PCR w identyfikacji MRSA i MRCNS
305
High Template Preparation Kit. Zastosowanie kontroli dodatniej reakcji PCR wykluczało
możliwość popełnienia błędu podczas nastawiania reakcji.
DYSKUSJA
Możliwość stosowania szybkiej i czułej techniki multipleks PCR do wykrywania
i różnicowania meticylinowrażliwych i meticylinoopornych gronkowców odgrywa duże
znaczenie w dobie narastania oporności na antybiotyki betalaktamowe. Standardowe metody
mikrobiologiczne umożliwiają identyfikację tych drobnoustrojów w dodatnim posiewie
krwi w ciągu 24-48 godzin, podczas gdy reakcja amplifikacji skraca ten czas do około 4-6
godzin i pozwala jednocześnie uzyskać informację dotyczącą oporności na meticylinę na
podstawie obecności genu mecA w materiale genetycznym wykrytych bakterii.
Wielu autorów opisuje wykorzystanie techniki PCR do identyfikacji drobnoustrojów
z rodzaju Staphylococcus i oceny ich meticylinooporności (6, 9, 10, 17, 19). Większość protokołów skierowana jest na wykrycie S. aureus na podstawie obecności genów kodujących
nukleazę (nuc) lub koagulazę (coa) bez możliwości potwierdzenia zakażenia, którego czynnikiem etiologicznym są CNS. Wykorzystanie starterów komplementarnych do fragmentu
drugiego z wymienionych genów niesie ze sobą ryzyko pojawienia się błędów podczas
amplifikacji i/lub interpretacji wyniku, ponieważ badania wykazały polimorfizm genu coa
(4, 18). Maes i wsp. (10) w reakcji tripleks PCR wykrywali gen 16S rRNA specyficzny dla
rodzaju Staphylococcus, gen nuc oraz mecA. Pierwszy z wymienionych genów wykryto
u wszystkich badanych szczepów gronkowców, z wyjątkiem gatunku S. sciuri, u którego
w przypadku jednego spośród trzech badanych szczepów uzyskano również wynik fałszywie
ujemny dotyczący oporności na meticylinę. Może to wskazywać na różnice w genomie na
odcinku sekwencji docelowej S. sciuri i konieczność zaprojektowania nowych starterów.
Vannuffel i wsp. (19) do tego samego celu zastosowali reakcję multipleks PCR z użyciem
starterów flankujących oprócz sekwencji genu mecA, gen femA, swoisty dla S. aureus
oraz region IS431 występujący w dużej liczbie kopii w genomie wyłącznie gronkowców.
Późniejsze badania (8) wykazały brak sekwencji inercyjnej IS431 u dużego odsetka (80%)
szczepów MSSA, co wyklucza stosowanie jej jako markera zakażeń gronkowcowych. Jaffe
i wsp. (6) skupili się na wykrywaniu obecności bakterii w badanej próbce materiału, rozpoznaniu drobnoustrojów z rodzaju Staphylococcus i określeniu ich meticylinooporności,
bez identyfikacji gronkowców zaliczanych do gatunku S. aureus, które mają dla klinicysty
istotne znaczenie. Wykorzystanie zaproponowanych starterów znacznie ogranicza dodatkowo
fakt, że amplifikacja genów kodujących poszczególne cechy dokonywana była oddzielnie.
Louie i wsp. (9) na podstawie obecności lub braku genów nuc, mecA oraz bakteryjnego
16S rRNA, stanowiącego wewnętrzną kontrolę reakcji PCR, prawidłowo identyfikowali
gatunek S. aureus i określali lekowrażliwość wszystkich szczepów gronkowców obecnych
w badanych próbkach materiału. Brak starterów amplifikujących fragment DNA swoisty dla
rodzaju Staphylococcus uniemożliwił jednak odróżnienie MSCNS od innych bakterii.
W badaniach własnych do identyfikacji S. aureus wybrano startery komplementarne do
fragmentu genu clfA, kodującego czynnik clumping factor A, białko wiążące fibrynogen,
obecne wyłącznie u tego gatunku. Amplifikacja konserwatywnego wśród gronkowców
z rodzaju Staphylococcus i unikalnego dla tego rodzaju regionu 16S rRNA umożliwiała
306
A. Budzyńska, A. Kaczmarek, E. Gospodarek
Nr 4
wykrywanie CNS, a odcinka genu mecA – rozpoznanie szczepów opornych na meticylinę.
Zastosowanie reakcji multipleks PCR pozwoliło skrócić czas oczekiwania na wynik do około
6 godzin. Specyficzność w niniejszej pracy została oceniona na 100%. Prawidłowe wyniki
amplifikacji uzyskali również Schmitz i wsp. (17), którzy wykorzystali w reakcji multipleks
PCR 4 pary starterów komplementarnych do sekwencji flankujących fragmenty genów: specyficzny dla gronkowców 16S rRNA, coa, mecA oraz konserwatywny region bakteryjnego
16S rRNA. Badania prowadzone na 686 szczepach gronkowców i 100 szczepach bakterii
należących do innych rodzajów, wykazały 100% korelacji pomiędzy metodą molekularną
a fenotypową, z wyjątkiem danych dotyczących obecności genu mecA, które dały odmienne
wyniki dla 10 szczepów. Metodę amplifikacji fragmentu genu kodującego białko PBP-2a
uważa się jednak za „złoty standard” ze względu na trudności w wykrywaniu szczepów
meticylinoopornych wynikające z heterogennej natury tej oporności (6). Mimo, że w badaniach własnych nie stwierdzono niezgodności metody fenotypowej i genotypowej, należy
uwzględnić możliwość pojawienia się niskiego odsetka szczepów opornych na antybiotyki
beta-laktamowe, u których dochodzi do nadprodukcji beta-laktamaz, niezwiązanej z wytwarzaniem białka PBP-2a. Badanie genetyczne ukierunkowane wyłącznie na wykrywanie
genu mecA nie umożliwia detekcji tego typu mechanizmu oporności i w związku z tym nie
jest wystarczającym dowodem wrażliwości badanego szczepu na beta-laktamy.
Jedną z ważniejszych przyczyn niepowodzeń w wykorzystaniu techniki PCR do identyfikacji drobnoustrojów w dodatnich próbkach sygnalizowanych przez automatyczny system do
hodowli drobnoustrojów z krwi jest wybór niewłaściwej metody izolacji bakteryjnego DNA.
W próbce krwi obecne są inhibitory amplifikacji, takie jak związki hemu i DNA leukocytów
(1), które powinny być zinaktywowane lub usunięte z pobranego materiału. Standardowe
techniki oczyszczania DNA nie umożliwiają usunięcia inhibitorów reakcji PCR, takich jak
polianetosulfonian sodowy (SPS), antykoagulant dodawany do podłoży namnażających. Ze
względu na podobieństwo chemiczne tego związku z DNA (rozpuszczalność w wodzie i nierozpuszczalność w alkoholach) w wyniku działania mieszaniny fenol-chloroform oczyszcza
się wraz z kwasem nukleinowym. Dlatego opracowuje się szereg metod mających na celu
pozbawienie próbki wpływu inhibicyjnego tej substancji (3, 15, 16).
Jaffe i wsp. (6) porównywali dwie techniki izolacji bakteryjnego DNA z dodatnich
hodowli krwi sygnalizowanych w systemie BACTEC: z użyciem kulek szklanych i Chelex-100 oraz komercyjny zestaw QIAamp blood and tissue kit (QIAGEN). Obie metody
okazały się skuteczne, a podstawowe różnice dotyczyły, m.in. ich czułości i czasu trwania.
Pierwszą z wymienionych technik cechował krótki czas (około 20 min) niezbędny do
wyekstrahowania DNA, ale jednocześnie niska czułość (109 jtk/ml), nie zawsze osiągana
w czasie sygnalizowania wyniku dodatniego przez automatyczny system do posiewu krwi.
Louie i wsp. (9) wykorzystali prostą, szybką i tanią technikę ekstrakcji DNA gronkowców
z 236 dodatnich hodowli w podłożach stosowanych w systemie BacT/Alert. Badania własne
potwierdzają skuteczność zastosowanej przez badaczy metody izolacji, bowiem jako jedyna
spośród porównywanych, pozwoliła otrzymać DNA pozbawione inhibitorów reakcji PCR.
Amplifikacja wybranych genów po ekstrakcji DNA opartej na lizie alkalicznej możliwa była
tylko w przypadku S. aureus. Izolacja materiału genetycznego z zawiesiny o gęstości 0,5
w skali McFarlanda dla wszystkich badanych szczepów wyklucza fałszywie ujemne wyniki
spowodowane zbyt niskim inokulum. Natomiast technikę tę z powodzeniem zastosowali
Wellinghausen i wsp. (20) do identyfikacji, przy użyciu metody PCR w czasie rzeczywistym,
Nr 4
PCR w identyfikacji MRSA i MRCNS
307
patogenów będących najczęstszą przyczyną sepsy oraz Karahan i wsp. (7) do wykrywania
DNA bakterii lub grzybów techniką PCR w dodatnich posiewach krwi uzyskanych w systemach zarówno BacT/Alert, jak i BACTEC.
Millar i wsp. (15) ekstrahowali DNA jednego szczepu S. aureus z podłoża stosowanego
w systemie BacT/Alert z dodatkiem krwi ludzkiej. Spośród 10 porównywanych przez badaczy metod izolacji tylko wspomniana wyżej, wykorzystująca lizę alkaliczną dała dodatnie
wyniki. Istotne jest więc, aby podczas amplifikacji DNA izolowanego z hodowli z dodatkiem
krwi każdorazowo stosować kontrolę dodatnią reakcji PCR. Podobnie jak w niniejszej pracy,
autorzy ci udowodnili brak skuteczności zestawu High Template Preparation Kit. Może być
on jednak z powodzeniem wykorzystywany do izolacji DNA bezpośrednio z krwi, o czym
świadczą wcześniejsze doniesienia (11, 12). Na ich podstawie wnioskować można, że inhibitory reakcji PCR obecne w roztworze wyizolowanego tą techniką DNA pochodzą nie
z samej krwi, ale z podłoży stosowanych w systemach BacT/Alert, czy BACTEC.
WNIOSKI
1. Technika multipleks PCR jest dobrym narzędziem diagnostycznym umożliwiającym
szybką identyfikację meticylinowrażliwych i meticylinoopornych szczepów S. aureus
i CNS.
2. W przypadku dodatnich hodowli uzyskanych w automatycznym systemie do posiewu
krwi kluczową rolę odgrywa wybór właściwej metody izolacji DNA, który ma być
wykorzystany w dalszej analizie molekularnej.
A. B u d z y ń s k a , A . Ka c z m a re k, E . Gospoda rek
APPLICATION OF MULTIPLEX PCR FOR IDENTIFICATION OF MRSA AND MRCNS
STRAINS IN MEDIUM OF AUTOMATIC BLOOD CULTURE SYSTEM
SUMMARY
Rapid detection and identification of methicillin-resistant staphylococci in patient’s blood is essential for the prompt antimicrobial therapy of infection. Molecular-based diagnosis, in comparison to
conventional methods, allows to increase sensitivity and to reduce time necessary to achieve positive
results and also enable to test susceptibility. The aim of the study was the use of multiplex PCR to
detect region of the 16S rRNA that is unique to staphylococci, the S. aureus-specific clfA gene and
the mecA gene which is a determinant of methicillin resistance, in a medium of the BACTEC blood
culture system. Three different extraction methods were examined in order to ascertain the most suitable
method to isolate staphylococcal DNA. The only method which removed PCR inhibitors contained in
BACTEC blood culture material use Triton X-100 and lysostaphyin to lysis bacterial cells. The use
of High Template Preparation Kit failed to yield a positive result in all investigated probes. Third of
the methods, based on alkali lysis, resulted in DNA which could be amplified by PCR only in case of
S. aureus blood culture. The findings of our study suggest that not all DNA extraction methods are
appropriate because some of them may not remove potent amplification inhibitors found in blood and
medium of system BACTEC.
308
A. Budzyńska, A. Kaczmarek, E. Gospodarek
Nr 4
PIŚMIENNICTWO
1. Akane A, Matsubara K, Nakamura H i inni. Identification of the heme compound copurified with
deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction
(PCR) amplification. Forensic Sci. 1994; 39: 362-72.
2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standard for antimicrobial susceptibility testing; seventeenth informational supplement. Document M100-S17. Wayne, PA: CLSI
(2007).
3. Fredricks DN, Relman DA. Improved amplification of microbial DNA from blood cultures by
removal of the PCR inhibitor sodium polyanetholesulfonate. J Clin Microbiol 2003; 36: 28106.
4. Hookey JV, Richardson JF, Cookson BD. Molecular Typing of Staphylococcus aureus based on
PCR restriction fragment length polymorphism and DNA sequence analysis of the coagulase
gene. J Clin Microbiol 1998; 36: 1083-9.
5. Hryniewicz W, Sulikowska A., Szczypa K i inni. Rekomendacje doboru testów do oznaczania
wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki 2006 (ze zmianami wprowadzonymi w
2007 roku: http://www.korld.edu.pl/pdf/ZMIANY_REKOMENDACJI_11-2007.pdf).
6. Jaffe RI, Lane JD, Albury SV, Niemeyer DM. Rapid extraction from and direct identification in
clinical samples of methicillin-resistant staphylococci using the PCR. J Clin Microbiol 2000; 38:
3407-12.
7. Karahan ZC, Mumcuoglu I, Guriz H i inni. PCR evaluation of false-positive signals from two
automated blood-culture systems. J Med Microbiol 2006; 55: 53-7.
8. Kobayashi N, Alam M, Urasawa S. Analysis on distribution of insertion sequence IS431 in clinical
isolates of staphylococci. Diagn Microbiol Inf Dis 2001; 39: 61-4.
9. Louie L, Goodfellow J, Mathieu P i inni. Rapid detection of methicillin-resisttant staphylococci
from blood culture bottles by using a multiplex PCR assay. J Clin Microbiol 2002; 40: 278690.
10. Maes N, Magdalena J, Rottiers S i inni. Evaluation of a triplex PCR assay to discriminate Staphylococcus aureus from coagulase-negative staphylococci and determine methicillin resistance from
blood cultures. J Clin Microbiol 2002; 40: 1514-7.
11. Makhoul IR, Smolkin T, Sujov P i inni. PCR-based diagnosis of neonatal staphylococcal bacteremias. J Clin Microbiol 2005; 43: 4823-5.
12. Makhoul IR, Yacoub A, Smolkin T i inni. Values of C-reactive protein, procalcitonin, and Staphylococcus-specific PCR in neonatal late-onset sepsis. Acta Paediatr 2006; 95: 1218-23.
13. Mason WJ, Blevins JS, Beenken K i inni. Multiplex PCR protocol for the diagnosis of staphylococcal infection. J Clin Microbiol 2001; 39: 3332-8.
14. Mączyńska B, Przondo-Mordarska A. Diagnostyka mikrobiologiczna zakażeń uogólnionych.
Sepsis 2008; 1: 73-81.
15. Millar BC, Jiru X, Moore JE, Earle JAP. A simple and sensitive method to extract bacterial, yeast
and fungal DNA from blood culture material. J Microbiol Methods 2000; 42: 139-47.
16. Peters RPH, van Agtmael MA, Danner SA i inni. New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect Dis 2004; 4: 751-60.
17. Schmitz FJ, MacKenzie CR, Hofmann B i inni. Specific information concerning taxonomy, pathogenicity and methicillin resistance of staphylococci obtained by multiplex PCR. J Med Microbiol
1997; 46: 773-8.
18. Schwarzkopf A, Karch H. Genetic variation in Staphylococcus aureus coagulase gene: potential
and limits for use as epidemiological marker. J Clin Microbiol 1994; 32: 2407-12.
19. Vannuffel P, Gigi J, Ezzedine H i inni. Specific detection of methicillin-resistant Staphylococcus
species by multiplex PCR. J Clin Microbiol 1995; 33: 2864-7.
Nr 4
PCR w identyfikacji MRSA i MRCNS
309
20. Wellinghausen N, Wirths B, Franz AR i inni. Algorithm for the identification of bacterial pathogens in positive blood cultures by real-time LightCycler polymerase chain reaction (PCR) with
sequence-specific probes. Diagn Microbiol Inf Dis 2004; 48: 229-41.
Otrzymano: 18 XI 2009 r.
Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz, ul. M. Curie-Skłodowskiej 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii,
Collegium Medicum im. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet M. Kopernika
w Toruniu