instrukcja ITP - Politechnika Gdańska
advertisement
Izotachoforeza Materiały do ćwiczeń dr inŜ. Janusz Curyło, mgr inŜ. Tomasz Chmiel, mgr inŜ. Tomasz Dymerski, prof. dr hab. inŜ. Waldemar Wardencki Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska 2009 Izotachoforeza Etymologia słowa izotachoforeza słowo izotachoforeza pochodzi z języka greckiego: iso = równy, tachos = szybkość, phoresis = migracja Izotachoforeza zaliczana jest do analitycznych technik elektromigracyjnych, w których. ruch analizowanych cząsteczek wywołany jest przyłoŜonym zewnętrznym polem elektrycznym. Szybkość poruszania się jonów w polu elektrycznym (elektromigracja) jest wprost proporcjonalna do natęŜenia tego pola. Podstawowe róŜnice pomiędzy elektroforezą kapilarną (CE) a izotachoforezą (ITP) tkwią w sposobie realizacji rozdzielania substancji w polu elektrycznym. W CE stosowany jest jeden elektrolit (BGE) wypełniający cały układ analityczny. Elektrolit ten zawiera poza jonami dającymi sygnał linii podstawowej, substancje modyfikujące przepływ elektroosmotyczny jonów, pH roztworu oraz stabilizator siły jonowej. ITP wykorzystuje dwa róŜne układy buforowe. Próbkę umieszcza się pomiędzy elektrolitem wiodącym (LE - leading electrolyte) o większej ruchliwości od jonów próbki i terminującym (TE - terminating electrolyte) o mniejszej ruchliwości od jonów próbki. Izotachoforezą nazywamy proces rozdzielania jonów (kationów lub anionów), które w polu elektrycznym przy zastosowaniu odpowiedniego elektrolitu wiodącego i kończącego formują się w strefy według ich zmniejszającej się ruchliwości i poruszają z jednakową prędkością. Zasada izotachoforezy Podczas jednorazowej analizy techniką izotachoforezy mogą być rozdzielane tylko jony o tym samym znaku (kationy lub aniony). Elektrolit podstawowy dobiera się w taki sposób aby kation lub anion elektrolitu wiodącego (L) i terminującego(T) miał odpowiednio najwyŜszą i najniŜszą ruchliwość (µ) w stosunku do analitów (oznaczanych jonów). Tak więc wymogiem rozdzielania metodą izotachoforezy jest aby µ L>µ anality>µ T. W przypadku przeprowadzania izotachoforetycznego rozdzielania anionów postępuje się następująco: przestrzeń anodową i kapilarę napełnia się elektrolitem wiodącym, którego anion jest bardzo ruchliwy, kation zaś posiada duŜą pojemność buforową. Przestrzeń katodowa powinna zawierać elektrolit, którego anion ma efektywną ruchliwość duŜo niŜszą od ruchliwości wszystkich składników analizowanej próbki. Elektrolit nazywa się elektrolitem zatrzymującym, (terminującym), a jego jon terminatorem. Próbkę wprowadza się przez dozownik pomiędzy elektrolit wiodący i elektrolit terminujący. Następnie do elektrod przykłada się odpowiednie napięcie, w wyniku czego przepływa prąd. W układzie takim wprowadzone jony po niedługim czasie układają się w szereg sąsiadujących ze sobą stref wg malejącej ruchliwości, po czym całość wędruje z jednakową prędkością do odpowiedniej elektrody. Przebieg procesu rozdzielania przedstawia rysunek rys. 1. Górna część rysunku (a) przedstawia elektrolit wiodący (L), wprowadzoną próbkę (aniony A i B, dla których µ A>µ B) i elektrolit terminujący (T). Na odciętej odłoŜone jest połoŜenie wewnątrz kapilary, a na rzędnej – stęŜenia składników. Kolejne fragmenty rysunku obrazują stan rozdzielenia w następujących po sobie przedziałach czasowych. Fragment (b) przedstawia strefę elektrolitu wiodącego przesuwającą się przez kapilarę w kierunku przestrzeni anodowej. StęŜenie składnika B ustala się na wartość, która zgodnie z prawem Kohlrauscha odpowiada stęŜeniu elektrolitu wiodącego. µ B + µQ cA µA = ⋅ cB µ A + µQ µQ , gdzie µA, µB, µQ – odpowiednio ruchliwości jonów A-, B- i przeciwjonu Q+, cA, cB – odpowiednio stęŜenia jonów A-, B-. Trzecia część rysunku (c) obrazuje dalszy stan rozdzielenia. Strefa „czystego” składnika A znacznie się zwiększa i dalej powstaje strefa czystego składnika B o stęŜeniu odpowiadającym poprzedzającej strefie. W ostatnim etapie rozdzielania (d) ustala się stan równowagi stęŜeń jonów w poszczególnych strefach. W ten sposób kaŜdą strefę wewnątrz kapilary tworzy jeden rodzaj jonów, a stęŜenia w strefach pozostają w równowadze zarówno ze strefą poprzedzającą jak i ze strefą elektrolitu wiodącego. StęŜenie w strefie elektrolitu terminującego równieŜ powinno być stałe. W idealnych warunkach prowadzenia pomiaru (niezmienna średnica kapilary, stały poziom elektrolitu wiodącego) długości poszczególnych stref są juŜ dalej niezmienne. Strefy po osiągnięciu równowagi poruszają się ze stałą szybkością równą szybkości poruszania się strefy wiodącej i stąd nazwa izotachoforeza, czyli elektroforeza przy stałym poruszaniu się stref. Rys. 1. Hipotetyczny model rozdzielania dwóch jonów metodą izotachoforezy. W praktyce opisany proces bywa zakłócany. Dochodzi bowiem do przesuwania się stref, z dość zdawałoby się błahych powodów, np. zmian pH wskutek reakcji elektrodowych czy membranowych, zmian temperatury, przenikania CO2 przez teflonowe ścianki kapilary, elektroosmozy czy wskutek powstawania strumienia hydrodynamicznego. Ze względu na to, Ŝe wszystkie strefy posiadają róŜne efektywne ruchliwości jonów, w kaŜdej z nich wytwarza się własny gradient potencjału. Dzieję się tak, poniewaŜ zjawisko izotachoforezy opiera się na najbardziej podstawowym prawie mówiącym o przepływie ładunków przez dany ośrodek, a mianowicie na prawie Ohma. R= U , gdzie: I [Ω] , potencjałów) [V ], I – natęŜenie przepływu ładunków [A] R – opór elektryczny ośrodka przewodzącego U – napięcie elektryczne (róŜnica Proces izotachoforezy prowadzony jest przy stałym natęŜeniu ładunków elektrycznych, a kaŜda poruszająca się z jednakową prędkością strefa posiada charakterystyczny dla niej opór przenoszenia danych jonów, wynikający np. z róŜnej budowy przestrzennej. Ustala się wówczas jednakowa szybkość poruszania się stref zgodnie z zaleŜnością: ν = µ ⋅ E , gdzie: cm 2 cm ν – szybkość poruszania się strefy , µ – efektywna ruchliwość jonów w strefie , s V ⋅ s V E – natęŜęnie pola elektrycznego w strefie cm Rys.2. Model rozdzielania anionów (A, B, C,) metodą izotachoforezy, temperatura (T), natęŜenie pola elektrycznego (E) i opór w poszczególnych strefach (R), Q – przeciwjon. Gradient potencjału w kaŜdej pojedynczej strefie jest stały, ale wzrasta od jednej strefy do drugiej. Przyrost gradientu potencjału wynika ze zmniejszających się ruchliwości jonów w kolejnych strefach, zmniejszania się przewodnictwa tych stref (wzrostu oporu) oraz ze zmiany stęŜenia danego jonu w rozpatrywanej strefie (rys. 2). Granice wytworzonych stref są niezwykle ostre, a to z powodu efektu samokorygowania się układu izotachoforetycznego (rys. 3). JeŜeli wolniejszy jon A przeniknąłby do szybszej strefy L (tzn. o wyŜszej ruchliwości jonów) musiałby się w niej poruszać wolniej, gdyŜ w strefie tej spadek potencjału jest niŜszy niŜ w strefie A, więc ruchliwość jonu A musiałaby być wyŜsza niŜ jest faktycznie – i w tej sytuacji jon A automatycznie wraca do swojej strefy. Z drugiej strony, jeŜeli jon L dostałby się drogą dyfuzji do następującej po niej strefy A, byłby on przeniesiony do strefy L na skutek wyŜszego gradientu potencjału, jaki panuje w strefie A. Rys. 3. Efekt samokorygowania się układu izotachoforetycznego. Gdy w procesie analizy utrzymywany jest stały prąd, w wyniku istnienia róŜnych gradientów potencjału poszczególnych stref, wytwarzają się w nich róŜne temperatury. Strefy posiadające jony o wysokich ruchliwościach wytwarzają mniejsze ilości ciepła niŜ strefy o ruchliwościach niŜszych. PoniewaŜ następujące po sobie strefy porządkują się z ich zmniejszającymi się ruchliwościami, temperatura następujących po sobie stref wzrasta od jednej do drugiej strefy (rys. 2). Detekcja W technice izotachoforetycznej stosować moŜna zarówno detekcję bezkontaktową i kontaktową. Gdy do kapilary przyłoŜymy termoelement z odpowiednio cienkich drutów, ich zmiany sygnałów będą charakteryzowały poszczególne strefy. ZróŜniczkowanie tych sygnałów pozwala określić granice stref. Wysokość fali (h) podaje informację o rodzaju jonów, a długość strefy (L) mówi o ilości jonu zawartej w próbce (rys. 5). Jest to tzw. bezkontaktowy sposób detekcji. Detekcja taka jest uniwersalna, ale mało selektywna. Czułość detekcji moŜna zwiększyć wydłuŜając strefy przez zwęŜenie kapilary. Termodetektory wykrywają z powodzeniem ilości związków sięgające rzędu kilku µg w próbce. Innym rodzajem detekcji bezkontaktowej stosowanym w izotachoforezie, jest detekcja optyczna oparta na pomiarze absorpcji światła w poszczególnych strefach. Detektory optyczne wykazują duŜo lepszą zdolność wykrywania krótkich stref a takŜe mają zadawalające parametry dynamiczne. Detektory UV nie są uniwersalne, gdyŜ mogą być stosowane jedynie wtedy, dana substancja wykazuje absorpcję światła w zakresie UV. W izotachoforezie analitycznej, układ detekcyjny powinien wykrywać moŜliwie jak najkrótsze strefy rozdzielanych jonów, tzn. powinien posiadać wysoką czułość i zdolność rozdzielczą. Ponadto powinien wykrywać kolejne składniki na podstawie jakiejś uniwersalnej właściwości stref. Układ detekcyjny powinien być zdolny do rozróŜniania stref, nawet gdy zachodzi tylko nieznaczna róŜnica danej właściwości. Powinien równieŜ wytwarzać szybką i prawidłową odpowiedź zarówno co do jakości, jak i co do ilości poszczególnych jonów. Te warunki spełniają detektory kontaktowe. Dostępne obecnie detektory kontaktowe posiadają elektrody zanurzone wewnątrz kapilary i takŜe istnieją w dwu typach. Typ pierwszy mierzy przewodnictwo stref, drugi polega na bezpośrednim pomiarze gradientów elektrycznych w poszczególnych strefach. Za pomocą detektora konduktometrycznego moŜna wykryć 50 krotnie mniejszą ilość substancji w porównaniu z detektorem termometrycznym. RównieŜ rozpiętość stęŜeń składników w próbce moŜe być znacznie większa, a uzyskany izotachoforegram charakteryzuje się bardzo ostrymi i wyraźnymi stopniami. Rys. 4. Detektory stosowane w izotachoforezie. Inny typ detekcji kontaktowej wykorzystuje bezpośredni pomiar gradientu elektrycznego w strefach. Detekcja przeprowadzana jest bezpośrednio w kapilarze, poprzez pomiar spadku napięcia pomiędzy dwiema niskooporowymi elektrodami, które są umieszczone w niewielkiej od siebie odległości w kierunku, w którym zachodzi ruch stref. Dzięki temu, Ŝe mierzona wartość prądu jest bardzo mała eliminowana jest całkowicie polaryzacja i depolaryzacja elektrod. Parametry dynamiczne takiego detektora są zadawalające nawet przy szybkiej wysokonapięciowej analizie izotachoforetycznej. Rysunek 4 przedstawia schematy detektorów stosowanych w izotachoforezie. Dobór parametrów pracy W procesie analizy izotachoforetycznej jony moŜna rozdzielić wtedy, gdy efektywne ruchliwości kolejnych składników róŜnią się od siebie w wystarczający sposób. Efektywna ruchliwość jonów zaleŜy od stopnia dysocjacji i wartości pK, a dodatkowo od temperatury i wartości pH, jakie wytwarzają się w poszczególnych strefach podczas przebiegu procesu. Na efektywną ruchliwość jonów wpływają, choć w znacznie mniejszym stopniu takie czynniki jak solwatacja, efekt relaksacji, promień i ładunek jonów, stała dielektryczna oraz lepkość uŜytych rozpuszczalników. Rozdzielanie jonów moŜna przeprowadzić róŜnymi sposobami.: - na zasadzie róŜnic w absolutnych ruchliwościach jonowych, wartość pH układu dobiera się tak, aby wszystkie jony były całkowicie zdysocjowane. - wykorzystując róŜnice w wartościach pK składników, wartość pH układu dobiera się w taki sposób, aby większość jonów nie była całkowicie zdysocjowana, a tym samym powiększa się róŜnice w wartościach efektywnych ruchliwości jonów. - stosując zmianę rozpuszczalnika, zwykle z wody na metanol. Sposób ten bywa stosowany, jeŜeli rozdzielane jony posiadają prawie jednakowe ruchliwości jonowe i niewiele róŜniące się od siebie wartości pK - wykorzystując moŜliwość tworzenia przez rozdzielane jony związków kompleksowych z jonami elektrolitu wiodącego. Na właściwy przebieg separacji izotachoforetycznej decydujący wpływ ma wielkość pH, w układzie. Dobór odpowiedniego pH jest jednak rzeczą trudną. Wartość pH stref w duŜym stopniu zaleŜy od wartości pK jonów buforowych oraz jonów próbki. Przy rozdzielaniu silnych kwasów pH jest prawie równe pK1, jednak dla słabych kwasów następują duŜe przesunięcia spowodowane liczącymi się juŜ wartościami innych stałych dysocjacji. Kiedy pH strefy jest niŜsze od pH strefy poprzedzającej, efektywna ruchliwość jonów, które pozostaną w tyle, wzrośnie i z biegiem czasu strefy wydłuŜają się i powstają strefy mieszane. Wartość pH układu moŜe być tak dobrana, Ŝe jony w danej strefie będą posiadały ruchliwość wyŜszą niŜ ruchliwość efektywna jonu wiodącego. Trudno jest zachować warunki izotachoforetyczne przy niskich wartościach pH w przypadku rozdzielania kationów i wysokich, w przypadku rozdzielania anionów. Spowodowane jest to tym, Ŝe pH przy rozdziałach anionów wzrasta, podczas przebiegu procesu, a zmniejsza się przy rozdziałach kationów. Efekty te dotyczą głównie substancji słabo zdysocjowanych. Utrzymywanie stałego pH jest szczególnie waŜne przy separacji słabych kwasów i zasad. W procesie analizy po wprowadzeniu próbki oraz rozdzieleniu jonów otrzymuje się szereg stref, z których kaŜda powinna zawierać jeden rodzaj jonów. WyróŜnia się jednak dwa rodzaje granic rozdzielenia: granicę pomiędzy jonem wiodącym oraz strefą z jonami M+, w której występują dodatkowo jony H+ (próbka została wprowadzona do elektrolitu wiodącego) i drugi typ granicy między rozdzielanymi jonami M1+-M2+, M2+-M3+, itd. W tej sytuacji pierwszy, najruchliwszy kation próbki tworzy strefę mieszaną z jonami H+, które są w strefie elektrolitu wiodącego i kationu M+ - i warunek izotachoforezy przestaje obowiązywać. Prędkość tej strefy zmniejsza się, wysokość stopni równieŜ, a to z powodu obecności jonów H+. JeŜeli stęŜenie jonów H+ jest małe, to oczywiście efekt jest niewielki. MoŜliwe jest teŜ istnienie dwu stref mieszanych w pobliŜu siebie, obu składających się z kationów próbki oraz z jonów wodorowych. Wtedy decydujący wpływ na prawidłowe rozdzielanie izotachoforetyczne ma wartość pH poszczególnych stref. JeŜeli pH drugiego kationu jest niskie, jony wodorowe będą przechodziły do poprzedzających je stref i powstawać będą strefy mieszane. Generalnie, nie zaleca się pracy metodą izotachoforezy w układach elektrolitów niebuforowanych, gdyŜ konieczne jest wtedy regularne odnawianie roztworów elektrodowych, a oprócz tego istnieje ciągłe zagroŜenie występowania stref mieszanych. Układy stosowane w procesie rozdzielania kationów: Jon wiodący Przeciwjon pH Jon zatrzymujący 0,01 M HNO3 – 1,9 0,01 M TRIS 0,01 M HCl – 2,0 0,01 M LiCl 0,01 M k. sulfonowy HCl 2,4 0,01 M LiCl 0,002 M H6L – 2,4 0,004 kreatynina 0,02 KOH k. octowy 4,1 0,005 k. octowy 0,01 M KOH k. askorbinowy 4,1 0,01 M LiCl 0,01 M KOH k. fumarowy 4,3 0,01 M Li2SO4 0,005 – 0,01 M CH3COOK k. octowy 4,0 – 5,5 0,01 M TRIS lub β-alanina 0,005 – 0,01 M KOH k. kakodylowy 6,3 – 7,0 0,01 M kreatynina z dodatkiem 0,005 M HCl do pH 5 0,01 M KOH dijodotyrozyna 7,4 0,01 M TRIS 0,0075 H2SO4 – 8,0 0,005 BTP z dodatkiem 0,01 M k. kapronowego 0,01 KOH H3BO3 8,3 0,01 cytrynian litu 0,005 M Ba(OH)2 glutamina 9,25 0,02 M trietylenodiamina 0,005 M Ba(OH)2 0,015 M walina 9,9 0,02 M TRIS z dodatkiem HCl do pH 8,3 Układy stosowane w procesie rozdzielania anionów: Jon wiodący Przeciwjon pH Jon zatrzymujący 0,005 M HCl 0,001 M NaCl 2,25 0,005 M k. bursztynowy lub 0,01 M k. mrówkowy 0,007 M HCl gliceryno-glicyna 2,9 0,005 M k. kapronowy 0,01 HCl β- alanina 2,9 0,005 M propionian sodu 0,008 HCl 0,0035 M β- alanina 3,55 0,005 M k. cytrynowy 0,01 HCl 0,01 M β- alanina 3,6 0,003 M BTP + 0,05 % HPMC 0,005 – 0,01 M HCl β- alanina 3,0 – 4,2 0,01 M k. kapronowy 0,002 M HCl 4,25 0,002 M kwas winowy 4,5 – 4,7 0,01 M MES z dodatkiem TRIS do pH 7 0,01 M HCl 0,005 M EACA K. ε-aminokapronowy lub histydyna BTP 6,0 0,005 M k. kapronowy z dodatkiem TRIS do pH 8 0,01 M HCl histydyna 6,0 0,005 M MES + histydyna 0,01 M HCl 0,0056 M BTP 6,1 0,01 M HCl histydyna 5,7 – 7,0 0,005 M k. glutaminowy TRIS 7,2 0,01 M HCl imidazol 7,4 0,005 M MES lub 0,005 M k.kapronowy 0,01 M k. kakodylowy lub k. kapronowy lub k. fenylooctowy lub MES 0,005 M glicyna z dodatkiem TRIS do pH 8,5 i Ba(OH)2 do pH 9,2 0,005 k. askorbinowy 0,005 M gliceryno-glicyna TRIS 8,4 0,01 M glicyna, Ba(OH)2, pH 9 0,01 M HCl 0,01 M HCl TRIS 8,5 0,01 M EPPS z TRIS, pH 8,5 0,005 – 0,01 M HCl ammediol 8,4 – 9,6 0,005 – 0,010 M glicyna lub fenol lub β- alanina EACA – kwas ε-aminokapronowy BTP – bis-tris-propan TRIS – kwas N-tris(hydroksymetylo)-metylo-2-aminoetylosulfonowy MES – kwas 2-N(morpholino)-etylosulfonowy HPMC – hydroksypropylometyloceluloza EPPS – kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazyno-propanosulfonowy Analiza jakościowa i ilościowa Wynikiem analizy izotachoforetycznej jest wykres przedstawiający zmiany wartości sygnału detektora w czasie – izotachoforegram. Rysunek 5 przedstawia przykładowy izotachoforegram mieszaniny kationów uzyskany przy pomocy detektora konduktometrycznego. Aby dokonać analizy jakościowej nieznanej próbki na podstawie uzyskanego izotachoforegramu naleŜy zidentyfikować poszczególne strefy odpowiadające szukanym analitom. Na podstawie wysokości (h) stref w stosunku do linii podstawowej (RSH – relative step height, RSH = h/H) i przez porównanie z wzorcami analitów moŜliwe jest przeprowadzenie analizy jakościowej. W oparciu o długość (L) zidentyfikowanych stref i na podstawie wcześniej sporządzonych krzywych kalibracyjnych moŜemy dokonać analizy ilościowej badanych związków w próbce. Ogólnie mówiąc wartość sygnału detektora dla danej strefy (wysokość strefy – h) jest informacją jakościową, a długość strefy (L) jest informacją ilościową. Rys. 5. Przykładowy izotachoforegram mieszaniny kationów, uzyskany za pomocą detektora konduktometrycznego. Zalety izotachoforezy: moŜliwość jednoczesnego oznaczania wielu jonów (o tym samym znaku) jednoczesne oznaczanie jonów na róŜnych poziomach stęŜeń moŜliwość oznaczenia składników śladowych w złoŜonych matrycach dzięki zastosowaniu dwóch kolumn – preseparacyjnej i analitycznej, proste i szybkie przygotowanie próbek (z reguły wystarcza sączenie; w przypadku próbek takich jak woda pitna nie ma konieczności przygotowania) krótki czas analizy (od kilku do kilkunastu minut) ogólnie dostępne odczynniki stosunkowy niski koszt aparatury (strzykawki, ogólnie dostępny sprzęt laboratoryjny – kolby, zlewki, pipety, itp.; koszt samego urządzenia jest ok. 5 razy niŜszy niŜ chromatografu jonowego) moŜliwość stosowanie uniwersalnego detektora (konduktometrycznego) wysoka powtarzalność i dokładność wyników analizy niska granica wykrywalności i oznaczalności – standardowo poniŜej ppm, a przy zastosowaniu odpowiednich metod wzbogacania próbek (np. sorpcja metali cięŜkich zawartych w wodzie) rzędu ppb, podczas procesu separacji jonów z rozcieńczonych próbek dochodzi do ich wzbogacenia technika przyjazna środowisku – analizuje się głównie próbki wodne (dopuszczalny jest dodatek metanolu lub etanolu, np. w przypadku próbek alkoholi) Ograniczenia izotachoforezy: trudności przy doborze składu elektrolitów (np. dodatku antykonwekcyjnego, buforu) brak moŜliwości stosowania rozpuszczalników organicznych – ograniczenie zastosowania izotachoforezy np. do próbek olejów, tłuszczów itp. w przypadku oznaczania wybranych związków organicznych (np. aldehydów) konieczna jest derywatyzacja analitów konieczność stosowania roztworów wzorcowych moŜliwość oznaczania wyłącznie substancji jonowych Zastosowanie izotachoforezy w róŜnych dziedzinach Ŝycia ⇒ Przemysł spoŜywczy: 1. Soki i syropy owocowe: jednoczesne oznaczanie kwasu sorbowego i cytrynowego, oznaczanie kwasów: benzoesowego, askorbinowego i dehydroaskorbinowego, aniony nieorganiczne, np. PO43-, związki pierścieniowe i sacharyna, oznaczanie kationów K+, Na+, Ca2+ i Mg2+ w sokach pomarańczowych. 2. Wino: równocześnie oznaczanie kwasów (malonowego, winowego, bursztynowego, cytrynowego, mlekowego, octowego) oraz jonów siarczanowych. 3. Piwo: oznaczanie zawartości dodatków np. konserwantów, oznaczanie kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego. 4. Herbata i kawa: oznaczanie zawartości kwasów 5. Mleko i produkty mleczarskie: kontrola procesu fermentacji (oznaczanie zawartości kwasu mlekowego, octowego, masłowego), oznaczanie zawartość NO3-. 6. Cukier i melasa: badanie zawartości kwasów po procesie utleniania cukru, oznaczanie pozostałości kwasów (głównie lotnych kwasów tłuszczowych) w melasach. 7. Mięso, zupy, ryby, majonezy: oznaczanie EDTA w sałatkach, majonezach, margarynach, oznaczanie zawartości kwasu glutaminowego i innych dodatków (np. 5-monofosforanu guanozyny) w mięsach i zupach, zawartość histaminy w rybach i konserwach rybnych (informacja o czasie przechowywania). 8. Warzywa i owoce: oznaczanie zawartości kwasów, np.: szczawiowego, octowego, malonowego, cytrynowego, a takŜe jonów nieorganicznych takich jak: NO3-, oznaczanie zawartości kwasu fitowego w zboŜach i roślinach strączkowych, oznaczanie toksyn (np. αsolaniny) w ziemniakach. 9. Oznaczanie zawartości amin biogenicznych (histaminy, kadaweryny, putrescyny, tyraminy) w wybranych produktach spoŜywczych np. serach, rybach, kapuście, winach. ⇒ Rolnictwo: 1. Nawozy: jednoczesne oznaczenie zawartości SO42-, NO3- i PO43-, równoczesne oznaczenie róŜnych postaci fosforu np. P2O74-, PO43-. 2. Kiszonki: oznaczanie związków wpływających na jakość produktów – głównie kwas mlekowy, octowy, propionowy, masłowy. 3. Pasza: określanie czystości lizyny, oznaczanie zawartości substancji pomocniczych biofaktorów (B1, B6, lizyna oraz inne). 4. Mleko i inne produkty nabiałowe: związki jonotwórcze o zawartości powyŜej 1 ml/l, kontrola procesu fermentacji (oznaczanie kwasu mlekowego, octowego, masłowego, cytrynowego, fosforowego), kontrola poziomu NO3-. 5. Herbicydy anionowe i kationowe: oznaczanie ich zawartości w środkach ochrony roślin (testowanie czystości), kontrola ich stęŜenia w wodzach, glebach, mleku i ekstraktach z materiału roślinnego. 6. Materiał roślinny: jednoczesne oznaczenie zawartości SO42-, NO2-, NO3- i PO43-. 7. Materiał weterynaryjny: oznaczanie kwasu mlekowego, octowego, itp. w celu potwierdzenia prawidłowości działania metabolizmu, analiza związków jonotwórczych we krwi, moczu, wyciągu mięśniowym. ⇒ Medycyna: 1. Analiza kwasów i zasad organicznych oraz aminokwasów w moczu: kwas tioacetylooctowy po inhalacji chlorkiem winylu, kwas hipurowy i jego pochodne po inhalacji rozpuszczalnikami organicznymi, kwas szczawiowy. 2. Analiza kwasów i zasad organicznych oraz aminokwasów we krwi: kwas mrówkowy w przypadkach kwasicy, kwas sialowy jako niespecyficzny objaw choroby nowotworowej, a takŜe inne kwasy: ketoglutarowy, szczawiooctowy, hydroksymasłowy. 3. Oznaczanie zawartości metabolitów leków we krwi, moczu lub innych płynach ustrojowych przy stęŜeniach rzędu 1-10 ppm bez konieczności wstępnego przygotowania próbki. 4. Analiza kwasów i zasad organicznych oraz aminokwasów w płynach ustrojowych: GABA (kwas γ-aminomasłowy) w płynie mózgowo-rdzeniowym. ⇒ Analiza wód: 1. Oznaczanie anionów nieorganicznych w wodach powierzchniowych (Cl-, SO42-, NO3-, NO2-, F-, PO43-) 2. Analiza kwaśnych deszczy: równoczesne oznaczanie SO42- i NO3- w wodzie deszczowej. 3. Oznaczanie kationów metali alkalicznych i kationów metali ziem alkalicznych w próbkach wody (pitnej, mineralnej, deszczowej). 4. Oznaczanie metali cięŜkich w wodach: Mn2+, Cd2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Pb2+, Cu2+, Al3+ (stęŜenie tych metali w wodach jest zazwyczaj niskie – naleŜy je wydzielić przy uŜyciu sorbentów chelatujących). 5. Oznaczanie zawartości chromianów w wodzie: zastosowanie detekcji fotometrycznej pozwala osiągnąć wysoką selektywność. 6. Charakterystyka składników próchnicy: moŜliwość określania zawartości huminowych i fulwonowych w wodzie bez konieczności stosowania sorbentów. kwasów 7. Oznaczanie kwasów organicznych zawartych w wodzie w nagłych wypadkach, np. katastrofy ekologiczne (przeniknięcie substancji do zasobów wody pitnej). 8. Oznaczanie zawartości kwasów tłuszczowych, amin, fenoli i pestycydów. Zastosowanie izotachoforezy ze względu na rodzaj oznaczanych związków Analiza organiczna: Oznaczanie kwasów tłuszczowych i ich pochodnych Oznaczanie kwasów aromatycznych Oznaczanie fenoli i ich pochodnych Oznaczanie nitrofenoli Oznaczanie aldehydów Oznaczanie amionokwasów Oznaczanie kationów organicznych np. kation amonowy, triazynowy Oznaczanie herbicydów anionowych i kationowych Analiza nieorganiczna: Oznaczanie anionów: Cl-, NO2-, NO3-, SO42-, F-, PO43-, P2O74 Oznaczanie kationów: Fe3+, Al3+, K+, Na+, Li+, Ba2+, Sr2+, Rb+, Cs+, Mn2+, Cd2+, 2+ 2+ Co2+, Ni2+, Zn2+, Pb2+, Cu2+, Ca , Mg Aparatura 1. Zbiornik elektrolitu zatrzymującego (TE) 2. Blok nastrzykowy, A, B, C pozycje robocze pętli dozowniczej, w pozycji C moŜliwy jest nastrzyk mikrostrzykawką 3. Kolumna wstępnego rozdzielania (160 mm × 800 µm śr. wew.) 4. Detektor koduktometryczny 5. Blok rozgałęziający 6. Blok zatrzymujący 7. Membrana półprzepuszczalna 8. Zbiornik elektrolitu wiodącego (LE) 9. Kolumna analityczna (160 mm × 300 µm śr. wew.) 10. Detektor konduktometryczny 11. Detektor UV 12. Zbiornik elektrolitu wiodącego (LE) 13. Membrana półprzepuszczalna LE/CE – zasobniki z elektrolitem wiodącym dla kolumny wstępnego rozdzielania i analitycznej. Rys. 6. Schemat izotachoforegrafu model ItaChrom EA 101. Obsługa aparatu Przygotowanie aparatu do pracy: 1. Zmontować układ analityczny wg schematu na rys. 6 2. Podłączyć przewody wysokiego napięcia 3. Podłączyć detektory konduktometryczne 4. Połączyć światłowodami detektor spektrofotometryczny z celką pomiarową 5. Sprawdzić poprawność połączeń 6. Przepłukać układ wodą dejonizowaną 7. Ustawić zawór nastrzykowy w pozycję A 8. Napełnić elektrolitem wiodącym zbiornik CE 2 i kolumnę analityczną 9. Napełnić elektrolitem wiodącym zbiornik CE 1, blok buforujący i kolumnę wstępnego rozdzielania 10. Napełnić zbiornik elektrolitu zatrzymującego 11. Usunąć z układu pęcherzyki powietrza 12. Włączyć aparat 13. Uruchomić program komputerowy sterujący aparatem 14. Wprowadzić odpowiednią metodę analityczną. Po wykonaniu wyŜej wymienionych czynności aparat jest gotowy do pracy Przeprowadzanie analiz: 1. Sprawdzić poprawność przygotowania aparatu do pracy 2. Analizowaną próbkę umieścić w strzykawce 3. Wsunąć strzykawkę do dozownika, gdy zawór dozujący znajduję się w pozycji A 4. Przekręcić zawór w pozycję C 5. Zamknąć przezroczystą pokrywę aparatu 6. Uruchomić analizę w programie komputerowym 7. Do zakończenia analizy nie otwierać drzwiczek aparatu 8. Po zakończeniu analizy przekręcić zawór dozujący w pozycję B na 1s i dalej w pozycję A 9. Przepłukać i napełnić kolumny elektrolitem wiodącym zaczynając od kolumny analitycznej (dolnej) Aparat jest gotowy do kolejnej analizy. Ćwiczenia Izotachoforetyczne oznaczanie anionów w wodach pitnych i powierzchniowych Opis wykonania ćwiczenia: 1. Zapoznać się z budową i zasadą działania aparatu do izotachoforezy 2. Przygotować aparat do analizy uwzględniając uwagi prowadzącego zajęcia 3. Wykonać pomiary dla roztworów wzorcowych poszczególnych anionów 4. Zanalizować uzyskane izotachoforegramy pod kątem jakościowym 5. Przygotować roztwory kalibracyjne 6. Wykonać pomiary dla roztworów kalibracyjnych 7. Zanalizować uzyskane izotachoforegramy pod kątem ilościowym i jakościowym. 8. Sporządzić krzywe wzorcowe 9. Wykonać analizę próbek rzeczywistych 10. Określić zawartość poszczególnych jonów w próbkach rzeczywistych, wyciągnąć wnioski z uzyskanych izotachoforegramów 11. Sporządzić raport z wykonania ćwiczenia Nie obsługiwać aparatu bez zgody i nadzoru prowadzącego zajęcia. Wpływ warunków prowadzenia izotachoforezy na proces rozdzielania jonów Opis wykonania ćwiczenia: 1. Zapoznać się z budową i zasadą działania aparatu do izotachoforezy 2. Przygotować aparat do analizy uwzględniając uwagi prowadzącego zajęcia 3. Wykonać analizę roztworu wzorcowego stosując trzy róŜne natęŜenia prądu 4. Wykonać analizę roztworu wzorcowego stosując kolumnę innej długości 5. Wykonać analizę roztworu wzorcowego stosując elektrolit wiodący w trzech róŜnych stęŜeniach 6. Porównać uzyskane izotachoforegramy i wyciągnąć wnioski 7. Sporządzić raport z wykonania ćwiczenia Literatura 1. S.-G. Hjalmarsson, A. Baldesten, A critical review of capillary isotachophoresis, Anal. Chem., July 1981, 261 352 2. I. Miedziak, A. Waksmundzki, Izotachoforeza, aparatura, zasada pomiaru i zastosowanie, Wiad. Chem., 2 (368) 1978, 71-92. 3. STN 75 747430, Kvalita vody. Izotachoforeticke stanovenie chloridov, dusicanov, siranov, dusitanov, fluoridov a fosforecanov vo vodach 4. STN 75 7431, Kvalita vody. Izotachoforetickie stanovenie amoniaku, sodika, draslika, vaonika a horicika vo vodach 5. Noty aplikacyjne Villa Labeco 6. M. Hutta, D. Kaniansky, E. Śimunićova, V. Zelenska, V. Madajova, A. Śiśkova, Solid phase extraction for sample preparation i trace analysis of ionogenic compounds by capillary isotachophoresis, J. Radioanal. and Nuclear Chemistry, 163 (1992) 1, 87-98 7. F. M. Everaerts, J. l. Beckers, T. P. E. M. Verheggen, Isotahophoresis. Theory, Instrumentation and Applications, J. Chrom. Library, Vol.6, 1976 8. P. Boćek, M. Deml, P. Gebauer, V. Dolnik, Analytical Isotachophoresis, VCH 1988 9. P. Blatný, F. Kvasnička, Application of capillary isotachophoresis and capillary zone electrophoresis to the determination of inorganic ions in food and feed samples, J. Chrom., 834 (1999) 419-431 10. F. Kvasnička, Application of isotachophoresis in food analysis, Electrophor., 21, (2000), 2780-2787 11. Strona internetowa: http://www.labsoft.com.pl/
